1、氧化石墨烯的非共价光敏剂及其体外抗癌活性作者：Lin Zhou,a Wei Wang,a Jing Tang,a Jia-Hong Zhou,*a Hui-Jun Jiang,*b andJian Shena摘要：氧化石墨烯（GO）由于其特殊性质和生物兼容性被作为一个潜在的药物递送系统研究。到目前为止，小部分的氧化石墨烯已经被作为感光药物输送系统用来探讨其体外抗癌活性在光动疗法中的应用。在这里，一个新的氧化石墨烯-竹红菌甲素（GOHA）复合物是通过简单的共价键合的方法制备的，并对其光学活性进行了初步研究。结果表明，一个GOHA 的有效负载量高达1.0mgmg-1，并且在水溶液中的游离竹红菌甲素
2、有卓越的稳定性。此外，GO-HA 可以通过适当的激发波长照射产生单态氧，体外实验说明，GO-HA对肿瘤细胞采取后是有效地，经过光照射后的浸渍细胞会显著死亡。因此，GO-HA的这种特性使它可能在临床光动力疗法方面特别有前途。关键词：抗肿瘤药物；药物递送；石墨；光动力治疗；光敏剂引言：光动力疗法（PDT）一种非侵入式的治疗包括癌症等一系列疾病的治疗方式，自上世纪二十年代开始被研究。1 PDT是基于照射光敏剂（PSS ）与适当波长的可见光或近红外光产生的活性氧物种（ROS） ，如单氧（1O 2）或自由基，氧化各种细胞室包括血浆，线粒体，溶酶体和核膜，最终导致不可逆的肿瘤细胞损伤这一概念。2尽管光动力
3、疗法用于肿瘤治疗的有用性在不断升值，但由于许多常用的照射光敏剂有疏水性，光动力疗法临床应用受到了限制。3因此，对于这类药物的递送，需制成特别的能在水中分散的制剂，例如基于包括胶束、脂质体、金属、黄金、磷酸钙和陶瓷4的运载工具包括的生物相容性纳米颗粒的使用。系统管理表明，上述大多数药物载体载药后由于其“增强的渗透和滞留效应”而优先被肿瘤组织摄取。作为一个潜在的载药体系，氧化石墨烯（GO）由于其良好的生物相容性和很好的分散在水溶液中的稳定性，GO获得了越来越多的关注。5氧化石墨烯的功能表显示，其有较大的比表面积，可装载药物，例如阿霉素和SN38，通过氢键共价结合的方法效率高，它提供了一个以活性形式
4、运输药品的替代方法。6-8 然而，这里没有使用PS这种载体递送药物和这样一个系统在光动力学治疗领域的应用的报告。在此，我们报告一个GO和竹红菌甲素（HA）官能团复合合成的一个非卟啉光动力抗癌药物，它是血卟啉的衍生物。它有很多优点，如化学成分单一、明确，易纯化，在黑暗中毒性低，高ROS发电能力。 9GO由sp2和sp3杂化的碳原子组成，包括羧基、羟基和环氧化物等官能团。8,10GO的大共轭结构可以导致P-P 和HA醌部分的堆积作用以及影响它们之间的疏水性。此外，HA的羟基和羰基化合物可以和石墨烯骨架上的羧基、羟基和环氧基团形成一个或多个强的相互作用的氢键（见图表1） 。结果表明，装载上去的HA
5、的量明显增高，GO-HA 复合物可以有效地产生单态氧。HeLa细胞体外试验结果表明， GO-HA的细胞摄取效率高，GOHA的光毒性被认为是依赖于药物的剂量和光照时间。Scheme 1. Schematic representation of the preparation of the hybrid of hypocrellin A (HA) and functionalized graphene oxide (GO).图1结果与结论：氧化石墨烯的透射电子显微镜（TEM）图：药物载体 GO 的 TEM 图像如图 1 所示。氧化石墨烯片能以平均 200-400nm 的粒径很好地分散在水溶液中。F
6、igure 1. TEM image of GO-HA. Scale bar: 2 mm.GO-HA复合物的监控合成：大多数种类的分子间的相互作用,包括氢键及较弱的群体如C-H键或者那些有一个电子云、-键、间的范德华力相互作用，和其他类型的静电吸引或排斥作用，导致红外光谱明显变化。11 HA、GO和GO-HA 冷冻干燥所得的固体试样的红外光谱如图2所示。GO的光谱显示其存在OH (3420cm-1), C=O (1732cm-1), C=C (1638cm-1), 和 C-O-C(1081cm-1)等官能团， 6,8,12但是HA复合物中吸收峰的位置都发生了移动。首先，GO-HA复合物形成后，
7、GO的C=O (1732cm-1)和HA 的C=O (1701cm-1)处的峰值都相应的向低场的位置移动到了1693cm-1处。第一，形成GO-HA复合物后， 1732cm-1处的峰值对应的是氧化石墨烯的 (C=O)光谱并且HA在1701cm-1处的峰值转移到了1693cm-1这个比较低场的位置。第二，形成GO-HA复合物后3420cm-1 处的峰值对应的是 GO的（OH）的光谱，并且HA中OH的峰值从3484cm-1移动到了3445cm-1。第三，在混合物中，光谱中1081cm-1 处的峰值对应的是GO的 （C OC） ，并且HA的COC在1072cm-1处的峰值移动到了 1065cm-1。
8、这些变化表明HA是负载在GO 上的，并且这些变化了的特征峰可能是由于这两种组分间的氢键结合。除了傅里叶变换红外光谱分析,我们比较了固体样品的X 光衍射（XRD）图谱（见图3） 。结果表明，HA样品在3至40 之间有强烈的结晶，这证明了HA 的高度结晶性。然而，在GO样品中只有一个广泛而分散的最大峰值，这表明GO是无定型的。 GO-HA的XRD图谱是介于HA 和GO之间的，并且似乎有同时拥有定型和不定型特征的构想。然而，所有剩余的特征峰的位置都发生了变化，这表明HA是负载到GO上的，这种杂化影响了他们的晶格特点；这也可能是由于这两组分之间的氢键结合。Figure 3. XRD patterns
9、of HA, GO, and GO-HA.图3.HA、GO和GO-HA 的XRD图谱Figure 4. Cyclic voltammograms of HA, GO, and GO-HA.图4.HA、GO和GO-HA的循环伏安曲线电化学分析是一种非常灵敏的说明分子的氧化-还原性质及其环境的影响的方法。GO,HA和GO-HA 在磷酸盐缓冲盐水（PBS，0.1 molL-1, pH 7.4）溶液中的的电化学性能用循环伏安法验证过。图4表明，HA有-0.48和-0.59V两个可逆的氧化还原过程分别与与SCE中-1到0的电位范围相对。然而，GO-HA在这个范围内没有明显的电化学信号（图4，插图）。 1
10、4对于GO-HA，这两个氧化还原的半波电位也能被发现，只不过各自移动到了与SCE中-0.52和-0.57V对应的位置。以上结果证明HA成功地修改了GO 的表面，并且由于GO 的电导性事HA的可逆的氧化-还原性能提高了。HA装载数量：FTIR和XRD谱图证实了HA被成功的负载到了GO 上，GO 的负载量通过紫外/可见光谱进行了研究。图5显示了不同浓度的GO时，HA和GO复合物的紫外/可见光谱。它可以观测到HA （HA=0.017 mgmL-1）的三个特征吸收峰位于 476、546和590nm。HA中加入GO提高了HA的吸收强度但当GO的浓度从0.0085增加到0.017mgmL -1过程中HA吸
11、收峰的位置不变。当GO的浓度不断增加时，HA的吸收强度仍在增加但吸收峰的位置逐渐发生蓝移。GO的紫外/可见吸收谱图显示，随着GO浓度的增加，在350 700nm 范围内没有明显的吸收峰。以上结果表明HA和GO之间有两种相互作用，并且负载量的边界是1mgmg -1。当负载量小于或等于1mgmg -1时，GO表面可以有效的吸附HA，但是当负载量高于1mgmg -1时，多余的HA分子可能积聚在溶液中，但不吸附在GO上。为了验证这假设，对它们的荧光性质进行了研究。Figure 5. Changes of the UV/Vis absorption spectra of a 0.017 mgmL-1HA
12、 solution with 0) 0, 1) 0.0085, 2) 0.017, 3) 0.0255, 4) 0.034, 5) 0.0425,6) 0.051, and 7) 0.0595 mgmL-1 GO.图5.HA(0.017mgmL-1)和0) 0, 1) 0.0085, 2) 0.017, 3) 0.0255, 4) 0.034, 5) 0.0425,6) 0.051, 7) 0.0595 mgmL-1 GO的紫外/ 可见吸收光谱的变化HA 在水溶液中的荧光强度弱，因为非极性 HA 分散在水中，极性溶剂，可以导致药物溶剂双方相互作用，促进药物非辐射衰减或来自非极性药物自聚集的浓度
13、猝灭源，导致 HA 荧光猝灭。 15 然而，GO 在在这个系统中扮演了两个角色。首先， HA 被 GO 表面吸附可以避免荧光猝灭，由于 HA-水互动促进 HA 分子非辐射衰变，或来自非极性药物自聚集的浓度猝灭源。其次，GO 通过能源传递或电子转移压制了 HA 的荧光。 16 HA 和 GO的相互作用方式由480nm 处激发不同浓度的 GO 的荧光发射光谱学所决定。如图六所示，HA 在609nm 处有一个特征吸收峰。 这一特征峰蓝移到 606 nm，并且荧光强度有所增加，因为在这一阶段药物分子可以设想为离散分布在 GO 的表面上（图表 1） ，因此，HA 水相互作用促进非辐射衰减的部分保护和 H
14、A 分子的自聚集诱导荧光猝灭，结果导致荧光性局部增加。GO 的连续加入导致的荧光强度急剧可逆的下降，在这里，多余的 GO 通过能量转移或电子转移抑制 HA 荧光。因此，HA 在 GO 表年上最佳的负载量是1mgmg -1并且我们用这个进一步实验。Figure 6. Changes of the fluorescence spectra of a 0.017 mgmL-1 HA solution with 0) 0 , 1) 0.017, 2) 0.034, 3) 0.051, 4) 0.068, 5) 0.085, and6) 0.102 mgmL-1 GO.图 6.HA(0.017mgmL-
15、1)和0) 0, 1) 0.017, 2) 0.034, 3) 0.051, 4) 0.068, 5) 0.085,6) 0.102mgmL-1 GO的荧光光谱的变化单态氧的产生：众所周知，对于单态氧（1O2 ）的参与，一个强大的氧化剂，在病毒和细胞灭活和光动力疗法中治疗癌症有很强的证据。17所以 GO-HA 生成 1O2 能力是说明其在光动力学疗法中应用潜能的重要指标。新鲜同等浓度的 GO-HA 或游离的 HA 溶液在9,10-蒽二氨基酸二钠盐（ADPA） 。蒽的紫外/ 可见吸收强度显示 320 以上的 GO 和游离 HA的都是连续大幅减少（图 7，插图）这说明他们有能力产生单生态氧。根据
16、Kopelan 和同事们的专门方程式的报道。18在 ADPA 中 GO-HA 和游离 HA 分别地精准的反应速率常数是 1.110-3（相关系数 R=0.999）和 1.4710-3s-1(R=0.999)， （图 7） 。减少 GO-HA 中 1O2 产生是可能的，由于在 HA 表面上锚定后 GO 对于单生态氧的猝灭效应，因此，HA 不能自由与 O2 分子的相互作用，被均匀地分布在水溶液中，以产生1O2。19Figure 7. Photosensitized ADPA bleaching of GO-HA and HA by measuring the absorbance decrease
17、 at 378 nm as a function of irradiation time. Inset: Absorption spectra of ADPA in the GO-HA system irradiated for 0, 80, 160, 240, and 320 s.图7.GO-HA光敏ADPA褪色和HA通过测量吸光度下降在378 nm辐照时间的函数。插图:吸收光谱的ADPA GO-HA系统辐照0,80,160,240,和320秒。GO-HA和HA的稳定性：以上结果提示单线态氧的生成效率，新鲜游离的HA比GO-HA高一点。不过，在HA溶液放置3天，其的样品产生单线态氧的能力只保
18、留的新鲜HA的三分之一，因为游离HA不能稳定地分散在水溶液中，即使在加入助溶剂如DMSO或DMF。 20当放置三天后HA和GO-HA水溶液的吸收光谱水溶液显示出明显的不同。GO的特征吸收带无明显地变化，但是HA水溶液的特征吸收带的强度急剧下降（图8） 。因此，在比较吸收谱图中的变化，可以确定GO-HA在游离HA水溶液中具有优越的稳定性。稳定性在静脉注射药物水溶液中是非常重要的指数，因为一个良好分散的药物在血液传递过程中不会造成问题如沉淀，聚集，和絮凝。 21Figure 8. Variation tendency of absorption peak value of aqueous solu
19、tions of free HA and GO-HA left to stand for 3 days.图8.保存3天后游离HA和GO-HA水溶液的吸收峰值的变化趋势 GO-HA在细胞内的吸收和分布的微观分析：HeLa细胞的体外试验结果表明， GO-HA和HA的细胞摄取效率高。此外，在荧光显微图研究中GO-HA和游离HA 在HeLa细胞中的荧光性相似。图9 显示HeLa 细胞的荧光显微照片，用GO-HA和罗丹明123双重染色，线粒体特异性荧光探针。GO-HA（图9a）和罗丹明123（图9b)叠的图像（图9C)表示，GO-HA定位在同一亚细胞区域的线粒体标记，从而表明其对线粒体的亲和力， 22和
20、游离HA的相同。 23Figure 9. Comparative localization of GO-HA or HA with Rhodamine 123 (mitochondrial probe) in HeLa cells after coincubation (for details, see the text). Scale bar: 100 mm.图9.在 HeLa 细胞中 GO-HA 或 HA 与罗丹明123比较定位（线粒体探针） （详情，见正文） 。比例尺：100毫米关于 GO-HA 线粒体定位的进一步的证据是摄取 GO-HA 和光照射后线粒体膜电位的变化（ m） 。罗丹明
21、123 是广泛应用于体外和原位动态测量线粒体膜电位，因为 m 和游离的罗丹明 123 是相符的、 m 的变化都是与细胞凋亡相符的。暴露于光 2.5 分钟后， m上有一种药物的剂量依赖性增加（图 10） ，这表明线粒体超极化。相同的结果在 HA 和照射处理的细胞中也检测到，但在 GO-HA 中的超极化程度更为明显。上述结果进一步表明，GO-HA 没有有效由肿瘤细胞地采取。Figure 10. Effect of GO-HA and HA on mitochondrial membrane potential. (*p0.001 versus Control ; Control : cells w
22、ere exposed to light without GO-HA or HA). OD=optical density.图10 Figure 11. TEM images of HeLa cells. A) Normal cells; B) cells treated with HA for 12 h in the dark; C) cells treated with GO-HA for 12 h in the dark; D) drug-free cells treated with irradiation; E) cells treated with HA and 15 min of
23、 irradiation; F) cells treated with GO-HA and 15 min of irradiation. Scale bar: 100 mm.图11参考文献：1 a) D. Dolmans, D. Fukumura, R. K. Jain, Lancet Oncol. 2004, 5,497 508; b) Z. H. Zeng, J. H. Zhou, Y. Zhang, R. Qiao, S. Q. Xia,J. R. Chen, X. S. Wang, B. W. Zhang, J. Phys. Chem. B 2007, 111,2688 2696; c
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