1、中北大学课程设计说明书 第 0 页 共 22 页 0 发酵工程 课程设计说明书 年产 300 吨头孢菌素 C 的发酵工艺设计 学生姓名： 学号： 学 院： 专 业： 指导教师： 2013 年 12 月 中北大学课程设计说明书 第 1 页 共 22 页 1 目录 引言 .4 1 菌种的选育 .6 1.1 菌种的选育及制 备 .6 1.1.1 实验材料 .6 1.1.2 培养基的配置 .6 1.1.3 菌种选育方法 .6 1.1.3.1 自然选育 .6 1.1.3.2 头孢菌素 C 抗性平皿的制备 .7 1.1.3.3 紫外线诱变 .7 1.2 菌种的保藏 .8 2 培养基的配制 .8 2.1 培
2、养基的营养要求 .8 2.1.1 水 .9 2.1.2 碳源 .9 2.1.3 氮源 .9 2.1.4 无机盐类及微量元素 .9 2.1.5 生长因子和产酶促进剂 .9 2.2 培养基的种类 .9 2.2.1 孢子培养基 .10 2.2.2 种子培养基 .10 2.2.3 发酵培养基 .10 中北大学课程设计说明书 第 2 页 共 22 页 2 2.3 培养基 的灭菌 .10 2.3.1 灭菌方法 .11 2.3.2 培养基的湿热灭菌 .11 2.4 空气灭 菌 .11 2.4.1 过滤除菌流程及设备 .11 2.4.2 无菌空气的检查 .13 2.5 发酵罐的灭菌 .13 3 种子扩大培养
3、.13 3.1 种子制备 .13 3.2 发酵罐培养 .13 4 发酵罐的设计 .14 4.1 发酵罐的结构 .14 4.2 发酵罐的工艺尺寸 .14 4.3 封头壁厚 .16 4.3 物料衡算 .16 5 发酵过程的工艺控制 .17 5.1 发酵过程的补料策略 .17 5.2 发酵过程 pH 值的控制 .17 5.3 发酵过程温度的控制 .18 5.4 溶氧的控制 .18 5.5 染菌的控制 .18 6 下游加工 .18 中北大学课程设计说明书 第 3 页 共 22 页 3 6.1 发酵液的过滤和预处理 .19 6.2 提取 .19 7 总结和讨论 .19 8 头孢菌素发酵 工艺总流程图 .
4、19 9 参 考资料 .20 中北大学课程设计说明书 第 4 页 共 22 页 4 引言 头孢菌素 C（ Cephalosporin C）属 -内酰胺类抗生素，是国际上抗生素类药物之一，在抗生素药物中所占比例也逐年上升。头孢菌素 C为两性化合物，分子中有两个羧基和一个氨基，其 PK值为等于 2.6（侧链羧基） 3.1(核羧基 )， 9.8（侧链 NH4+基）。在甲基吡啶 -醋酸盐 缓冲液（ pH7）和吡啶 -醋酸盐（ pH4.5）缓冲液中，电泳趋向于正极，表明头孢菌素 C在中性和偏酸性下呈现酸性，能与碱金属结合成盐类。 头孢菌素 C 钠盐含有两个结晶水，为白色或淡黄色结晶性粉末，易溶于水， 不
5、溶于有机溶剂。对稀酸以及重金属离子均稳定，当 pH 大于 11 时迅速失活。同时失去在 260nm 下的吸收峰，紫外光照射也可失活。对葡萄球菌产生的青霉素酶稳定，但易被某些革兰氏阴性菌产生的头孢菌素酶水解。 头孢菌素 C 对茚三酮、双缩脲反应呈阳性，对亚硝基铁氰化钠反应呈阴性，紫外最大吸收为 260nm。 头孢菌素 C 中最富有反应性的基团是 3-乙酰氧基。温和条件下用酸水解头孢 菌素 C 可得到少量除去侧链的母核 7-氨基头孢烷酸简称 7-ACA。经酸水解或乙酰酯酶处理头孢菌素 C，则生成去乙酰头孢菌素，简称 DCPC。其为头孢菌素 C 发酵液中的主要副产物，理化性质与头孢菌素 C 及其相似
6、。其 PK 值等于 2.5、 3.0、9.7。紫外最大吸收波长为 261nm；红外光谱与头孢菌素 C 相似。 头孢菌素 C 及其它头孢菌素在弱碱性条件下发生水解、胺解等反应，或在酶催化水解时不能生 成类似于青霉噻唑基那样稳定的头孢噻唑基，因为反应不仅打开 -内酰胺环，而且还进一步使二氢噻嗪环也破裂，最终形成以侧链为主的派那地酸或派那地酸结构的衍生物。 头孢菌素 C 抗菌活性及临床应用 ，头孢菌素类抗生素自 1970 年以来是国外发展最迅速，上市品种最多的一类抗生素，是包括头孢烯、氧头孢烯、碳头孢烯和 7 -甲氧基头孢烯在内的一类药物。它们的作用机制是抑制细菌细胞壁的合成，而人类和其他哺乳动物的
7、细胞无细胞壁，因此对人应是无害的。临床应用证明它是一类抗菌谱广、抗菌活性强、疗效高、毒性低的抗生 素，为人类战胜各种细菌感染作出极大的贡献。 中北大学课程设计说明书 第 5 页 共 22 页 5 国内从 1980 年开始至今进行了两轮较大规模的开发研究，引进消化提高，至此已达到一定水准。主要由于其抗菌谱广，杀菌力强，对 -内酰胺酶稳定性高，毒副反应低，临床疗效好。同时具有较高商业利润。故国外众多制药公司、研究部门相继投入巨资，从事开发和生产，取得了许多令人瞩目的成果。而我国 20世纪末头孢菌素工业才有长足发展。对头孢菌素的广泛而深入的研究，改造后的衍生化合物作为化疗剂有的已突破了抗细菌感染的范
8、围，具有蛋白酶抑制剂的功效，可用于抗退化、治疗癌症、骨 质疏松、类风湿关节炎、阿尔茨海默病、白内障等。这很可能为头孢菌素带来新的前景。 头孢菌素的发展速度、临床使用率和销售利润大大超过半合成青霉素，从而引起国内外制药行业高度重视。自发现头孢菌素 C以来，将近半个多世纪实验研究，使生产工艺不断完善，头孢菌素 C发酵单位目前已突破 40000u ml 以上（均按 CPC游离酸计算，以 HPLC 测定）。发酵罐规模均在 100m3 以上。同时也筛选出不加蛋氨酸的头孢菌素 C 菌种，并摸索出最佳发酵温度、培养 pH 及搅拌转速，以最大限度减少 DCPC（脱乙酰头孢菌素）含量。因为过多 DCPC 不仅会
9、影响 CPC的提取收率与质量，而且也给以后 CPC的化学裂解收率或酶法裂解收率及 7 ACA纯度带来不良影响。提取方法大都采用大孔吸附剂 -离子吸附树脂 -锌盐沉淀工艺路线所取代。一般提取总收率（自发酵液计算）约 75左右。目前多采用超滤工艺，进一步提高了滤液质量，从而把提取总收率提高到 78 80左右。目前国内所有生产 7 ACA 厂家都已采用此项工艺路线，收率高，对后工序有利。 目前化学裂解法对环境污染大，残污液处理费用较昂贵。自 1970 年以来，英国、日本、荷兰等国相继研发酶法产生 7 ACA、 7 ADCA 工艺。国内随着对环保重视程度的提高，近几年部分药厂已实施了酶法 7 ACA
10、的规模化生产。 虽然头孢菌素的前景广阔，但是由于国内外抗生素企业头孢原料药项目的竞相上马，头孢产品已经出现过热现象。目前国际上有意大利、韩国、日本等头孢原料厂商，国内有石家庄制药集团、福州抗生素厂、哈尔滨制药集团、山东抗生素厂、山西威奇达、齐鲁药业等厂家，近几年头孢菌素原料药已经出现像青霉素一样的世界大战，提高技术指标、降低成本成为各个企业的唯一出路。 目前，头孢菌素 C 的发酵大致划分为两种类型：一种是低菌浓、 短周期、低单位、高质量发酵液、高收率的发酵类型；二是高菌浓、长周期、高单位、收率相对略低的发酵类型。目前国内厂家多采用前一种发酵类型，中北大学课程设计说明书 第 6 页 共 22 页
11、 6 周期 120-140h，放罐菌浓 45-52%；而国外大多数厂家，如韩国、意大利等多采用后一种发酵类型，周期 160-170h，放罐菌浓 60-65%。 1 菌种的选育 1.1 菌种的选育及制 备 1.1.1 实验材料 菌株： Cephalosporium acremonium HB-2，石药集团河北中润制药提供。 试剂：培养基用试剂为市售分析纯及生化试剂。蛋氨酸、蛋白胨， 上海生化试剂厂。无机盐： MgSO4 7H2O ， FeSO4 7H2O ， ZnSO4 7H2O ， MnSO4 H2O ， CuSO4 7H2O，（ NH4） 2SO4， KH2PO4，北京奥博星生物技术有限公司
12、。 仪器设备：安捷仑 HPLC 1100s 高效液相色谱仪；雷兹 LDZ5 2 离心机，北京医用离心机厂；麦克奥迪 B5 professional series 显微镜； SPY-50 双层摇床，上海离心机械研究所； NDJ 1 旋转式黏度计，上海精密科学仪器有限公司。 1.1.2 培养基的配置 深冷 管保护液（ ml/2ml）：甘油 1.0，脱脂乳 1.0。 斜面、分离培养基（ g/L）：麦芽糖 60，酵母粉 20，蛋白胨 10，琼脂 20， 自来水配制， pH7.0 7.2。 种子培养基（ g/L）：葡萄糖 5，蔗糖 6，玉米浆 20，谷朊粉 15，硫酸铵 10，D/L 蛋氨酸 5， Ca
13、CO3 5，自来水配制， pH6.2 6.4。 发酵培养基（ g/L）：葡萄糖 10，淀粉 30，糊精 60，玉米浆 50，谷朊粉 12， -淀粉酶 0.2， MgSO4 7H2O1.0， FeSO4 7H2O 0.2， ZnSO4 7H2O 0.01 MnSO4 H2O 0.01， CuSO4 7H2O0.02，（ NH4） 2SO410， KH2PO4 5，蛋氨酸 6，轻质 CaCO35，豆油 50，自来水配制， pH6.0 6.2。 1.1.3 菌种选育方法 1.1.3.1 自然选育 单菌落分离：将出发菌株采用 10 倍稀释法稀释，取 10-4 10-6 倍涂平皿，每皿滴加 2 5 滴，
14、用三角耙把菌液涂匀。单菌落于 28培养 14 18 天，第中北大学课程设计说明书 第 7 页 共 22 页 7 三天倒置培养。每天观察生长情况，待菌落生长饱满，即可传斜面。 斜面种子制备：取无菌 小试管数只放在试管架上，各加 1ml 菌水。用竹铲铲下选好的单菌落，分别放入小试管，搅匀。用吸管吸取菌液接入试管斜面，涂布均匀。每个单菌落对应一个斜面，标明相应编号，斜面放 28培养间培养，定期观察。长好的试管斜面加入等体积的保护液制作深冷管保藏，备用。 生产能力验证：取试管斜面，加无菌水 5-10ml，吸取 0.5ml 菌液接种 250ml种子摇瓶（内装 25ml 种子培养基）。种子摇瓶于 28、
15、180r/min 摇床培养 96h。 吸取 4.0ml 种子液接种 500ml 发酵摇瓶（内装 50ml 发酵培养基）。发酵摇瓶于 28、 200r/min 摇床培养 48h 后移至 25恒温室， 200r/min 摇床培养至放瓶。放瓶检测 pH、 PCV、滤速、头孢菌素 C 效价、杂质含量。 选取放瓶效价较高的菌株，经过中试发酵设备一、二级种子罐扩大培养后接种发酵罐，确定菌株生产能力。一级种子在通气比 1： 0.8、温度 28条件下培养 96 小时后移种至二级种子罐，接种量 11%。二级种子罐在相同条件下培养 40 小时移种至发酵罐，接种量 15%。发酵罐 050 小时 28、通气比 1：
16、1.2， 51144小时 25、通气比 1： 1.5。发酵过程中补油、硫铵、氨水，并保证溶氧不小于 20%、氨氮不低于 0.5g/ml。 1.1.3.2 头孢菌素 C 抗性平皿的制备 将灭菌后的固体分离培养基放凉至 50左右，加入头孢菌素 C 溶液，使最终头孢菌素 C 的浓度为 5g L-1，混匀后吸取 10ml 加入到无菌平皿中，平皿呈 15o角摆放，自然冷却待凝固后，将平皿放平。另取一瓶灭菌后并放凉至 50左右的固体分离培养基，取出 10ml 加入上述已凝固的平皿中，水平摆放，自然冷却备用。 1.1.3.3 紫外线诱变 菌悬液的 制备：选择培养好的斜面，加入 10ml 无菌水，用吸管将孢子
17、轻轻刮下后吸出，用研磨器将菌悬液研磨，得到单细胞菌悬液。用血球计数板计算孢子数在 20-30 亿个 ml-1。 菌悬液的预培养：取 10ml 研磨后的菌悬液接入装量为 25ml 的液态斜面培养基中预培养 2h。 紫外诱变：将预培养的单细胞菌悬液加入平皿中，每皿 1ml，用磁力搅拌器缓中北大学课程设计说明书 第 8 页 共 22 页 8 慢搅拌菌悬液，在红外光下操作，用 30W 紫外灯管，距离 25cm，照射 30sec 5min。在照射受试菌前，灯管须预热 20min。照射后平皿用黑布包严，防止发生可见 光的修复作用。 培养：用吸管吸取诱变后的孢子悬液，稀释 10-1 10-3 倍涂布头孢菌素
18、 C 性平皿，用三角耙把菌液涂匀。单菌落于 28培养 14 18 天，第二天倒置培养。 筛选： 每天观察生长情况，待菌落生长饱满，挑选高头孢菌素 C浓度区的单菌落即可传斜面。 1.2 菌种的保藏 菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。其任务是使菌种不死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。 菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活 动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平、缺氧状态、干燥和低温，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力。常用的菌种宝藏方法有：斜面冰箱宝藏法、沙土管宝藏法、
19、菌丝速冻法、石蜡油封存法、真空冷冻干燥保藏法、液氮超低温保藏法。 在这里我们采用斜面冰箱宝藏法 中的 甘油冷冻管保存法 。 甘油冷冻管保存法适用于保存传代用菌种，一般可保存 2年。 将待保存用菌种接种至平板或琼脂斜面，经 28 24 48h 培养后，用无菌接种环轻轻刮取菌苔，移至预先装有无菌蒸馏水的试管中，调整菌液浓度，使其等同于 1单位麦氏比浊管。 向已制备好的菌悬液中加入等体积，浓度为 20%的无菌甘油，得到 10%甘油菌悬液。 轻轻振摇，使 10%甘油菌悬液充分混合，分装于无菌小试管中，在 -30条件下贮存。 2 培养基的配制 2.1 培养基的营养要求 中北大学课程设计说明书 第 9 页
20、 共 22 页 9 培养基的成分大致分为碳源、氮源、无机盐、微量元素、特殊生长因子、促进剂、前体和水等几大类。对不同的微生物，微生物不同的生长阶段，不同的发酵产物以及不同发酵工艺条件等，所使用的培养基都是不同的，这些也都是培养基配制需要考虑的因素。 2.1.1 水 水是所有培养基的主要成分 ，也是微生物机体的重要组成成分。水是良好的溶剂，又是活细胞中一切代谢反应的媒介物，还可以维持细胞中的渗透压，同时水又是热的良好导体，有利于散热，可调节细胞温度。 2.1.2 碳源 碳源的主要为微生物细胞的生长繁殖提供能源。目前生产中性淀粉酶的菌种为异养型微生物，所以只能利用有机碳 ； 大量的农副产品是主要的
21、有机碳源，如山芋、麸皮、玉米 粉 、米糠、马铃薯、木薯、土茯苓等淀粉质原料 ， 这里用到的碳源是 玉米粉（淀粉含量 90%） 。 2.1.3 氮源 氮源是组成蛋白质和核酸的主要元素，酶自身即为蛋白质。因此，氮源是必不可 少的重要原料。常用的有机氮源油花生饼粉、豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉等。我们用到的氮源是 琼脂， 谷朊粉 （含蛋白质 86%） 和蛋白胨。 常用的无机氮源有铵盐、硝酸盐和氨水等。 2.1.4 无机盐类及微量元素 酶在生长和繁殖生长过程中，需要某些无机盐及微量元素如磷、镁、硫、钾、钠、钙、铁、锰、锌等。钠离子具有控制细胞和培养基之间的渗透压的作用 ， 从而促进产酶 ， 添加适量亚硝酸钠可提高酶活力 ； 钙对淀粉酶有稳定和活化作用 。 2.1.5 生长因子和产酶促进剂 酶的生产中所需的生长因子大多由天然原料提供 。玉米浆、麦芽汁、豆芽汁等，都 含有丰富的生长因子。产酶促进剂一般是该酶的底物和底物类似物。 2.2 培养基的种类 培养基的种类很多，可以根据组成、状态和用途等进行分类，按照用途可以分成孢子培养基，种子培养基和发酵培养基。微生物大规模发酵设计主要用到孢子 ,
