1、 1 实验二十五 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 测定蛋白质相对分子质量 一、目的要求 1、掌握 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法的原理。 2、巩固垂直板电泳的基本操作。 3、学会用该方法测定蛋白质的相对分子量。 二、原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率，用它分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带净电荷多少等因素所造成的电泳迁移率的差别。 1967 年， Shapiro 等人发现，在聚丙烯酰胺凝胶中加入十二烷基硫酸钠 (sodium dodecylsulfate， SDS)后，与 SDS 结合 的蛋白质带有一致的负电荷，电泳时其迁移速率主要取决于它的 Mr(相对分子
2、质量 )，而与所带电荷和形状无关。 当蛋白质的 Mr 在 15000 200000 之间时，蛋白质的 Mr 与电泳迁移率间的关系可用下式表示： lgMr=K-bm 图 1 37 种蛋白质的 Mr对数与电泳相对迁移率关系图 Mr 范围为 11000 70000， 10凝胶， pH=7.2, SDS-磷酸盐缓冲系统 2 式中， Mr 为蛋白质的相对分子质量； m为迁移率； b 为斜率； K为截距。均为常数。在条件一定时， b 和 K 将已知相对分子质量的 标准蛋白质的迁移率对 Mr 的对数作图，可得到一条标准曲线 (如图 1)。将未知相对分子质量的蛋白质样品，在相同的条件下进行电泳，根据它的电泳迁
3、移率可在标准曲线上查得它的相对分子质量。 SDS 是一种阴离子型去污剂，在蛋白质溶解液中加入 SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原； SDS 能使蛋白质的非共价键 (氢键、疏水键 )打开，并结合到蛋白质分子上 (在一定条件下，大多数蛋白质与 SDS 的结合比为 1.4 g SDS g蛋白质 )，形成蛋白质 SDS 复合物。由于 SDS 带有大量负电荷，当它与蛋白质结合时，所带的负 电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差异。 SDS 与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质 SDS 复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶
4、液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒。不同蛋白质的 SDS复合物的短轴长度都一样，而长轴则随蛋白质相对分子质量的大小成正比地变化。这样的蛋白质 SDS 复合物在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒的长度，也就是蛋白质相对分子质量的函数。 SDS-PAGE 缓冲系统有连续系统和不连续系统。不连续 SDS-PAGE 缓冲系统有较好的浓缩效应，近年趋向用不连续 SDS-PAGE 缓冲系统。按所制成的凝胶形状又有垂直板型电泳和垂直柱型电泳。本实验采用 SDS-不连续系统垂直板型凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量。 三、试剂与器材 （一）、试剂 1标准蛋白质纯品：根据待测蛋白质的
5、相对分子质量大小，选择 4 6 种已知相对分子质量的蛋白质纯品作为标准蛋白质。本实验采用的标准蛋白质见表 1 所示。 表 1 5 种标准蛋白质的相对分子质量 标准蛋白质 相对分子质量 (道尔顿 ) 鸡蛋清溶菌酶 14400 胰蛋白酶抑制剂 21100 牛碳酸酐酶 31000 卵清蛋白 43000 牛血清清蛋白 67000 兔磷酸化酶 B 97000 2 1 (V V)TEMED 溶液：取 1 ml TEMED，加蒸馏水至 100 ml，置于棕色瓶中，在4 冰箱中保存。 3 10 (W V)过硫酸铵溶液：取过硫酸铵 1 g，溶解于 10ml 蒸馏水中。最好现配现用。 4 0.05 mol L 1
6、， pH 8.0 Tris-HCI 缓冲溶液：称取 Tris 0.61g，加入 50ml 蒸馏水使之溶解，再加 入 3ml l mol L 1 HCl 溶液，混匀后在 pH 计上调 pH至 8.0，最后加蒸馏水定容至 100ml。 5 蛋白质样品溶解液： SDS 100mg，巯基乙醇 0.1 ml，甘油 1.0ml，溴酚蓝 2 mg， Tris-HCl缓冲溶液 2ml，加蒸馏水至总体积 10ml。 6分离胶缓冲溶液： Tris 36.3 g，加入 1 mol L 1 HCl 溶液 48.0 ml，再加蒸馏水到 100ml，pH=8.9。 7浓缩胶缓冲溶液： Tris 5.98g，加 1 mol
7、 L 1 HCI 溶液 48.0ml，加蒸馏水到 100ml，pH=6.7 8凝胶贮液： Acr 30.0g， Bis 0.8g，加蒸馏水到 100ml 3 9 电极缓冲溶液： SDS l g， Tris 6g，甘氨酸 28.8g，加蒸馏水至 1000ml， pH=8.3。 10固定液：取 50甲醇 454ml，冰醋酸 46ml，混匀。 11染色液： 1.25 g 考马斯亮蓝 R-250，加 454 ml 50甲醇溶液和 46ml 冰醋酸，混匀。 12脱色液：取冰醋酸 75ml，甲醇 50ml，加蒸馏水 875 ml。 （二）、器材 1垂直板型电泳槽 2直流稳压电源 (电压 300 600V，
8、电流 50 100mA) 3 50 或 100 l 的微量注射器 四、操作步骤 （一）安装垂直板型电泳装置 此种夹心式垂直板电泳装置 (如图 2， 3)的两侧为有机玻璃制成的电极槽，两个电极槽中间夹有一个凝胶模子。凝胶模子由 3 部分组成；一个“ U”形的硅胶框、两块长短不等的玻璃片、样品槽模板 (俗称“梳子” )。电极槽由上贮槽 (白金电极在上或面对短玻璃片 )、下贮槽 (白金电极在下或面对长玻璃片 )和冷凝系统组成。凝胶模子的硅胶框内侧有两条凹槽，可将两块相应大小的玻璃片嵌入槽内。玻璃片之间形成一个 2 3mm 厚的间隙，将来制胶 时，将胶灌入其中。灌胶前，先将玻璃片洗净、晾干、嵌入胶带凹
9、槽中。长玻璃片下沿与胶带框底之间保持有一缝隙，以使此端的凝胶与一侧的电极槽相通；而短玻璃片的下沿则插入橡胶框的底槽内。将已插好玻璃片的凝胶模子置于仰放的上贮槽上，短玻璃片应面对上贮槽，再合上下贮槽，用 4 条长螺丝将两个半槽固定在一起。上螺丝时，要按一定顺序逐个拧紧，均匀用力。将装好的电泳装置垂直放置，在长玻璃片下端与硅胶框交界的缝隙内加入用电极缓冲溶液配制的 1琼脂糖溶液，待其凝固后，即堵住凝胶模板下面的窄缝 (通电时又可作为盐桥 )。（二）凝胶的制备 1分离胶的制备 根据所测蛋白质的相对分子质量范围，选择某一合适的分离胶浓度。按表 2 所列的试剂用量配制。 将所配制的凝胶液沿着凝胶的长玻璃
10、片的内面用细长头的滴管加至长、短玻璃片的窄缝内，加胶高度距样品槽模板下缘约 1 cm。用滴管沿玻璃片内壁加一层蒸馏 图 2 夹心式垂直板型电泳槽示意图 1导线接头 2下贮槽 3 U 形橡胶框 4样品槽模板 5固定螺丝 6上贮槽 7冷凝系统 图 3 凝胶模子示意图 1样品槽模板 2长玻璃片 3短玻璃片 4 U 形硅胶 框 表 2 SDS-不连续系统不同浓度凝胶配制用量表 4 贮液 配制 30ml 不同浓度的分离胶液 所需试剂用量 ml 配制 10ml 3浓缩胶 ml 7% 10% 12% 15% 20% 凝胶贮液 7.5 10 12 15 20 分离胶缓冲溶液 7.5 7.5 7.5 7.5 7
11、.5 凝胶贮液 - - - - - 1 浓缩胶缓冲溶液 - - - - - 1.25 10 SDS 溶液 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.1 1 TEMED 溶液 2 2 2 2 2 2 蒸馏水 13 10 8 5 - 5.55 以上溶液混合后抽气 10 分钟 10过硫酸铵溶液 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.1 水 (用于隔绝空气，使胶面平整 )。约 30 60 分钟凝胶完全聚合，用滴管吸去分离胶胶面的水封层，并用无毛边的滤纸条吸去残留的水液。 2浓缩胶的制备 按表 2 配制浓缩胶，混匀后用细长头的滴管将凝胶溶液加到已聚合的分离胶上方，直至距短玻璃 片上缘 0.5cm
12、处，轻轻将“梳子”插入浓缩胶内（插入“梳子”的目的是使胶液聚合后，在凝胶顶部形成数个相互隔开的凹槽）。约 30 分钟后凝胶聚合，再放置 30 分钟。小心拔去“梳子”，用窄条滤纸吸去样品凹槽内多余的水分。 （三）蛋白质样品的处理 1标准蛋白质样品的处理 称标准蛋白质样品各 1 mg 左右，分别转移至带塞的小试管中，按 1.0 1.5 g L 溶液比例，向样品加入“样品溶解液”，溶解后轻轻盖上盖子 (不要盖紧，以免加热时迸出 )，在 100沸水浴中保温 2 3 分钟，取出冷至室温。如处理好的样品暂时不用，可放在 -20冰箱保存较长时间。使用前在 100水中加热 3 分钟，以除去可能出现的亚稳态聚合
13、物。 2待测蛋白质样品的处理 固体样品的处理与标准蛋白质相同。如待测样品已在溶液中，可先配制“浓样品溶解液”(各种溶质的浓度均比“样品溶解液”高 1 倍 )，将待测液与“浓样品溶解液”等体积混匀，然后同上加热。如待测液太稀可事先浓缩，若含盐量太高则需先透析。 （四）加样 将 pH 8.3 的电极缓冲溶液倒入上、下贮槽中，应没过短玻璃片。用微量注射器依次在各个样品凹槽内加样，一般加样体积为 10 15 l。如样品较稀，可加 20 30 l。由于样品溶解液中含有比重较大的甘油，故样品溶液会自动沉降在凝胶表面形成样品层。 （五）电泳 将上槽接负极，下槽接正极，打开电源，开始时将电流控制在 15 20
14、 mA，待样品进入分离胶后，改为 30 50mA。待蓝色染料迁移至下端约 1 1.5cm 时，停止电泳，约需 5 6小时。 （六）固定 5 取下凝胶模子，将凝胶片取出，滑入一白瓷盘或大培养皿内，在染料区带的中心插入细铜丝作为标志。加入固定液 (应没过凝胶片 )，固定 2 小时或过夜。 （七）染色 倾出固定液，加入染色液，染色过夜。 （八）脱色 染色完毕，倾出染色液，加人脱色液。数小时换一次脱色液，直至背景清晰 ,约需一昼夜。 （九） Mr的计算 通常以相对迁移率（ mr）来表示迁移率。相对迁移率的计算方法如下： 用直尺分别量出样品区带中心及铜丝与凝胶顶端的距离（如图 4），按下式计算： 相对迁
15、移率 (mr)样品迁移距离 (cm)染料迁移距离 (cm)。 以标准蛋白质相对分子质量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线 (如图 1)。根据待测样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其相对分子质量。 图 4 标准蛋白质在 SDS-凝胶上的分离示意图 a样品迁移距离 b染料迁移距离 1细胞色素 c 2胰凝乳蛋白酶原 A 3胃蛋白酶 4卵清蛋白 5牛血清清蛋白 五、思考题 1、样品溶解液中各种试剂的作用是什么？ 2、实验否需要在低温下进行？ 3、该方法是否能用于所有的蛋白质相对分子量的测定？为什么？ 4、本实验测得的分子量存在误差，根据你的实验分析造成误差产生的原因。 6 实验二十五 SDS-聚丙烯
16、酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量 习题 一 、单项选择题 1在聚丙烯酰胺凝胶中加入下列那个成分后，蛋白质带有一致的负电荷，电泳时其迁移速率主要取决于它的 Mr(相对分子质量 )，而与所带电荷和形状无关。 A EDTA B尿素 C亚精胺 D SDS 2下列那个试剂具有还原性？ A二硫苏糖醇 B DEPC C. 巯基乙醇 D. Tris HCl 3在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中，下列那个试剂常用为指示剂？ A SDS B巯基乙醇 C溴酚蓝 D甘油 4当蛋白质的分子量在 15000 200000 之间时，蛋白质的分子量的对数 与电泳迁移率是什么关系？ A正相关线性关系 B 负相关线性关系 C 抛
17、物线关系 D.没有规律 5将未知相对分子质量的蛋白质样品，在相同的条件下进行 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色后，根据它的电泳迁移率可在标准曲线上查得蛋白质的那个信息？ A蛋白质的结构 B.蛋白质的底物 C.蛋白质的抗体 D 蛋白质的分子量 二 、 多 项选择题 1下列那些试剂是蛋白质样品溶解液的成分？ A SDS B三氯乙酸 C 溴酚蓝 D 磷酸二氢钠 2在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中，脱色液和染色液共用的是那两个试剂？ A. TEMED B. 冰醋酸 C. 甲醇 D.HCl 3 SDS 与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变，它们在水溶液中的形状，不可能是 下列那些形状？ A
18、. 雪茄烟形 B. 长椭圆棒 C.正方体形 D.球形 4在公式 lgMr=K-bm 中，作为常数的是： A. Mr B. K C. b D. m 5在 SDS-不连续系统垂直板型凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量实验中，有那些效应？A.浓缩效应 B.化学效应 C.分子筛效应 D.电荷效应 三 、 填空 题 1在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中，电 泳时其迁移速率主要取决于它的 ，而与所带电荷 和形状无关。 2在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中， SDS 与蛋白质结合后，不同蛋白质的 SDS 复合物的 长度都一样，而 则随蛋白质相对分子质量的大小成正比地变化。 3 SDS 是一种 离子型去污剂。 4由
19、于 SDS 带有大量 电荷，当它与蛋白质结合时，所带的电荷量大大超过了蛋白质分 子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差异。 5蛋白质样品溶解液中，甘油的作用是 。 四 、 简答 题 1、 简述 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测 定蛋白质相对分子质量的原理。 2、 在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中，试说明样品溶解液中（含有 SDS、巯基乙醇、甘油、溴酚蓝、和 Tris-HCl）各种试剂的作用是什么？ 3、 在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中，当 SDS 与蛋白质结合后，会引起蛋白质构象如何变化？该变化会有什么结果？ 7 参考答案 一、单项选择题 1、 D 2、 C 3、 C 4、 B
20、5、 D 二 、 多 项选择题 1、 AC 2、 BC 3、 AB 4、 CD 5、 ACD 三 、 填空 题 1 Mr(相对分子质量 ) 2 短轴， 长轴 3阴 4 负 5协助蛋白质沉淀 四 、 简答 题 1、 简述 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量的原理。 答案：在聚丙烯酰胺凝胶中加入十二烷基硫酸钠 (sodium dodecylsulfate， SDS)后，与 SDS 结合的蛋白质带有一致的负电荷，电泳时其迁移速率主要取决于它的 Mr(相对分子质量 )，而与所带电荷和形状无关，在一定的分子量范围内，二者是种线性关系。这是因为 SDS 带有大量负电荷，当它与蛋白质结合时（大
21、多数蛋白质与 SDS 的结合比为 1.4 g SDS g 蛋白质） ，所带的负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差异。 2、 在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中，试说明样品溶解液中（含有 SDS、巯基乙醇、甘油、溴酚蓝、和 Tris-HCl）各种试剂的作用是什么？ 答案： SDS：结合蛋白质，消除蛋白质间电荷差异，同时是一种变性剂；巯基乙醇：还原剂；甘油：协助沉淀蛋白质；溴酚蓝：指示剂； Tris-HCl：缓冲剂。 3、 在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中，当 SDS 与蛋白质结合后，会引起蛋白质构象如何变化？该变化会有什么结果？ 答案： SDS 与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质 SDS 复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒。不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，而长轴则随蛋白质相对分子质量的大小成正比地变化。这样的蛋白质 SDS 复合物在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度相关，也就是蛋白质相对分子质量的函数。
