1、Normally, we used following primers to amplify bacterial 16S rRNA genes (27F and 1492R pair) and sequencing them (using other primers). The primer sequencs are all listed in the reference: - Lane DJ (1991) 16S/23S rRNA sequencing. In: Stackebrandt E, Goodfellow M (eds) Nucleic acid techniques in bac
2、terial systematics. Wiley, Chichester, pp 115-175 27F 5 AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3 PCR and sequencing, most eubacteria 357F 5 CTC CTA CGG GAG GCA GCA G 3 Most eubacteria 530F 5 GTG CCA GCM GCC GCG G 3 Most eubacteria and archaebacteria 926F 5 AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG 3 Most eubacteria and archae
3、bacteria 1114F 5 GCA ACG AGC GCA ACC C 3 Most eubacteria 342R 5 CTG CTG CSY CCC GTA G 3 Most eubacteria 519R 5 GWA TTA CCG CGG CKG CTG 3 Most eubacteria and archaebacteria 907R 5 CCG TCA ATT CMT TTR AGT TT 3 Most eubacteria and archaebacteria 1100R 5 GGG TTG CGC TCG TTG 3 Most eubacteria 1492R 5 TAC
4、 GGY TAC CTT GTT ACG ACT T 3 PCR and sequencing, most eubacteria 1525R 5 AAG GAG GTG WTC CAR CC 3 PCR and sequencing, most eubacteria M=C:A, Y=C:T. K=G:T, R=A:G, S=G:C. W=A:T; all 1:1 Any primers reverse complement sequence is its revers prime. For example: 519R 5 GWA TTA CCG CGG CKG CTG 3 then 519F
5、 3 CWT AAT GGC GCC GKC GAC 5 Hope this would useful to you and answered your question. And hope this would useful to many other people. Good LUCK, guys! 以 16S rRNA 基因为靶基因设计或比较通用引物，用 blast 效果不太好。因为该基因含有很多高度保守区（ 9-10），且在很多细菌中都是多拷贝的，文献或设计的 primers 往往都能扩增出几乎所有的真细菌，因此， blast 时会得到很多同源序列，尽管如此，还是有更多的序列或细菌被省
6、略了。 我设计或验证该 UP 时，是有目的地根据实验需要，从 genebank 中确定一些常见细菌的属，每个属选几个菌种，每个菌种选 2-3 个菌株，但一定要包括标准株（可参考文献），然后用MEGLINE 进行序列，并与 UP 进行比较。设计完成后在拿 UP 与随意查的其他细菌进行比较验证。尽管需要分析的序列可能达近百个，可现在的计算机内存和速度，及宽带都很大，应该是很快的。 细菌 rRNA 按沉降系数分为 3 种，分别为 5S、 16S 和 23S rRNA。 16S rDNA 是细菌染色体上编码 16S rRNA 相对应的 DNA 序列，存在于所有细菌染色体基因中，它的内部结构由保守区及可
7、变区两部分组成。其分子内存在的可变区，显示出细菌不同分类等级水平上的特异性。 16S rRNA(16S rDNA) 寡核苷酸的序列分析 首先， 16S rRNA 普遍存在于原核生物（真核生物中 其同源分子是 18S rRNA ）中。 rRNA 参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的时间钟。其次，在 16S rRNA 分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。第三， 16S rRNA 的相对分子量大小适中，约 1 540 个核苷酸，便于序列分析。因此
8、，它可以作为测量各类生物进化和亲缘关系的良好工具。分离菌株 16S rRNA 基因的分离较为简单。从平板中 直接挑取一环分离菌株细胞 , 加入 100L 无菌重蒸 H 2 O 中 , 旋涡混匀后 , 沸水浴 2min, 12 000r min -1 离心 5min, 上清液中即含 16S rRNA 基因，可直接用于 PCR 扩增。分离菌株 16S rRNA 基因的 PCR 扩增和序列测定的一般步骤为： 16S rRNA 基因的 PCR 引物 ： 5-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3 ； 5-AAGGAGGTGA TCCAG CCGCA-3 。扩增反应体积 50 m L ，反应
9、条件为 95 预变性 5min ， 94 变性 1min ， 55 退火 1min ， 72 延伸 2min ，共进行 29 个循环， PCR 反应在 PTC-200 型热循环仪上进行。取 5 m L 反应液在 10g L -1 的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。 PCR 产物测序可由专门技术公司完成。测序得到 分离菌株 16S rDNA 部分序列，此序列一般以 *.f.seq 形式保存，可以用写字板或 Editsequence 软件打开，将所得序列通过 Blast 程序与 GenBank 中核酸数据进行比对分析 ( http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/blast ) ，具体步骤如
10、下：点击网站中 Nucleotide BLAST 下 Nucleotide-nucleotide BLAST blastn 选项，将测序所得序列粘贴在“ search ”网页空白处，或输入测序结果所在文件夹目录，点击核酸比对选项，即 “ blast ”，然后点击 “ format ”，计算机自动开始搜 索核苷酸数据库中序列并进行序列比较，根据同源性高低列出相近序列及其所属种或属，以及菌株相关信息，从而初步判断 16S rDNA 鉴定结果。遗传距离矩阵与系统发育树构建，可采用 DNAStar 软件包中的 MegAlign 程序计算样本间的遗传距离。由 GenBank 中得到相关菌株的序列，与本研
11、究分离菌株所测得序列一起输入 Clustalx1.8 程序进行 DNA 同源序列排列，并经人工仔细核查。在此基础上，序列输入 Phylip3.6 软件包，以简约法构建系统发育树。使用 Kimura 2-parameter 法，系统树各分枝的置信度经重抽样法（ Bootstrap ） 500 次重复检测， DNA 序列变异中的转换和颠换赋于相同的加权值。 16S rDNA 是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其种类少，含量大（约占细菌 RNA 含量的 80），分子大小适中，存在于所有的生物中，其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。在大多数原核
12、生物中 rDNA都具有多个拷贝， 5S、 16S、 23S rDNA 的拷贝数相同。 16S rDNA 由于大小适中，约 1.5Kb左右，既能体现不 同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。细菌的 16S rDNA 的结构如下： 图 6-1 16S rDNA 的结构 可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将5 V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 3 540bp 970bp 1540bp 16S rDNA 片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定，和其他方法相比， 16S rDNA 序列测定分析更适用于确定属及属以上分类单位的亲缘关系。 27f 1492r 细菌 16 S rDNA 基因的 V3 区引物 ,通用引物 F341（ 5CCTACGGGAGGCAGCAG 3）和R518(5 ATTACCGCGGCTGCTGG 3) 16SrDNA 基因序列的扩增采用细菌通用引物 正向引物 5AgAgTTTgATCATggCTCAg-3 反向引物 5 -ggTACCTTgTTACgACTT-3
