1、项目名称： 作物应答盐碱胁迫的分子调控机理首席科学家： 郭岩 中国农业大学起止年限： 2012.1-2016.8依托部门： 教育部一、关键科学问题及研究内容拟解决的关键科学问题： 在前期 973项目研究的基础上，本项目以水稻、玉米和拟南芥为材料，拟解决的主要科学问题是：作物重要耐盐碱基因的克隆，植物盐碱胁迫信号感受和重要调控单元的鉴定、作用机制分析以及作物耐盐碱品种培育的分子设计。我们将针对我国不同地区的盐土、碱土和苏打盐土的特殊性、围绕植物响应盐碱胁迫的信号感受-信号转导和基因转录调控两个网络交叉互作的重要节点进行重点研究、并根据得到的重要节点组成的调控单元（Regulatory modul
2、e） ，通过“智能型”转化系统进行初步耐盐碱作物的分子设计。这些问题的解决，不仅对解析植物耐盐碱机理和阐明植物适应其它非生物逆境的机理有重要的理论意义，同时对耐盐碱作物分子设计育种和耐盐碱作物新品种培育以及我国盐碱土地的开发利用具有重要的应用前景。主要研究内容： 在前期 973项目顺利实施的基础上，根据作物应答盐碱胁迫的“信号感受转导蛋白修饰染色质修饰/转录调控离子平衡/细胞活性反馈互作及网络调控”的基本过程和研究思路，围绕植物响应盐碱胁迫的信号转导和基因转录调控两个网络的交叉互作调控，寻找负责调控植物盐碱胁迫反应的两个网络的重要节点以及由包括这个（或这些）重要节点组成的重要调控单元，重点探讨
3、植物对盐碱胁迫的感知、染色质修饰与盐碱胁迫反应关键基因转录活性调控和植物耐盐碱的关系。使我们能够比较系统和深入地了解植物对盐碱胁迫反应的分子机制，并为通过分子设计培育耐盐碱作物（玉米、水稻）新品种提供理论基础和遗传材料。通过创造（人工诱变、渗入系等）主要农作物耐盐碱材料和寻找地方品种耐盐碱资源，分离、克隆耐盐碱基因或 QTL，明确它们在抗逆调控途径中的位置，初步阐明其耐盐碱的分子调控机理，为作物品种改良提供有利的抗逆新基因。项目拟研究的主要内容包括：1）作物感应高盐胁迫的分子机制；2）作物应答盐碱胁迫的重要功能基因/QTL 的克隆和转录调控、组蛋白修饰调控机理；3）作物对盐碱胁迫的下游反应：植
4、物生长发育、细胞离子平衡和活性的调控机理；4）作物应答盐碱胁迫的信号感受、转导、蛋白修饰、基因转录及代谢调控的分子网络交互作用节点和调控单元模型的建立与完善，以此为基础通过智能转化系统初步尝试耐盐碱作物（玉米、水稻、小麦）分子设计。二、预期目标总体目标： 阐明对改良作物耐盐碱抗逆性状有重要作用、可用于我国作物抗逆新品种培育的重要基因/节点和这些重要基因构成的调控单元；提出我国作物耐盐碱性状改良分子育种的新设计方案，为我国利用分子设计育种方法培育作物抗逆新品种并最终为保障我国的粮食安全作出贡献；阐明数个在植物响应盐碱逆境胁迫的信号感受、转导、基因转录调控及细胞活性调控研究领域的重要科学问题，发表
5、在国际科学界有影响的高水平研究论文；培养一批能够独立从事相关领域高水平研究的优秀年轻人才，组织和形成一支具有团结协作精神的植物抗逆分子机理研究队伍、并保持和巩固团队在这一领域的领先水平。五年预期目标: 通过项目实施，获得几个由信号转导网络和基因转录调控网络交叉互作的重要基因/节点组成的整合盐碱信号和反应的调控单元，并针对调控单元初步尝试耐盐碱作物分子设计；克隆 30个以上对植/作物耐盐碱有重要功能或调控作用的新基因并完成对其功能的解析，并使其中的一些成为培育耐盐碱品种的分子标记；建立和完善 23 个植物应答盐碱胁迫的信号转导和基因表达分子调控网络途径，完成对其中关键调控因子的详尽分析；在国际学
6、术期刊发表研究论文 100篇以上（或论文累计 SCI影响因子 400以上） ；获得 20个以上对改良作物抗逆性状有应用价值的新基因发明专利。初步尝试主要农作物（水稻、小麦和玉米）耐盐碱性状改良的分子育种技术设计，并获得 35 个耐盐碱作物新品系等。培养具有博士和硕士学位的优秀年轻人才 100人、博士后 30人，使其中部分优秀年轻人才具有独立从事相关领域高水平研究的综合能力。三、研究方案1）学术思路： 根据项目拟解决的关键科学问题和主要研究内容，本项目整体上分为植物应答盐碱胁迫的“信号感受、转导、蛋白修饰和转录调控、细胞活性调控”分子机制四个层次的研究：鉴定、克隆农作物的重要耐盐碱基因/QTL，
7、为作物耐盐碱育种提供分子标记，通过对植物响应盐碱胁迫的信号感受、信号转导网络和基因转录调控网络交叉互作的重要节点的重点分析研究，找出参与植物盐碱胁迫反应的调控单元，并根据得到的重要节点调控单元通过“智能型”转化系统进行初步耐盐碱作物的分子设计，最终为我国耐盐碱作物新品种培育和粮食安全做出贡献。2）技术途径： 项目拟解决的主要科学问题是：重要农作物耐盐碱基因/节点和植物盐碱胁迫反应重要调控单元的鉴定、作用机制分析和作物耐盐碱分子设计。为了解决上述科学问题，以遗传学、细胞生物学、生物化学和分子生物学、基因组学等技术和方法，研究以下四个主要内容并通过对这些问题研究结果的分析和整合来鉴定节点和调控单元
8、、分析调控单元的作用机制：1.植物感受和响应盐碱胁迫的信号转导分子调控机理；2植物响应盐碱胁迫的组蛋白修饰和基因转录调控；3盐碱胁迫下植物细胞离子平衡和活性的调节；4分离、克隆主要农作物耐盐碱基因/QTL，根据信号转导网络和基因转录调控网络交叉互作的重要节点鉴定调控单元并进行耐盐碱作物分子设计。通过详细研究和分析植物盐碱胁迫反应的信号转导网络和转录调控网络的整合来寻找植物耐盐碱的重要节点，筛选鉴定植物整合盐碱信号和反应的调控单元并把调控单元作为整体进行作物分子设计。整体研究方案有利于系统、全面地探讨植物应答盐碱胁迫的分子调控机理，也有助于逐步阐明植物应答逆境胁迫的信号感受、转导、转录和翻译后调
9、控、代谢调控等之间的复杂网络机制。理论上对阐明应答盐碱胁迫的分子机制有重要作用；同时可能为提出作物耐盐碱性状改良的分子育种设计新方案提供理论基础。四、年度计划年度 研究内容 预期目标第一年1. 对拟南芥的盐驯以及感受盐信号的机理进行研究，筛选相关参与盐驯过程的基因；分析 SNR受体激酶的活性在高盐胁迫中所起的负调节作用 SNR与氧化胁迫的关系；PLC、DGK， LPP单、多重突变体鉴定；磷脂酶和微管的关系，PA-MAPs 研究；建立蛙卵和 HEK293细胞系表达通道（载体蛋白） 、电生理检测技术；筛选SCaBP8、SCaBP1、PKS5 结合蛋白；筛选影响植物耐盐性的小分子活性化合物；ROP
10、家族及其下游效应子 RIC家族各相关突变体及转基因株系盐碱表型分析；2. 盐胁迫条件下 DNA甲基化调节的目标基因分离与 DNA甲基化水平检测； DNA甲基化和盐胁迫响应突变体的筛选；盐诱导植物全基因组水平组蛋白甲基化变化检测；筛选 MKK9介入的MAPK级联系统磷酸化的转录因子并克隆基因；两类转录因子（PHD 和 Trihelix家族）参与的盐碱应答功能分析； elf1突变体盐反应表型分析；3. 水稻突变体 Osakt1高盐条件下的表型观察，构建过表达材料所需载体和转化材料；进行OsSKIPa与 SIP5和 SIP25的互作鉴定，相关基因突变体鉴定和遗传转化分析；分离相关突变体和产生 LPA
11、AT2、LPPa5 和CDS的 RNAi及过表达材料；对已获得的参与盐胁迫反应的S6K1 的突变体和过表达材料进1. 初步阐明盐驯以及植物感受盐信号的生理学机制，克隆与盐驯、感受盐信号相关的候选基因；初步确定磷脂和微管互作在耐盐信号转导中的作用；得到 2-4个SCaBP8、SCaBP1、PKS5 结合蛋白；确定存在影响植物耐盐碱性的内源小分子化合物；获得盐相关钙信号突变体；获得 1-2个参与盐碱应答的 ROP家族或 RIC家族的成员；2. 得到盐诱导植物全基因组水平组蛋白 H3K4甲基化变化数据；分离受 DNA甲基化调节的目标基因2-3个；分离 DNA甲基化和盐胁迫响应突变体 3-5个；得到候
12、选MAPK途径转录因子基因；得到PHD和 Trihelix突变体并进行表型分析；完成 elf1突变体盐反应表型分析；3. 明确水稻 Osakt1在高盐条件下的盐敏感表型；获得SIP5、SIP25 基因突变体和过表达表型；获得 LPPa5、LPAAT2和 CDS基因的突变体和超表达植株；初步探明 PA-S6K1 在盐胁迫下调控植物生长和细胞活性的作用；定位 1-2个水稻耐盐基因或 QTL；获得 1-2个水稻相关新基因的转基因植株；完成qRGE4-2 和 qSTL2-1的精细定位，获得 23 个芽期和苗期盐胁迫候选；4. 获得 2-3个聚合多个重要耐盐调控基因的转基因植物；证实TaSRO1是否拥有
13、 PARP酶活性，以及通过 PARP酶活增强基因组稳定性；证实 TaSRO1通过何种年度 研究内容 预期目标行分析；构建分离群体，初步定位水稻耐盐相关基因或 QTL；选择受转录因子 DST调控的下游基因构建各种表达载体，进行转化水稻；采用染色体片段迭代法，精细定位野生稻芽期盐敏感 QTL qRGE4-2和苗期耐盐 QTL qSTL2-1筛选野生稻盐胁迫候选基因；4. 以玉米、草坪草、苜蓿品种为受体材料，对多基因表达载体NCED3-ABAR-DREB1A-LOS5-ICE和 SOS1-SOS2-SOS3-SCaBP8等进行多基因的遗传转化；建立XVE诱导表达系统，实现在特异性启动子驱动下的多基因
14、表达；测定 TaSRO1重组蛋白的 PARP活性，分析 PARP与基因组稳定性的关系；利用获得的转 EAR类抑制子基因水稻材料鉴定其耐盐性；完善建立水稻、玉米、草坪草、苜蓿适时、适地、高效的智能转化系统；在宁夏银北地区选取具有不同盐碱类型的试验地（西大滩、银北农垦暖泉农场）对获得的水稻、玉米、草坪草和苜蓿耐盐碱材料进行分子选育和定向改造。途径调控 ROS平衡；建立水稻、玉米、草坪草、苜蓿适时、适地、高效智能转化系统；筛选鉴定耐盐碱较强的水稻特异材料 8-12个；5. 5.发表 SCI论文 8-10篇，申请专利 2-4项。第二年1. 筛选盐驯相关的突变体，观察突变体植株对盐驯和感受盐信号的表型；
15、分析盐驯以及感受盐信号相关基因的生化特性；分析 SNR的激酶区关键的磷酸化基团及其在盐胁迫信号传递或耐盐胁迫中的作用；进一步研究 PLC，DGK，LPP，PLD 在耐盐响应中的作用；观察候选ROP-RIC信号途径中重要成员的突变体及转基因株系中细胞骨架组织动态的变化；SCaBP8、SCaBP1、PKS5 结合蛋白的相关基因突变体的鉴定和1. 获得 1-2个与盐驯和感受盐信号相关的新基因，完成生化特性分析；鉴定磷脂酸（PA）调控的微管结合蛋白 1个；基本探明PLC，DGK，LPP，PLD 在 PA产生中的贡献和耐盐作用；获得有盐碱表型的SCaBP8、SCaBP1、PKS5 结合蛋白的基因突变体；
16、初步确定小分子活性化合物的结构；阐明ROP-RIC信号途径调控细胞骨架动态变化的作用机理；确定 SNR的激酶区关键的磷酸化基团及其在盐胁迫信号传递或耐盐胁迫中年度 研究内容 预期目标盐碱表型的分析；小分子活性化合物的鉴定；2. 盐胁迫条件下目标基因启动子在转基因后代中 DNA甲基化水平分析；部分目标基因超表达和 RNAi植株或 T-DNA插入突变体的耐盐性分析比较；两类转录因子（PHD 和 Trihelix家族）参与的盐碱应答机制分析；拟南芥和玉米中盐胁迫响应的miRNAs的分离；构建大豆 4-5个、水稻 3-4个候选基因表达载体，转化拟南芥/水稻/大豆，观察转基因植物根系的表型；ELF1调节
17、植物盐胁迫反应的分子机制分析；3. 对水稻 OsAKT1进行转基因功能互补实验，构建标签基因共表达载体转化植株；利用 DST调控的下游基因的转基因株系进行抗逆相关生理功能分析；OsSKIPa互作蛋白 SIP5和SIP25基因功能分析；深入分析S6K1应答盐胁迫反应中的作用及其调控机理；分析LPAAT2、LPPa5 和 CDS对植物应答盐胁迫中的脂质代谢和膜脂组分的影响；分离克隆水稻耐盐相关基因/QTL；构建野生稻盐胁迫侯选基因的基因组功能互补载体、RNAi 载体、过量表达载体、和 GUS、GFP 基因的共表达载体，并进行遗传转化；4. 继续利用聚合多个重要耐盐调控基因载体转化水稻、玉米等作物，
18、并对转基因作物进行初步的耐盐性分析；TaSRO1 过表达及 RNAi载体对不同小麦品种的遗传转化； TaSRO1过表达株系与对照的转录组比较分析；根据整合 1、2、3 和 4课题得到的耐盐碱分子设计的重要节的作用；2. 分离盐胁迫响应的 miRNAs 3-5个；鉴定 miRNA靶基因 2-3个；了解 PHD和 Trihelix家族参与的盐碱应答机制；获得候选抗盐基因转基因水稻；获得 1-2个与耐逆相关的新基因，完成生化特性分析；确定 EFL1参与盐胁迫反应的分子机制；完成盐诱导植物全基因组水平组蛋白甲基化水平变化检测；3. 明确水稻 OsAKT1突变体、过表达等相关材料在盐胁迫下的表型。获得过
19、表达阳性植株；初步揭示SIP5和 SIP25基因的功能；阐明 PA-S6K1 在盐胁迫下调控植物生长和细胞活性的作用及其分子调控；克隆 1-2个水稻耐盐基因/QTL，初步了解 1-2个水稻抗逆新基因的功能；初步分析LPAAT2、LPPa5 应答盐胁迫反应中的生物学功能；获得野生稻盐胁迫基因转基因植株；4. 获得高效实用的 XVE诱导表达系统及无标记转基因系统转化的转基因水稻、玉米等；阐明TaSRO1调控耐逆及促进植物生长的相关信号/代谢通路；获得智能型表达载体的转基因株系；筛选小麦耐盐材料 2个、草坪草1个、苜蓿 1个，田间试验规模达 1亩；5. 5.发表 SCI论文 10-15篇，申请专利
20、4-6项。年度 研究内容 预期目标点，构建“智能型”表达载体遗传转化以宁夏当地主栽水稻、玉米、草坪草、苜蓿品种为受体材料；对获得的转基因株系进行分子检测，筛选阳性植株，并进行扩繁；在宁夏银北地区选取具有不同盐碱类型的试验地（西大滩、银北农垦暖泉农场）对获得的水稻、小麦耐盐碱材料进行鉴定。第三年1. 鉴定与盐驯和感受盐信号相关蛋白的下游基因，并对下游基因进行功能分析；开展微管骨架动态与植物响应盐胁迫信号之间的关系的研究；SNR 与Na+/K+离子运载体的关系，SNR与乙烯的关系；研究 MAP磷酸化水平与 PA的可能关系；PLC，DGK 转导耐盐信号机理；进一步研究SCaBP8、SCaBP1、PK
21、S5 结合蛋白作用机理；鉴定小分子活性化合物的结构；观察 ROP和 RIC突变体及转基因株系在盐处理前后细胞骨架的动态变化；2. DNA甲基转移酶和 DNA去甲基化酶对胁迫条件下的目标基因表达和启动子 DNA甲基化影响；DNA甲基化目标基因转基因拟南芥植株和突变体分析。图位克隆 DNA甲基化和盐胁迫响应突变体基因；鉴定耐逆相关大豆基因的下游基因，并对下游基因进行功能分析；对重要的节点基因的表观遗传学修饰进行分析，鉴定调控单元；对确定的调控单元进行转基因分析；3. 寻找 OsAKT1的互作因子；完成各种材料在正常和盐胁迫下的钾、钠含量测定；SIP5 和SIP25功能的深入分析；SIP13基因的功
22、能分析；CST1 参与的1. 初步阐明盐驯和感受盐信号基因参与的调控途径；初步明确植物盐胁迫下的微管的动态特征；揭示 PLC/DGK在耐盐中的作用与机理；阐明 ROP-RIC信号途径通过对细胞骨架的调节响应盐胁迫的机制；确定 SNR与 Na/K离子运载体的关系，SNR 与乙烯的关系；确定 1-2个小分子活性化合物的结构；2. 分离 DNA甲基化和盐胁迫响应突变体基因 1-2个；得到上述转录因子的基因敲除或下调突变体，完成过表达转基因；获得大豆耐盐相关基因的下游基因；确定节点基因 2-3个。争取确定 1个调控单元；3. 初步明确 OsAKT1参与盐胁迫的功能；获得 DST结合的核心序列；基本揭示
23、 OsSKIPa参与转录调控的机理；基本阐明LPAAT2、LPPa5 和 CDS对膜脂代谢的效应及其参与高渗透胁迫调控中的作用；进一步揭示 PA-S6K1 调控植物响应盐胁迫过程中的细胞生长和活性；证实 1-2个水稻耐盐相关基因/QTL 的克隆获得成功；明确野生稻盐胁迫基因的功能和基因表达的时空特异性；4. 获得无标记转基因作物材料 50份；阐明与 TaSRO1互作的 NAC年度 研究内容 预期目标调控网络分析以及 DH112的功能初步分析；分离鉴定LPAAT2、LPPa5 和 CDS或其产物脂质的互作蛋白；进一步分析S6K1的调控通路和节点；对水稻耐盐相关基因/QTL 进行转基因功能互补试验
24、；鉴定野生稻盐胁迫基因转基因植株的耐盐性，分析基因的表达特性；4. 对转基因作物进行深入的耐盐性分析；整合项目取得的新成果（新基因或调控单元） ，使用建立的高效无标记转基因系统较大规模地转化水稻、玉米等作物；TaSRO1 过表达及 RNAi的纯合小麦株系筛选、表达量鉴定；完善水稻、玉米等作物的高效遗传转化体系；构建智能型表达载体，并进行水稻、玉米、小麦等作物的遗传转化和耐盐碱性的筛选鉴定；对前期获得的耐盐碱性比较强的水稻、小麦等材料进行小范围的示范。转录因子的功能以及 TaSRO1在小麦耐逆中的作用；获得 5-8个聚合多个重要耐盐基因的转基因植物；筛选鉴定较强耐性株系3-5个；水稻、小麦等耐盐
25、材料的小范围示范 1-2亩；5. 5.发表 SCI论文 20-25篇，申请专利 5-8项。第四年1. 对新的盐驯和盐胁迫下游相关基因进行生化特性鉴定，以及生理功能分析，明确所参与的调控途径；应用 Co-IP等方法，筛选盐胁迫下特异调控微管动态的微管结合蛋白，并进行功能分析；筛选出受 SNR调节的关键蛋白；研究 PA调控的 MPK与 MAPs关系；研究 Na+转运蛋白与磷脂的关系；继续研究钙信号在 SOS途径和 RCC途径调控关系；继续研究钙信号介导的 SCaBP1/AtJ3-PKS5-质膜 H+-ATPase-pH平衡信号通路的分子机制；小分子活性化合物对植物耐盐碱的作用机制；2. DNA甲基化调节的盐胁迫响应途1. 完成新的与盐驯等相关基因的生化特性分析；完成骨架动态与盐胁迫的功能关系的研究；分析MAP18等结合钙离子的微管结合蛋白在盐胁迫下的生理学功能，以及与钙信使的关系；确定钙信号在 SOS途径和 RCC途径调控关系；鉴定磷脂酸调节的 MPK或通道蛋白（载体）一个；确定ROP-RIC依赖的细胞骨架动态变化会参与对基因的表达调控；2. 分离盐胁迫响应的 miRNAs靶基因 2-3个；鉴定 DNA甲基化调节的目标基因 2-3个；得到过表达的转录因子转基因植株 5个以上株系的纯合体；鉴定节点基因2-3个，争取鉴定调控单元 1-2
