1、宁夏大学新华学院毕业论文（设计）（ 2013 届）题 目 滩羊卵母细胞体外 成熟体系建立 专 业 生物技术 年 级 2009 学生学号 12009248152 学生姓名 高欢 指导教师 李勇 滩羊卵母细胞体外成熟体系建立摘要在细胞核移植过程中，体细胞必须在卵母细胞内进行重编程以恢复其全能性，卵母细胞成熟度直接影响体细胞重编程，故卵母细胞体外成熟培养是体细胞核移植极其重要环节，而卵母细胞又受环境，培养液浓度，培养温度等影响。本实验通过探讨不同浓度的 FSH 和 LH 及 HMG 影响滩羊卵母细胞体外成熟因素的研究，建立滩羊卵母细胞体外成熟体系，为滩羊核移植及以后的优良育种奠定基础。关键词：卵母细
2、胞;FSH:LH;HMG;体外成熟；滩羊Reprogramming of somatic cell directly, so that oocytes in vitro maturation plays an extremely importomt role in nuclear transplantation of somatic cell. However ,oocytes are affected by environment, medium concentration, culture temperature and so on ; in the research we studied
3、 the effore of different density FSH and LH and mixture of FSH and LH, HMG density, on oocytes in vitro maturation in tan sheep and established a system of oocytes in vitro maturation in tan sheep, laying the foundation for advamced breeding and nuclear transplantation of tan sheepKeywords: vitro ma
4、turation; FSH ; LH ; HMG; tan sheep目录前言 .11 实验材料与方法 .41.1 实验材料 .41.2 主要仪器和耗材 .41.2.1 主要仪器 .41.2.2 试剂 .41.3 试验方法 .51.3.1 卵丘-卵母细胞复合体（ cumulus oocyte complexes, COCs）的收集： .51.3.2 卵丘-卵母细胞复合体的体外成熟培养： .51.3.3 卵母细胞体外成熟效果判断： .62.实验分析 .62.1 FSH 和 LH 对滩羊卵母细胞体外成熟的影响 .62.2 HMG 对卵母细胞体外成熟的影响 .83 讨论与分析 .104 结论： .1
5、1参考文献 .12谢词 .130前言 滩羊是我国独特的裘皮用绵羊品种，是国家二级保护品种，2001年被农业部列入第一批畜禽品种保护名录。其所产二毛皮毛色洁白，光泽悦目，花称美观。滩羊羔羊肉脂肪分布均匀，肉质细嫩,腥味小，是“宁夏羊肉”的代表，已享誉全国。宁夏是滩羊的主产区，在保护滩羊种质资源特色的同时，对滩羊繁育性能的改良是宁夏滩羊产业发展的共性需求 1。动物体细胞克隆技术为动物育种技术开辟了更广泛的途径，必将极大地提高动物育种的效率。也为我区动物育种产业的发展提过了技术支撑。在体细胞核移植中体细胞必须在卵母细胞内进行重编程以恢复其全能性，而卵母细胞的成熟度则会直接影响体细胞的重编程。所以卵母
6、细胞的体外成熟，作为体细胞核移植过程中的一个重要环节被人们关注。自Edwards R G Maturation通过体外培养使小鼠、绵羊、 猴、猪、牛、人 2等哺乳动物的卵母细胞在体外获得成熟后，许多科研工作者在卵母细胞的体外成熟上做了大量的工作，通过在卵母细胞体外培养液中添加血清 3、雌激素 4、FSH、LH 5等物质，使哺乳动物卵母细胞体外成熟率得到不断提高。随着卵母细胞体外培养技术日益成熟，体外成熟的卵母细胞正在广泛应用于体外受精，用于扩繁优良母畜。宁夏是滩羊的主产区，滩羊产业也是宁夏自治区畜牧业中的支柱产业之一，也是全区最具有发展潜力的优势特色产业。近几年，由于我区加快了从区外、国外引进
7、优良品种绵羊的速度，这虽然对发展我区养羊业、增加农民收入，确实起到了很大的促进作用，但也使我区的滩羊产业受到了极大的冲击。一方面，随着外来品种的引进，如何对滩羊繁育性能进行改良，提高其经济效益，增强宁夏滩羊产业的竞争力已成为宁夏滩羊产业发展的共性需求。在动物育种实践中，杂交、选种、选配等传统的育种方法曾发挥了重要作用，在品种改良、新品种育成、品系繁育和经济杂交等方面均获得了很大的成功。随着社会的发展，转基因技术、动物克隆技术和胚胎移植技术等现代生物技术突飞猛进，为动物育种技术开辟了更广泛的途径，必将极大地提高动物育种的效率。这些技术的发展及应用将为推动我区滩羊育种产业的发展奠定坚实的基础。另一
8、方面，由于我区滩羊保种工作严重滞后，优良纯种的滩羊越来越少，如何有效保护宁夏滩羊的种质资源已十分迫切。目前，我区的滩羊保种采用的是活体保存的方法，即靠维持一定数量的种群来完成，但受科研资金缺乏等因素的影响，其培育繁殖速率较为缓慢。而利用体细胞克隆技术，保存每一个体1的体细胞就可以完成这一保种工作，当需要时克隆出这些动物就可以了。这一技术彻底地改变了传统的动物保种方式，将为我国畜禽遗传资源的保护提供强有力的技术支撑。体细胞克隆技术为我区滩羊的种质资源能够得到有效的保护提供了一条新的途径与思路。不论转基因技术、动物克隆技术还是胚胎移植技术等都需要卵母细胞的体外成熟。卵母细胞体外成熟效果的好坏直接影
9、响到随后的技术操作质量及胚胎的发育潜力。目前, 获得成熟的卵母细胞通常有两种：一种是通过超排来获取母畜成熟的卵母细胞，此方法对母畜的伤害较大,不易经常使用；另一种方法是通过采集卵巢中未成熟的卵母细胞，在模拟体内的生长环境来促使卵母细胞在体外成熟的过程。这种方法可获得大量的成熟卵母细胞，而且可以选择质量高的卵母细胞。是目前大型哺乳类动物获得成熟卵母细胞较为常用的方法。卵母细胞的成熟是一个复杂的、动态的过程，有许多代谢事件发生，除了进行积极的mRNAs转录、蛋白质合成外，还有其他一些物质的降解。在体外成熟培养中，通常以第一极体的排出来判断卵母细胞的成熟，其实这只是核成熟的标志。除了核成熟外，卵母细
10、胞的胞质成熟也很重要，尤其是对用于核移植的卵母细胞而言，胞质的成熟直接关系到能否使供体核实现彻底的再程序化、重构胚能否维持正常的分裂发育。从这个意义上说，目前所用的卵母细胞成熟体系还不尽完善，一些对卵母细胞成熟和后续发育非常重要的物质不能完全合成。近年来，在卵母细胞体外成熟的研究中，人们的注意力主要集中在提高卵母细胞体外成熟及其支持胚胎发育的能力上。总体上看，主要包括基础培养液的改进、性激素的添加和其他成分的丰富。卵母细胞体外成熟中应用最广泛、效果稳定的基础培养液是TCM199。在牛和猪上，TCM199添加10%血清、促性腺激素和雌激素，活得了90%的成熟率。小鼠卵母细胞的体外成熟在CZB及K
11、-SOMaa中也可得到很好的效果。由于血清成分复杂，人们在合成培养液(如SOFM、KSOM)中添加BSA、PVA及氨基酸来替代血清，使卵母细胞成熟并能进行受精后的发育。 激素是卵母细胞成熟培养中的必不可少的成分，特别是促性腺激素，它对成熟的启动发挥主要作用。FSH和/或LH是成熟培养液中使用较多的促性腺激素。FSH（卵泡刺激素）是调节卵泡发育的一种重要激素，它能促进颗粒细胞加速有丝分裂并分泌卵泡液，从而使卵泡能够成熟排卵。鉴于在卵泡发育过程中的重要作用，FSH被广泛应用于哺乳动物卵母细胞体外成熟培养，并证实能够促进卵母细胞周围卵丘细胞的扩展。LH（黄体生成素）可使卵母细胞恢复减数分裂，成熟卵泡
12、分泌前列腺素（PGF 2a） 。因排卵前卵泡卵母细胞的成熟分裂恢复与LH2峰的时间基本一致，一般认为LH是卵母细胞体内成熟的诱导者。卵泡体外培养的研究结果亦表明，LH或HCG能诱导卵泡内卵母细胞成熟分裂的恢复。因此，LH被广泛用于卵母细胞的体外成熟培养，并证实能提高卵母细胞成熟后的胚胎发育能力特别是在无血清的条件下。此外，eCG/hCG与FSH/LH具有相似的效果，是小鼠、猪卵母细胞体外成熟中通常添加的激素；HMG（人尿促性素）是一种用于人临床的促性腺激素，含有1:1的FSH和LH，也能用于成熟培养。此外，各种动物卵母细胞成熟培养液中通常要添加E2（雌二醇） ，虽然在人卵母细胞的成熟中加入雌激
13、素有利于胞质成熟，但在其它动物的研究中更多的是得到相反的结论。另外，人们还通过添加一些生长激素（如GH、GHRH等） 、生长因子（EGF、IGF-I、NGF 、TGFb、激动素等）和其他添加物质如卵泡液、非离子型表面活性剂、副甲状腺素相关蛋白（PTHrP） 、成熟分裂激活物(MAS)等物质来提高卵母细胞的体外发育和成熟。本研究通过探讨滩羊卵母细胞在不同FSH、LH浓度下卵母细胞的体外成熟的效果，建立滩羊卵母细胞体外成熟培养体系，对滩羊的繁殖、育种提供科学依据，同时为滩羊的种质资源保护给予参考。31 实验材料与方法1.1 实验材料滩羊卵巢：采集于宁夏银川某屠宰场。1.2 主要仪器和耗材 1.2.
14、1 主要仪器倒置荧光显微镜：日本，OLMPUS，IX71 CO2 培养箱：上海旦鼎国际贸易有限公司 MM-02470-00 电热恒温板：美国 CT-946B离心机：上海安亭，KA-1000电子天平：德国，METTLER体视显微镜： 麦克奥迪 SMZ-168电热恒温鼓风干燥箱：上海 苏达实验仪器双重纯水蒸馏器：上海亚荣生化仪器厂超净工作台：江苏净化仪器制造厂 恒温水浴锅：北京长安科学仪器厂冰箱：容声 超低温冰箱：美国，FORMA SCIENTIFIC手术器械：山东新华医疗器械股份有限公司1.2.2 试剂 TCM199 购自 Gibco 公司，12340 11150青霉素、链霉素购自华北制药股份有
15、限公司，表皮生长因子：SIGMAE-4127转铁蛋白等三价因子(ITS)：SIGMAI-1884尿嘧啶：SIGMA，U-1128透明质酸酶：SIGMA，H3506肝素钠：苏州市苏牧动物药业有限公司核染色机：Hochest33342：SIGMA，B-2261BSA：SIGMA，A6003丙酮酸钠：SIGMA，P-4562L-谷氨酰胺 （L-Glutamine）：SIGMA，G31264LH： 宁波 第二激素厂FSH：宁波第二激素厂HMG：丽珠制药HEPES： SIGMA H-614717- E2：SIGMA，E88751.3 试验方法1.3.1 卵丘-卵母细胞复合体（cumulus oocyte
16、 complexes, COCs）的收集： 滩羊卵巢采集于牛羊屠宰场，从屠宰场刚宰杀的母羊体内剪下卵巢，保存在加有双抗（青霉素与链霉素）的 30-35灭菌生理盐水的保温瓶中，4h 内运回实验室用于试验。用预温 30-35的灭菌生理盐水清洗卵巢 3 遍，用剪刀进行修剪卵巢,减去多余的脂肪和结缔组织，以减少对实验的干扰。将处理好的卵巢放入盛有采卵液的平皿中，用无菌手术刀片切开卵巢表面 26mm 大小的卵泡，使之释放出卵泡液和 COCs。用排卵针捡取卵丘-卵母细胞复合体，检出的 COCs分为分为 A，B，C 3 级：A 级，卵丘细胞完整，卵母细胞胞质均匀；B 级，卵丘细胞不完整，卵母细胞胞质均匀；C
17、 级，卵母细胞裸露，或胞质略有退化。选择 A，B 级进行培养。采卵液：TCM199 + 1%FBS + 100mg/mL 肝素钠 + 100IU/mL 青霉素 + 100IU/mL 链霉素1.3.2 卵丘-卵母细胞复合体的体外成熟培养：将收集到的 A、B 级 COCs 用洗卵液清洗 3-4 次，然后置于预平衡 2 h3 h含 1 mL 成熟液的 U 型皿中，进行体外成熟培养。培养条件为 38.5，5 % CO 2饱和湿度，培养 22 h-24 h。洗卵液： TCM199+2 % FBS收集到的卵母细胞分 8 组,第一组用 TCM199 作为空白对照组，其他 7 组使用不同的培养液进行体外成熟培
18、养，同一实验组重复 3 次。对照组：TCM199 基础成熟液：TCM199 + 10mg/mL BSA + 1 ITS + 50g/mL 尿嘧啶 + 2.5mM 谷氨酰胺+1 mM 丙酮酸钠+ 50 g/mL EGF + 1g/mL -E 2OM ：基础成熟液+100 g/mL FSH+20 g/mL LHOM ：基础成熟液+200 g/mL FSH+40 g/mL LHOM ：基础成熟液+300 g/mL FSH+60 g/mL LHOM ：基础成熟液+0.05 IU/mL HMGOM ：基础成熟液+0.1 IU/mL HMGOM ：基础成熟液+0.15 IU/mL HMG5OM ：基础成熟
19、液+0.2 IU/mL HMG1.3.3 卵母细胞体外成熟效果判断：将成熟培养后的 COCs 置于含 0.3 %透明质酸酶的 D-PBS 液内，用移液器轻轻吹打以除去成熟卵母细胞表面的卵丘细胞。在体视显微镜下，以异物针拨动卵母细胞进行观察，观察第一极体是否排出，或使用含有 Hochest33342 的洗卵液染色，通过荧光显微镜观察是否有发光的极体分布于卵母细胞透明带以内。以排出第一极体的定为成熟，否则定为不成熟。2.实验分析2.1 FSH 和 LH 对滩羊卵母细胞体外成熟的影响在成熟液中添加不同浓度的 FSH 和 LH 对滩羊卵母细胞体外成熟有不同程度的影响，COCs 在体外培养 22 h 时
20、，都可以观察到卵丘细胞不同程度的扩散（图 1） 。随着添加激素浓度的升高，卵丘细胞扩散度增加，其中扩散直径，空白对照（图 1-A）300 g/mL，LH60 g/mL 时，卵丘细胞的扩散直径不再增加，这表明，添加激素对滩羊卵母细胞的卵丘细胞细胞扩散有着一定的影响作用。同时运用 imageJ2x 软件测定不同激素浓度下卵母细胞在卵丘细胞包裹中的投影计算激素对卵母细胞的影响。测定结果运用 SPSS 软件分析，结果表明不添加激素的对照组的扩散距离与 OM I、OM和 OM 的扩散距离差异性显著。OM I、OM和 OM 的扩散距离差异性不显著。但 OM中的卵母细胞扩增距离优于OM I 和 OM 中的卵
21、母细胞扩增距离，如图 2 显示6图 1：FSH 与 LH 对滩羊卵丘-卵母细胞复合体扩散度的影响（100）A对照组；B. OM中卵丘细胞的扩散；C. OM中卵丘细胞的扩散；D.OM 卵丘细胞的扩散Fig1 The effects of FSH and LH on Tan sheep Cumulus-oocyte complexes in vitro A control ;B Cumulus-oocyte complexes of OM;C Cumulus-oocyte complexes of OM ;D Cumulus-oocyte complexes of OM 图 2：不同 FSH 和 LH 激素浓度卵母细胞的扩增距离Figure 2: different FSH and LH hormone concentration of oocytes amplification distance表 1 不同 FSH 和 LH 浓度对滩羊卵母细胞体外成熟的影响Table1 Effects of FSH and LH on Tan sheep oocytes in vitro maturation组别Group 细胞数No. of oocytes成熟数No.of maturation oocyte成熟率（%）Maturation rate(%)
