1、厌氧氨氧化菌微生物特性研究进展 1 曾涛涛 1* 李 冬 2 谢水波 1,3 张 杰 2,4 1南华大学 污染控制与资源化技术湖南省高校重点实验室 衡阳 421001 2北京工业大学 水质科学与水环境恢复工程北京市重点实验室 北京 100124 3南华大学 铀矿冶生物技术国防重点学科实验室 衡阳 421001 4哈尔滨工业大学 城市水资源与水环境国家重点实验室 哈尔滨 150090 摘 要 与传统硝化反硝化生物脱氮技术相比，厌氧氨氧化 （ ANAMMOX） 技术是一种节能降耗的新型生物脱氮技术 。 ANAMMOX 菌是化能自养菌，其具有独特的生理生化特性及生物脱氮机理，已成为污水生物脱氮中的研
2、究热点。 本文 总结 了 环境 生态因子 ，包括基质浓度、温度和 pH、溶解氧及有机物对 ANAMMOX菌 活性的影响；介绍其独特的细胞结构、 生理生化特征 及 生态分布 特征；介绍氮素转换的 中心分解代谢途径 及电子传递系统，解释 ANAMMOX 生物脱氮 机理 ； 着重介绍 分子生物学技术，包括 荧光原位杂交（ FISH）、变性梯度凝胶电泳（ DGGE）、荧光定量 PCR及宏基因组技术在 ANAMMOX 菌 群落结构解析 、生态分布及基因功能检测中的应用。通过 对 ANAMMOX 菌微生物特性进行综述， 以期全面认识 ANAMMOX 菌的生命活动规律 ，为改善其生长 弊端 、扩大工艺在污水
3、处理中的应用提供理论基础 。图 2表 1参 38 关键词 厌氧氨氧化 菌 ；生物脱氮；微生物特性 CLC X703.1 Review for Microbial Properties of Anaerobic Ammonium Oxidation (ANAMMOX) Bacteria* ZENG Taotao1*, LI Dong2, XIE Shuibo1,3 biological nitrogen removal; microbial properties CLC X703.1 厌氧氨氧化 (anaerobic ammonia oxidation, ANAMMOX)是指在厌氧条件下 ， 以
4、亚硝酸氮为电子受体 、氨氮为电子供体的微生物反应 ， 最终产物为氮气 。与传统硝化反硝化生物脱氮技术相比，厌氧氨氧化技术理论上可以节约 62.5%的曝气量，无需外加碳源，污泥产量很少，还可以 减少 温室气体的排放，是一种节能降耗的新型生物脱氮技术，受到水处理工作者的广泛关注 1。目前， ANAMMOX 工艺已经成功应用于污泥消化液、垃圾渗滤液、味精废水以及猪场废水等高浓度含氮废水的处理 1-4，且达到生产性规模。 然而 ANAMMOX 菌 仍然存在 一些不足，比如还不能纯化培养、 生长缓慢（倍增时间约为 11 d）、对环境条件敏感、需要中温条件（ 30-40 ）、基质利用单一等 5， 严重制约
5、了 该 工艺的进一步发展。近年来，分子生物学技术的飞速发展，为揭示 ANAMMOX 菌生命活动规律提供了新的研究手段 6。本文在此介绍ANAMMOX 菌的生态因子、生理生化特征与生态分布、生化反应机理等最新研究成果， 着重 介绍荧光原位杂交（ FISH）、变性梯度凝胶电泳（ DGGE）、荧光定量 PCR及宏基因组技术 等分子生物学技术 在 ANAMMOX菌微生物特性研究中的应用 ，以期全面认识 ANAMMOX 菌的微生物生命活动规律，为厌氧氨氧化工艺的推广 应用提供理论基础。 1 影响 ANAMMOX菌的生态因子 ANAMMOX 菌为自养细菌，生长速率缓慢，容易受环境因素影响，研究发现基质浓度
6、、温度、 pH值、溶解氧浓度 （ DO） 及有机物等生态因子对 ANAMMOX 菌的生理活动影响明显。通过这些生态因子研究，有助于揭示适宜 ANAMMOX 菌发挥脱氮作用的生态位。 1.1 基质浓度 ANAMMOX菌以氨氮和亚硝酸氮为基质，但当氨和亚硝酸盐的浓度超过一定范围时，会对 ANAMMOX菌活性产生一定的抑制作用。 Strous 等 7研究指出，当 NO2-N 浓度超过 100mg/L时， ANAMMOX反应会受到抑制；在 100mg/L浓度下持续 12h， ANAMMOX微生物活性会完全丧失。 Dapena-Mora等 8发现 350 mg/L的亚硝酸盐可以使厌氧氨氧化活性降低 50
7、%，而浓度分别为 770 mg/L 和 630mg/L 的氨和硝酸盐也同样会导致厌氧氨氧化活性降低 50%。 1.2 温度和 pH值 微生物的最适温度是微生物保持旺盛生理活动和快速裂殖扩增的保障，而 ANAMMOX 反应则属于对温度变化较敏感的反应类型。一般认为， ANAMMOX 菌的温度范围为 20-43，最适温度在 30-40，在这 个温度范围内， ANAMMOX 菌活性较高。但最近一些研究发现，在低温条件下，经过驯化培养，ANAMMOX 菌也具有较高的活性 9, 10。 pH 值主要通过对微生物和基质产生作用来影响 ANAMMOX 反应。另外， pH 值可以通过影响废水中的游离氨（ FA
8、）和游离亚硝酸（ FNA）的浓度来影响 ANAMMOX 反应 11。 1.3 溶解氧（ DO） 厌氧氨氧化菌是严格厌氧菌，污水中的溶解氧会对 ANAMMOX 菌产生毒害作用、抑制其反应的正常进行。 Strous 等 6采用 SBR 工艺，通过厌氧 /好氧交替运行，研究了氧对 ANAMMOX反应的影响，结果表明在好氧条件（ 0.5%空气饱和度）下反应器没有出现厌氧氨氧化 反应 ，在厌氧条件下才观察到厌氧氨氧化现象，低浓度的氧对 ANAMMOX 活性产生的抑制作用是可逆的。 1.4 有机物 目前，有关厌氧氨氧化的研究主要针对高浓度氨氮的废水，且大多以实验室配水为主，以 HCO3-作为唯一碳源来富集
9、 ANAMMOX 菌。在实际的生活污水中均存在一定浓度的 COD，有机物的存在有利于异养菌的生长 繁殖 ，而 ANAMMOX 菌生长 受到影响 。最近有研究发现某些 ANAMMOX 菌种能以 NO2-N、NO3-N 作为电子受体将甲酸盐、丙酸盐等小分子有机酸氧化成 CO212，这些发现为低碳污水处理提供了新的思路。 2 ANAMMOX菌生理生化特征及生态分布 ANAMMOX 菌需要富集到一定数量（ 1011）才能发挥活性，在污水处理中， 反应器的启动过程实质上是 ANAMMOX 菌的活化和富集过程 。 研究 ANAMMOX 菌的生理生化及生态分布特征 ，可以了解适宜ANAMMOX 菌 适宜繁殖
10、的环境条件， 对厌氧氨氧化工艺的推广应用至关重要。依靠传统的划线分离方法并不能得到有活性的 ANAMMOX菌， Strous等在 1999年通过超声波温 和破碎 ANAMMOX菌的富集培养物，再进行密度梯度离心，从中纯化提取了 ANAMMOX 菌，它属于浮霉状菌目 (Planctomycetes)，被命名为“ Brocadia anammoxidans” 13。近年来 ， ANAMMOX 菌得到了更加深入的研究，其模式结构图如图 1 所示 14。 图 1 厌氧氨氧化菌细胞的 模式 结构图 14 Fig.1 Mode Structure of ANAMMOX bacterial cell14 A
11、NAMMOX 菌的细胞壁主要由蛋白质组成，不含肽聚糖，细胞膜中含有特殊的阶梯烷膜脂。ANAMMOX 细胞内主要由 3 部分组成：厌氧氨氧化体（ anammoxosome)、核糖细胞质（ riboplasm)及外室细胞质（ paryphoplasm)。厌氧氨氧化体是 ANAMMOX 菌所特有的结构，它由双层膜包围，该膜深深陷入厌氧氨氧化体内部。厌氧氨氧化体占整个细胞体积的 50%-80%， ANAMMOX 反应就在其内进行 15。 厌氧氨氧化菌属于分枝很深的浮霉菌 ， 目前已鉴定并暂时命名的厌氧氨氧化菌主要有 5 个属、 12 种ANAMMOX 菌 ， 它们为 Candidatus brocad
12、ia anammoxidans16、 Candidatus Kuenenia stuttgartiensis17、Candidatus Scalindua brodae18、 Candidatus Scalindua wagneri18、 Candidatus Brocadia fulgida19、 Candidatus Anammoxoglobus propionicus20、 Candidatus Jettenia asiatica21、 Candidatus Brocadia sinica22、 Candidatus Anammoxoglobus sulfate23、 Candidatu
13、s Scalindua sorokinii24、 Candidatus Scalindua profunda 和 Candidatus Scalindua arabic25。其中前 9种分离自淡水水体 ， 主要在污水处理厂构筑物或实验室反应器内发现 ， 后 3种来自海洋沉积物 （ 表 1） 26 。 它们具有许多共同的特征，如 均为 革兰氏阴性菌，细胞外无荚膜，直径0.8-1.2m；以二氧化碳为唯一碳源，通过将 NO2-氧化成 NO3-获得能量；对氧敏感，只能在氧分压低于 5%氧饱和浓度下生存； pH范围 6.7-8.3；温度范围 20-43 ；生长缓慢，倍增时间 10-30天； 细胞 富含血
14、红素，富集培养物呈红色； 能 分泌胞外多聚物，容易形成团聚体；由梯形脂类构成内膜系统 ，具有 特殊的内膜细胞器官 厌氧氨氧化体 。 表 1 厌氧氨氧化菌的种类 及来源 Table 1 Types and resources of ANAMMOX bacteria 菌属 Bacterial genus 菌种 Bacterial species 来源 Resources Brocadia Candidatus Brocadia Anammoxidans 污水处理厂 Wastewater treatment plant Candidatus Brocadia fulgida Candidatus B
15、rocadia sinica 污水处理厂 Wastewater treatment plant 脱氮反应器 Denitrification bioreactor Kuenenia Candidatus Kuenenia Stuttgartiensis 滴滤池 Trickling biofilter Scalindua Candidatus Scalindua broade 垃圾渗滤液处理厂 Landfill leachate treatment plant Candidatus Scalindua wagneri 垃圾渗滤液处理厂 Landfill leachate treatment pla
16、nt Candidatus Scalindua sorokinii Candidatus Scalindua Arabic Candidatus Scalindua profunda 海底沉积物 Marine sediments 海底沉积物 Marine sediments 海底沉积物 Marine sediments Anammoxoglobus Candidatus Anammoxoglobus propionicus SBR 反应器 SBR bioreactor Candidatus Anammoxoglobus sulfate 生物转盘反应器 Rotating biological r
17、eactor Jettenia Candidatus Jettenia asiatica 生物膜反应器 Biofilm reactor 3 ANAMMOX反应机理 对 ANAMMOX 反应机理进行研究，可以为 ANAMMOX 工艺的优化运行提供理论基础。 Jetten等在ANAMMOX 菌宏基因组及酶学研究基础上，提出了 ANAMMOX 菌的 代谢模型（见图 2） 14。由此模型可看出厌氧氨氧化主要代谢途径有 4步： Cyt cd1型亚硝酸还原酶（ Nitrite reductase， Nir） ，负责催化 NO2-还原成 NO；联氨水解酶（ Hydrazine Hydrolase， HH）
18、，负责催化 NO和 NH4+结合成 N2H4；联氨氧还酶（ Hydrazine Oxidoreductase， HZO） ，催化 N2H4氧化成 N2；亚硝酸盐氧化酶（ Nar） ，催化 NO2-氧化成NO3-。 上述反应发生的位置主要在厌氧氨氧化体（ Anammoxsome） 内，在第步 催化 N2H4氧化成 N2的过程中，会释放出 4个电子，它们在电子传递链上经过细胞色素 c、泛醌、细胞色素 bc1复合体以及其他细胞色素 c传递给 Nir（ 1个电子传递给 Nir）和 HH（ 3个电子传递给 HH） 。随着电子传递，相应地在厌氧氨氧化体（ Anammoxsome）膜外侧会出现质子梯度，用以
19、驱动 ATP 和 NADPH 合成。另外，由同位素示踪试验及宏基因组学研究结果推测， ANAMMOX 菌通过乙酰 -辅酶 A（ Acetyl-CoA）途径固定 CO227。 图 2 假定的 K stuttgartiensis 中心分解代谢和为乙酰 -CoA 代谢途径提供电子的途径 14. Fig.2 Hypothetical scheme showing a combination of the central catabolism of K. stuttgartiensis together with the nitrate reductase to generate low-redox-p
20、otential electrons for the acetyl-CoA pathway14. Nir 为亚硝酸盐还原酶； HH 为联氨水解酶； HZO 为联氨氧化酶； Nar 为硝酸盐还原酶； Q 为泛醌； fdh 为甲酸脱氢 酶； nuo 为泛琨氧化还原酶； QH2 为还原性泛醌； bc1 为细胞色素 bc1 复合体。 Nir: Nitrite reductase; HH: Hydrazine hydrolase; HZO: Hydrazine dehydrogenase; Q: Ubiquinone; fdh: Formate dehydrogenase; nuo: NADH:ubiq
21、uinone oxidoreductase; Q(H2): Reduced ubiquinone; bc1: bc1-complex 4 ANAMMOX菌分子生物学检测技术 分子生物学技术可以不依靠纯培养来研究 污水 系统中微生物群落特性，因而受到研究者青睐。目前 在ANAMMOX 菌群落特性研究 中 常用 的 分子生物学技术包括：荧光原位杂交技术（ FISH）、变性梯度凝胶电泳技术（ PCR-DGGE）、荧光实时定量 PCR技术（ real time Q-PCR）及宏基因组技术。 4.1 荧光原位杂交 荧光原位杂交（ Fluorescence In Situ Hybridization， F
22、ISH）的基本原理是利用带荧光标记的特异短核酸序列与靶 DNA或 RNA 同源互补，经变性 -退火 -复性，形成 DNA-DNA 或 DNA-RNA 杂交体，之后清洗掉多余探针，用荧光检测系统对目标 DNA进行定性、定量以及定位分析。 FISH 具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点，广泛应用于环境微生物研究。 目前文献有关于 ANAMMOX 菌的特异性探针 28。 Winkler 等 29利用 FISH 技术研究了厌氧颗粒污泥反应器内细菌的空间分布，结果发现反应器内 ANAMMOX 菌分布在颗粒污泥内部，氨氧化菌（ AOB）分布在颗粒污泥外部， Candidatu
23、s “Brocadia fulgida”为优 势 ANAMMOX菌属。随后对亚硝化 /厌氧氨氧化颗粒污泥（ AGS）和移动床生物膜反应器（ MBBR）微生物群落组成进行了比较研究 30，发现两反应器内均存在较多的 AOB 菌， 而 MBBR 中 异养菌比例 稍高；尽管进水含有挥发性脂肪酸（ VFAs），但两反应器ANAMMOX 菌所占比例较大， 经鉴定优势 菌属为 Candidatus “Brocadia fulgida”，其中 MBBR生物膜上还存在少量 Candidatus Anammoxoglobus propionicus” 类 ANAMMOX 菌。 4.2 变性凝胶梯度电泳技术 变性
24、梯度凝胶电泳技术 （ Denaturant gradient gel electrophoresis， DGGE） 是利用双链 DNA 片段熔解能力的不同，分离 PCR产物中长度相同但序列不同的 DNA 标记片段。该技术 具有速度快、重现性强、可靠性高、无须标记引物等特点，广泛用于解析微生物多样性及群落结构动态演变 。 笔者 通过 PCR-DGGE 技术 研究 了火山岩生物滤池中微生物群落结构 ， 发现 反应器内厌氧氨氧化菌种单一，经克隆测序鉴定为 Candidatus Kuenenia stuttgartiensis31。 王咨元等 32利用 PCR-DGGE和克隆测序技术，研究了国内某高氨
25、氮与低 COD 污 染河流河底生物带的群落结构，结果发现污染河流水 -气 -土界面存在很高的微生物多样性， 其中 ANAMMOX 菌属于 Candidatus “Brocadia“菌属 ， AOB与 ANAMMOX 菌在污染河流中共同发挥生物脱氮作用 。 4.3 荧光定量 PCR 技术 荧光定量 PCR技术（ real time Q-PCR） 是在 PCR反应体系中加入荧光分子，利用荧光信号的积累实时监测整个 PCR过程，然后利用标准曲线对未知模板进行定量分析。该技术具有灵敏度高、准确可靠、能实现多重反应、自动化程度高、无污染等特点。 该技术在 厌氧氨氧化工艺中 常用来检测 ANAMMOX 菌
26、随工艺运行的动态变化情况 。 Yapsakli k等 33通过 real time Q-PCR对 Bursa Hamitler垃圾渗滤液处理厂内脱氮微生物进行了研究，结果发现垃圾渗滤液处理厂内存在 AOB、 NOB、 氨氧化古菌（ AOA）及 ANAMMOX 多种脱氮微生物，ANAMMOX 菌种为 Candidatus Kuenenia stuttgartiensis。 马斌等 34通过升流式厌氧污泥床（ UASB）研究了常、低温条件下 ANAMMOX 工艺处理低氨氮生活污水的效果，结果发现即使在低温条件下（ 16），反应器内 ANAMMOX 菌依然保持较高的相对数量，达到 1.93 0.41
27、 109 copies/ml混合液。刘涛等 35研究了CANON 工艺在常温低氨氮基质条件下的宏观运行效能及功能微生物的群落特征，结果发现进水氨氮浓度对 ANAMMOX 菌群落 结构无明显影响 ， 而 ANAMMOX菌 群 丰度随氨氮浓度的降低而减少。 FISH、 PCR-DGGE、克隆测序与 real time Q-PCR技术 为 脱氮微生物检测 提供了便利 ， 研究者通常将多种技术结合使用 来 全面了解工艺中微生物群落结构与功能特性。 4.4 宏基因组技术 宏基因组（ Metagenomics）又称环境基因组 （ Environmental genomics)，该技术是以某一生态系统中所有
28、菌群的基因作为研究对象，通过筛选克隆文库来发现新功能基因及进行产物异源表达， 这种 直接研究系统中微生物基因组的结构与功能，为未培养微生物的认识和开发提供了可能，也为揭示环境中微生物的功能研究提供了新的 手段 6。宏基因组技术操作流程是：选取特定样品进行基因组 DNA 提取；将提取的基因组 DNA 连接到载体 ， 转化到宿主细菌构建基因组克隆文库；从基因组组文库中分析序列信息，筛选功能基因或进行产物异源表达。 ANAMMOX 菌是厌氧氨氧化的执行者，其生长代谢特性直接关系着氮素转化的效能。 Strous 等 36利用宏基因组技术对 Candidatus Kuenenia stuttgartie
29、nsis 的代谢途径与关键酶进行了研究，发现 ANAMMOX反应是以 NO为中间代谢产物，修正了之前基于 NH2OH 为中间代谢产物的反应模型。另外，对 ANAMMOX菌的电子传递链与 ATP合成机制有了更加深入的认识。 Gori等 37利用宏基因组技术对 Candidatus “Brocadia fulgida” 的关键酶基因进行了研究，结果发现 Candidatus “Brocadia fulgida” 包含许多与 Candidatus Kuenenia 菌属及 KSU-1 菌种 高度一致的关键基因，其中就有与氮素转化相关的关键酶基因：硝酸盐还原酶基因、联氨合成酶基因和联氨氧还酶基因。 v
30、an de Vossenberg等 38利用宏 基因组技术对海洋厌氧氨氧化菌种 Candidatus Scalindua profunda 进行了研究，发现其与淡水厌氧氨氧化菌种差别很大，在所注释的 4756个基因中，只有约一半的基因与 Candidatus Kuenenia stuttgartiensis 高度一致；该菌对基质（氨氮和亚氮）利用效率很高，在全球氮素循环中发挥重要作用。 通过这些研究，对厌氧氨氧化生物脱氮机理有了更深入的理解，有助于提高 ANAMMOX 菌的生物脱氮 效能 ，推动厌氧氨氧化工艺的深入发展。 5 展望 厌氧氨氧化是一种简捷的生物脱氮过程 , 能有效节约能源消耗 及
31、 基建投资费用 , 具有广 阔 的应用前景。但是由于 ANAMMOX 菌为自养微生物，生长缓慢，因而工艺启动时间较长，运行条件相对苛刻，这严重制约了 该技术 在工程实践中的应用。鉴于此，在影响 ANAMMOX 菌的生态因子方面需要开展更深入的研究，确定其适宜的生长条件；对 ANAMMOX 菌代谢途径进行深入研究，探索缩短其世代时间、利用多种基质的可能性，从而改善工程应用中其生长速率较慢、不能降解有机物 的弊端；开展 低温、低基质条件下ANAMMOX 菌生长代谢的研究，扩大工艺在污水处理中的应用范围。 参考文献 References 1 Ali M, Chai L Y, Tang C J, Zh
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