1、第一章 绪论细胞生物学研究的内容和现状 细胞生物学是现代生命科学的重要基础学科 细胞生物学的主要研究内容 当前细胞生物学研究的总趋势与重点领域 细胞重大生命活动的相互关系细胞学与细胞生物学发展简史 细胞的发现 细胞学说的建立其意义 细胞学的经典时期 实验细胞学与细胞学的分支及其发展 细胞生物学学科的形成与发展 细胞生物学的主要学术组织、学术刊物与教科书细胞生物学1、生命体是多层次、非线性、多侧面的复杂结构体系，而细胞是生命体的结构与生命活动的基本单位，有了细胞才有完整的生命活动。2、细胞生物学是研究细胞基本生命活动规律的科学，它是在不同层次（显微、亚显微与分子水平）上以研究 细胞结构与功能、细
2、胞增殖、分化、衰老与凋亡、细胞信号传递、真核细胞基因表达与调控、细胞起源与进化等为主要内容。核心问题是将遗传与发育在细胞水平上结合起来。美国科学情报研究所（ISI）1997年SCI（Science Citation Index）收录及引用论文检索，全世界自然科学研究中论文发表最集中的三个领域分别是： 细胞信号转导（signal transduction）； 细胞凋亡（cell apoptosis）； 基因组与后基因组学研究（genome and post-genomic analysis）。美国国立卫生研究院（NIH）在1988年底发表的一份题为什麽是当今科研领域的热门话题？的调查报告中指出，
3、目前全球研究最热门的是三种疾病：1、癌症（cancer）2、心血管病（cardiovascular diseases）3、爱滋病和肝炎等传染病（infectious diseases：AIDS，hepatitis）主要内容细胞结构与功能、细胞重要生命活动： 细胞核、染色体以及基因表达的研究 生物膜与细胞器的研究 细胞骨架体系的研究 细胞增殖及其调控 细胞分化及其调控 细胞的衰老与凋亡 细胞的起源与进化 细胞工程总趋势细胞生物学与分子生物学(包括分子遗传学与生物化学) 相互渗透与交融是总的发展趋势。重点领域染色体DNA与蛋白质相互作用关系主要是非组蛋白对基因组的作用细胞增殖、分化、凋亡的相互关系
4、及其调控细胞信号转导的研究细胞结构体系的组装五大研究方向：细胞周期调控（cell cycle control）；细胞凋亡（ cell apoptosis）；细胞衰老（cellular senescence）；信号转导（signal transduction）；DNA的损伤与修复（DNA damage and repair）“细胞学说”的基本内容1、认为细胞是有机体，一切动植物都是由细胞发育而来,并由细胞和细胞产物所构成；2、每个细胞作为一个相对独立的单位，既有它“自己的”生命,又对与其它细胞共同组成的整体的生命有所助益；3、新的细胞可以通过老的细胞繁殖产生。功能基因组学基因组学：1986年Th
5、omas Roderick （美）提出。指对所有基因进行基因组作图（包括遗传图谱、物理图谱、转录本图谱）、核苷酸序列分析、基因定位和基因功能分析的一门科学。功能基因组学：又往往被称为后基因组学（postgenomics），它利用结构基因组所提供的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使得生物学研究从对单一基因（蛋白质）的研究转向多个基因（蛋白质）同时进行系统的研究。 结构基因组学（structural genomics）基因组研究 以全基因组测序为目标功能基因组学（functional genomics)以基因功能鉴定为目标 细胞生物学发展简史（五个阶
6、段）一、细胞的发现1665年 Robert Hooke（英）(30)“cellar”cell1677年Leeuwen Hoek（荷兰）（300）活细胞观察，第一次观察到原生动物、人类和动物的精子。二、细胞学说的建立 18381839 Schleiden和Schwann（德）分别提出了细胞学说（cell theory）；基本内容:所有生物都是由一个或者多个细胞构成的；细胞是生命的基本单位。三、细胞学经典时期19世纪的后25年1、原生质理论的提出：protoplasm1861年，Max Schultze： 有机体的单位是一小团原生质，这种物质在一般有机体是相似的。2、细胞分裂的研究：有丝、减数分裂
7、；3、重要细胞器的发现。四、实验细胞学、细胞学分支及发展（19001953）experimental cytology用实验的手段研究细胞学的问题,即从形态结构的观察深入到生理功能、生物化学及遗传发育机理的研究。细胞遗传学、细胞生理学、细胞化学五、细胞生物学学科形成、发展（20世纪50年代）1858年Rodulf Virchow（德）对细胞学说进行了重要补充：细胞只能来自细胞。意义：19世纪自然科学三大发现之一；现代生物学三大基石之一。1953年DNA结构的发现分子生物学诞生；1965年，DPDerobetis将普通细胞学改为细胞生物学，标志着细胞生物学的诞生。新研究技术手段的促进：电子显微镜
8、、超薄切片、扫描隧道显微镜、细胞化学、分子生物学80年代：分子细胞生物学（Molecular Cell Biology）第二章 细胞基本知识概要第一节 细胞的基本概念细胞是生命活动的基本单位细胞概念的一些新思考细胞的基本共性第二节 非细胞形态的生命体病毒及其与细胞的关系病毒的基本知识病毒在细胞内增殖（复制）病毒与细胞在起源与进化中的关系第三节 原核细胞与真核细胞原核细胞（Prokaryotic cell）真核细胞（Eukaryotic cell）古细菌 （Archaebacteria ）1.细胞是生命活动的基本单位 一切有机体都由细胞构成，细胞是构成有机体的基本单位 细胞具有独立的、有序的自控
9、代谢体系，细胞是代谢与功能的基本单位 细胞是有机体生长与发育的基础 细胞是遗传的基本单位，细胞具有遗传的全能性 没有细胞就没有完整的生命2.细胞概念的一些新思考细胞是多层次非线性的复杂结构体系 细胞具有高度复杂性和组织性细胞是物质（结构）、能量与信息过程精巧结合的综合体 细胞完成各种化学反应； 细胞需要和利用能量； 细胞参与大量机械活动； 细胞对刺激作出反应；细胞是高度有序的，具有自组装能力与自组织体系。 细胞能进行自我调控； 繁殖和传留后代；3.细胞的基本共性1、所有的细胞表面均有由磷脂双分子层与镶嵌蛋白质构成的生物膜，即细胞膜。2、所有细胞都具有相似的化学组成。3、所有的细胞都含有两种核酸
10、：即DNA与RNA作为遗传信息复制与转录的载体。4、作为蛋白质合成的机器核糖体，毫无例外地存在于一切细胞内。5、所有细胞的增殖都以一分为二的方式进行分裂。7.原核细胞基本特点： 遗传的信息量小，遗传信息载体仅由一个环状DNA构成； 细胞内没有分化为以膜为基础的具有专门结构与功能的细胞器和细胞核膜。主要代表： 支原体（mycoplast）目前发现的最小最简单的细胞； 细菌拟核（nucleoid）、细胞质膜的多功能性、中膜体、细胞壁、核糖体、质粒;芽孢、鞭毛、荚膜。 蓝藻又称蓝细菌（Cyanobacteria）中心质、光合片层（含有各种藻胆蛋白，如藻蓝蛋白，藻红蛋白）8.真核细胞真核细胞的基本结构
11、体系 蛋白质和脂质构建的膜相结构体系 （细胞膜、核膜、各种细胞器膜）； 蛋白质和核酸构建的遗传信息结构体系（染色体、核仁、核糖体）；4.病毒的基本知识病毒（virus）核酸分子（DNA或RNA）与蛋白质构 成的核酸-蛋白质复合体；根据病毒的核酸类型可以将其分为两大类：DNA病毒与RNA病毒（无论是DNA还是RNA，均有单链和双链的区别） 类病毒（viroid）仅由感染性的RNA构成； 朊病毒（prion） 仅由感染性的蛋白质亚基构成；5.病毒在细胞内增殖（复制） 病毒侵入细胞，病毒核酸的侵染 病毒核酸的复制、转录与蛋白质的合成 病毒的装配、成熟与释放6.病毒与细胞在起源与进化中的关系病毒是非细
12、胞形态的生命体，它的主要生命活动必须要在细胞内实现。病毒与细胞在起源上的关系，目前存在3种主要观点： 生物大分子-病毒-细胞 生物大分子-病毒/细胞 生物大分子-细胞-病毒由于：1.病毒的寄生性；2.某些病毒的核酸同细胞DNA的序列相似性；3.病毒同核蛋白分子的相似性；4.第二类反转录转座子两端LTR与反转录病毒的相似性。 蛋白质和蛋白质构建的细胞骨架结构体系（微管、微丝、中间纤维）细胞的大小及其分析细胞表面积与体积的关系 为何细胞体积微小？1、对较大的表面积，有利于物质的交换和保持新陈代谢；2、保证遗传指令的对细胞的控制；3、保证细胞中物质的传递。9.原核细胞与真核细胞的比较 原核细胞与真核
13、细胞结构与功能的比较 原核细胞与真核细胞的遗传结构装置和基因表达的比较10.植物细胞与动物细胞的比较细胞壁 液泡 叶绿体11.古细菌 古细菌（archaebacteria）与真核细胞曾在进化上有过共同历程主要证据（1）细胞壁的成分：与真核细胞一样，而非由含壁酸的肽聚糖构成，因此抑制壁酸合成的链霉素，抑制肽聚糖前体合成的环丝氨酸，抑制肽聚糖合成的青霉素与万古霉素等对真细菌类有强的抑制生长作用，而对古细菌与真核细胞却无作用。（2）DNA与基因结构：古细菌DNA中有重复序列的存在。此外，多数古核细胞的基因组中存在内含子。（3）有类核小体结构：古细菌具有组蛋白，而且能与DNA构建成类似核小体结构。（4
14、）有类似真核细胞的核糖体：多数古细菌类的核糖体较真细菌有增大趋势，含有60种以上蛋白，介于真核细胞（7084）与真细菌（55）之间。抗生素同样不能抑制古核细胞类的核糖体的蛋白质合成。（5）5 S rRNA：根据对5 S rRNA的分子进化分析，认为古细菌与真核生物同属一类，而真细菌却与之差距甚远。5 S rRNA二级结构的研究也说明很多古细菌与真核生物相似。 除上述各点外，根据DNA聚合酶分析，氨基酰tRNA合成酶的作用，起始氨基酰tRNA 与肽链延长因子等分析，也提供了以上类似依据，说明古细菌与真核生物在进化上的关系较真细菌类更为密切。因此近年来，真核细胞起源于古细菌的观点得到了加强。第三章
15、 细胞生物学研究方法第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术细胞的培养细胞工程 细胞融合与细胞杂交技术 单克隆抗体技术 细胞拆合与显微操作技术 物理法结合显微操作技术 化学法结合离心技术 制备核体和胞质体第一节 细胞形态结构的观察方法光学显微镜技术 普通复式光学显微镜技术 荧光显微镜技术 激光共焦扫描显微镜技术 相差显微镜和微分干涉显微镜 荧光漂白技术 荧光共振能量转移技术 录像增差显微镜技术电子显微镜技术 电子显微镜的基本知识 电镜与光镜的比较 电镜与光镜光路图比较 电子显微镜的基本构造 主要电镜制样技术负染色技术冰冻蚀刻技术超薄切片技术电镜三维重构技术 扫描电镜 扫描探针显微镜扫描遂道显微
16、镜 第二节 细胞组分的分析方法离心分离技术细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法特异蛋白抗原的定位与定性细胞内特异核酸的定位与定性放射自显影技术 定量细胞化学分析技术1.扫描遂道显微镜（Scanning Probe Microscope,SPM)(80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器) 包括：STM、AFM、磁力显微镜、摩擦力显微镜等 原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，如量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等，并在计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。 装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和
17、数据采集、处理、显示系统。 特点：（1）可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算2.普通复式光学显微镜技术组成：光学放大系统、照明系统、机械系统；性能参数：放大倍数、分辨力、清晰度、焦点深度、镜像亮度等，其中最重要的是分辨力。分辨力（分辨率、分辨本领）：能分辨两个物点之间最短距离的能力。该距离越小，则分辨力越高。显微镜的分辨力计算公式：普通光镜分辨极限最大值140；最小波长450nm；N最大值1.5；因此普通光镜的分辨力极限为0.2微米，此数值亦为显微水平和亚微水平的分界点。（称为瑞利极限，Rayleigh limit）普通光镜有效放大倍数（经验值）物镜最大镜口率1000提高光学显微镜分辨力的手段，
18、且分辨本领高（侧分辨率为0.10.2nm，纵分辨率可达0.01nm）；（2）可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息；（3）可在真空、大气、液体等多种条件下工作；非破坏性测量。（4）可连续成像，进行动态观察用途：纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的结构。a、缩短照明光线波长；b、应用特殊光学效应，增强反差。光镜样本制作：固定：使用固定剂（fixative）杀死细胞，并使细胞结构尽可能接近活细胞；脱水：乙醇 包埋：石蜡 切片：切片机脱蜡与染色：多种染料 封片：长期保存3.荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy）原理与应用以紫外光为光源，激发标本中的
19、荧光物质产生荧光，从而对某些物质进行定性和定位分析。 直接荧光标记技术 间接免疫荧光标记技术 在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位：如绿色荧光蛋白(GFP)的应用4.激光共焦扫描显微镜技术（Laser Scanning Confocal Microscopy） 原理： 应用：排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率(1.41.7)，可重构样品的三维结构。5.荧光共振能量转移技术（FRET）原理：采用非放射方法，在供体和受体的很近相互靠的很近时，将光子能从一个受激发的荧光团（供体）转移到另一个荧光团（受体）。应用：用于检测体内两种蛋白质之间的直接相互作用，可以选择供体蛋白CFP
20、和受体蛋白YFP分别与两种目的蛋白融合表达。当这两种融合蛋白之间的距离在5-10nm的范围内，供体发出的荧光会激发受体发出荧光。根据测量供体荧光强度的损失量来确定两个蛋白之间是否相互作用。6.相差和微分干涉显微镜 相差显微镜（phase-contrast microscope）将光程差或相位差转换成振幅差，可用于观察活细胞 微分干涉显微镜（differential-interference microscope）偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究活细胞中较大的细胞器 录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy）
21、计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活细胞中的颗粒及细胞器的运动 倒置显微镜和倒置微分干涉显微镜：倒置显微镜：用于观察培养的细胞；倒置微分干涉显微镜：用于显微操作。7.荧光漂白技术（FRAP）原理：应用：进行生物膜脂质分子侧向扩散的研究，胞间通讯的研究，胞浆及细胞器内小分子物质转移性的观测。9. 离心分离技术用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物差速离心：分离密度不同的细胞组分密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离（又可分为速度沉降和等密度沉降两种：前者用于分离密度相近而大小不一的细胞组分，后者用于分离密度不同的细胞组分）10. 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法原理：利用
22、一些显色剂与所检测物质中一些特殊8.主要电镜制样技术超薄切片技术 用于电镜样本制作负染色技术（Negative staining ）与金属投影染色背景，衬托出样品的精细结构冰冻蚀刻技术（Freeze etching ） （技术示意图）又称冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。电镜三维重构技术电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学（Structural Biology）主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。 扫描电镜原理与应用： 电
23、子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成象。 CO 2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力问题扫描电镜的特点：基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。福尔根（Feulgen）反应显示DNA；格莫瑞（Gomori）反应显示碱性磷酸酶；PAS 反应确定多糖的存在；米伦（million）反应检测蛋白质；苏丹或者四氧化锇证明脂肪存在；可观察较大较厚的样品；景深大，获得的是清晰逼真的三维立体图像；放大倍数在2020万倍间连续变换，无需多次聚焦；样品可在样品室内多方位移动和转动；分辨力不太高：310nm只能观察标本表面，不能观察
24、内部。12.细胞内特异核酸的定位与定性 光镜水平的原位杂交技术 （同位素标记或荧光素标记的探针）荧光原位杂交 FISH 电镜水平的原位杂交技术 （生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）11.特异蛋白抗原的定位与定性 免疫荧光技术：快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限 蛋白电泳(SDS-PAGE) 免疫印迹反应(Western-Blot) 免疫电镜技术： 免疫铁蛋白技术 免疫酶标技术 免疫胶体金：目前最受欢迎的方法，优点在于：金属颗粒容易识别，分辨率高，既可用于超薄切片又可用于组装制备的骨架成分和膜系统蛋白成分的标记。13.放射自显影技术原理及应用：利用同位素的放射自显影，对细胞内
25、生物大分子进行定性、定位与半定量研究；（实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。）步骤： 前体物掺入细胞（标记：持续标记和脉冲标记） 标记后的细胞按常规方法切片，在暗盒中曝光数天后显影，定影，细胞中银颗粒所在位置即为同位素标记的位置。14定量细胞化学分析技术 细胞显微分光光度术（Microspectrophotometry）原理：利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。包括：紫外光显微分光光度测定法可见光显微分光光度测定法 流式细胞仪（Flow Cytometry ） 主要应用： 用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量； 测定细胞群
26、体中不同时相细胞的数量； 从细胞群体中分离某些特异染色的细胞； 分离DNA含量不同的中期染色体。 15.细胞的培养动物细胞培养类型：原代培养细胞（primary culture cell）传代培养细胞（sub-culture cell）细胞株（cell strain） 正常二倍体，接触抑制细胞系（cell line） 亚二倍体，接触抑制丧失植物细胞类型： 原生质体培养 （体细胞培养）单倍体细胞培养（花药培养） 非细胞体系（cell-free system） 第四章 细胞质膜第十五章 细胞社会的联系：细胞连接、细胞黏着和细胞外基质第四章第一节 细胞质膜一细胞质膜的结构模型二膜脂生物膜的基本组成成
27、分第十五章第一节 细胞连接一封闭连接二锚定连接三膜蛋白 确定膜蛋白方向的实验程序 荧光漂白恢复技术 分子生物学技术在膜蛋白研究上的应用第二节 生物膜的基本特征与功能一 膜的流动性二膜的不对称性三细胞质膜的基本功能第三节 膜骨架一 膜骨架二红细胞的生物学特性三红细胞质膜蛋白及膜骨架 膜骨架与细胞表面的特化结构三通讯连接 第二节 细胞黏着及其分子基础一 钙粘蛋白二选择素三免疫球蛋白超家族四整联蛋白第三节 细胞外基质一 胶原二弹性蛋白三糖胺聚糖和蛋白聚糖四纤连蛋白和层粘连蛋白五基膜和细胞外被六植物细胞壁2.膜的流动性1、膜脂的流动性膜脂的流动性主要由脂分子本身的性质决定的：脂肪酸链越短，不饱和程度越
28、高,膜脂的流动性越大。温度对膜脂的运动有明显的影响。在细菌和动物细胞中常通过增加不饱和脂肪酸的含量来调节膜脂的相变温度以维持膜脂的流动性。在动物细胞中，胆固醇对膜的流动性起重要的双向调节作用。 2、膜蛋白的流动荧光抗体免疫标记实验成斑现象(patching)或成帽现象(capping) 3、膜的流动性受多种因素影响：细胞骨架不但影响膜蛋白的运动，也影响其周围的膜脂的流动。膜蛋白与膜脂分子的相互作用也是影响膜流动性的重要因素1.胞质膜的结构模型结构模型E.Gorter和FGrendel（1925）:“蛋白质-脂类-蛋白质”三夹板质膜结构模型J.D.Robertson（1959年）：单位膜模型(u
29、nit membrane model) S.J.Singer和G.Nicolson（1972）：生物膜的流动镶嵌模型(fluid mosaic model)K.Simons et al(1997): 脂筏模型（lipid rafts model）Functional rafts in Cell membranes. Nature 387:569-572目前对生物膜的认识归纳1、具有极性头部和非极性尾部的脂质分子在水相中具有自发形成封闭的膜系统的性质。磷脂分子以疏水性尾部相对，极性头部朝向水相形成脂双分子层，它是组成生物膜的基本结构成分，尚未发现在生物膜结构中起组织作用的蛋白。但在脂筏中存在某些
30、有助于其结构相对稳定的功能蛋白。2、蛋白质分子以不同的方式镶嵌在脂双层分子中或结合在其表面，蛋白的类型、蛋白分布的不对称性及其与脂分子的协同作用赋予生物膜分子的特性与功能。3、生物膜可看成是在双层脂分子中嵌有蛋白质的二维溶液。然而膜蛋白与膜脂之间，膜蛋白与膜蛋白之间及其与膜两侧的其他生物大分子的复杂的相互作用，在不同程度上限制了膜蛋白和膜脂的流动性，同时也形成了赖以完成多种膜功能的脂筏等结构。3、膜的不对称性细胞质膜各部分的名称 细胞外表面（ES）；原生质表面（PS）；细胞外小页断裂面（EF）；原生质小页断裂面（PF）；膜脂与糖脂的不对称性糖脂仅存在于质膜的ES面，是完成其生理功能的结构基础膜
31、蛋白与糖蛋白的不对称性 膜蛋白的不对称性是指每种膜蛋白分子在细胞膜上都具有明确的方向性； 糖蛋白糖残基均分布在质膜的ES面(GO+ 3HBH4 labeling)； 膜蛋白的不对称性是生物膜完成复杂的在时间与空间上有序的各种生理功能的保证。4.膜脂成分磷脂：膜脂的基本成分（50以上）分为二类: 甘油磷脂和鞘磷脂 主要特征：具有一个极性头和两个非极性的尾（心磷脂除外）；脂肪酸碳链碳原子为偶数,多数碳链由16,18或20个组成；饱和脂肪酸(如软脂酸)及不饱和脂肪酸(如油酸)；糖脂：糖脂普遍存在于原核和真核细胞的质膜上（5以下）,神经细胞糖脂含量较高；胆固醇：胆固醇存在于真核细胞膜上（30%以下），
32、细菌质膜不含有胆固醇，但某些细菌的膜脂中含有甘油脂等中性脂类。运动方式：沿膜平面的侧向运动（基本运动方式）,其扩散系数为10 -8cm2/s；脂分子围绕轴心的自旋运动；脂分子尾部的摆动； 双层脂分子之间的翻转运动，发生频率还不到脂分子侧向交换频率的10 10 。但在内质网膜上,新合成的磷脂分子翻转运动发生频率很高。脂质体（liposome）脂质体是根据磷脂分子可在水相中形成稳定的脂双层膜的趋势而制备的人工膜。脂质体的应用研究膜脂与膜蛋白及其生物学性质；脂质体中裹入DNA可用于基因转移；在临床治疗中,脂质体作为药物或酶等载体6.去垢剂是一端亲水、另一端疏水的两性小分子,是分离与研究膜蛋白的常用试
33、剂。离子型去垢剂(SDS)：不仅使CM崩解，半破坏并使膜蛋白变性非离子型去垢剂（Triton X-100）：使CM溶解，不使蛋白变性7.确定膜蛋白方向的实验程序 胰酶消化法 同位素标记法8.荧光漂白恢复技术(fluorescence recovery after photobleaching, FRAP) 研究膜蛋白或膜脂流动性的基本实验技术之一。 程序：用荧光素标记膜蛋白或者膜脂，然后用激光束照射细胞表面某一区域，使被照射区的的荧光淬灭变暗。由于膜的流动性，淬灭区域亮度会逐渐增加并恢复。根据荧光恢复的速度可推算出膜蛋白或膜脂扩散速度。5.膜蛋白基本类型外在 (外周)膜蛋白水溶性蛋白,靠离子键
34、或其它弱键与膜内表面的蛋白质分子或脂分子极性头部非共价结合，易分离。内在（整合）膜蛋白水不溶性蛋白，形成跨膜螺旋，与膜结合紧密，需用去垢剂使膜崩解后才可分离。脂质锚定蛋白通过磷脂或脂肪酸锚定，共价结合。内在膜蛋白与膜脂结合的方式膜蛋白的跨膜结构域与脂双层分子的疏水核心的相互作用。（跨膜结构域常含有疏水氨基酸残基形成螺旋，其外部的疏水侧链与脂双层分子相互作用，内部的极性侧链则形成通道；某些跨膜结构域不形成螺旋，而是反向平行的折叠片）跨膜结构域两端携带正电荷的氨基酸残基与磷脂分子带负电的极性头形成离子键，或带负电的氨基酸残基通过Ca2+、Mg2+等阳离子与带负电的磷脂极性头相互作用。某些膜蛋白在细
35、胞质基质一侧的半胱氨酸残基上共价结合脂肪酸分子,插入脂双层之间,进一步加强膜蛋白与脂双层的结合力,还有少数蛋白与糖脂共价结合。9.细胞质膜的功能 为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境； 选择性的物质运输,包括代谢底物的输入与代谢； 产物的排除,其中伴随着能量的传递； 提供细胞识别位点,并完成细胞内外信息跨膜传递； 为多种酶提供结合位点,使酶促反应高效而有序地进行； 介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接； 质膜参与形成具有不同功能的细胞表面特化结构； 膜蛋白常与某些遗传病、恶性肿瘤，甚至神经退行性疾病相关，很多膜蛋白可以作为疾病治疗的药物靶标； 脂筏与胞膜窖在细胞的物质运输和信息传递中起重要作用
36、。10.膜骨架与细胞表面的特化结构细胞质膜常常与膜下结构(主要是细胞骨架系统)相互联系，协同作用, 并形成细胞表面的某些特化结构以完成特定的功能。 膜骨架膜骨架的概念指细胞质膜下与膜蛋白相连的由纤维蛋白组成的网架结构,它参与维持细胞质膜的形状并协助质膜完成多种生理功能。红细胞的生物学特性膜骨架赋予红细胞质膜既有很好的弹性又具有较高强度。 红细胞质膜蛋白及膜骨架当红细胞经过低渗处理后，质膜破裂，同时释放出血红蛋白和胞内其他可溶性蛋白。这是红细胞仍然保持原来的基本形状和大小，这种结构称红细胞影，或血影。11. 红细胞膜骨架的结构、人红细胞膜蛋白SDSPAGE电泳分布（P98图）、红细胞膜内存在的蛋
37、白质约15种，其中主要的有3种:1.血影蛋白：又叫收缩蛋白，是膜骨架主要成分，,亚基构成，非膜蛋白；2.血型糖蛋白A：红细胞膜蛋白，富含唾液酸，类似的还有血型糖蛋白B,C.D，单次跨膜蛋白；3.带3蛋白：膜蛋白，“阴离子通道”；多次跨膜（1214次）肌动蛋白：又称带5蛋白，是膜骨架的主要成分，肌动蛋白纤维上有多个与血影蛋白结合的位点。锚定蛋白：又称带2.1蛋白，一方面连接血影蛋白，一方面连接带3蛋白；带4.1蛋白：膜骨架成分，促使血影蛋白和肌动蛋白结合；、红细胞膜骨架的组成：(血影蛋白，肌动蛋白，锚蛋白，带4.1蛋白)血影蛋白在带4.1蛋白的协助下与肌动蛋白结合成膜骨架基本网络；锚定蛋白与血影
38、蛋白、带3蛋白相互作用。12.细胞连接的功能分类封闭连接(occluding junctions) 紧密连接(tight junction)锚定连接(anchoring junctions)与中间纤维相关的锚定连接：桥粒(desmosome)半桥粒(hemidesm osome);与肌动蛋白纤维相关的锚定连接：粘合带(adhesion belt)；粘合斑(focal adhesion)通讯连接(communicating junctions) 间隙连接(gap junction)； 神经细胞间的化学突触(chemical synapse)； 植物细胞中的胞间连丝(plasmodesmata)。
39、 封闭连接紧密连接是封闭连接的主要形式，存在于上皮细胞之间紧密连接的结构：成串的跨膜蛋白紧密连接的功能形成渗漏屏障，起重要的封闭作用（血脑屏障，血睾屏障等）；限制膜蛋白和膜脂的流动性，使游离端与基底面质膜上的膜蛋白行使各自不同的膜功能；支持功能紧密连接嵴线 中的两类蛋白：封闭蛋白（occludin），跨膜四次的膜蛋白（60KD）；claudin蛋白家族（现已发现20种） 粘连分 子胞外蛋白胞内蛋白 细胞骨架桥粒钙粘蛋白相邻细胞的钙粘蛋白桥粒斑珠蛋白、桥粒斑蛋白中间纤 维细胞与细胞连接粘合带钙粘蛋白相邻细胞的钙粘蛋白连环蛋白，纽蛋白，-辅肌动蛋白微丝半桥粒整联蛋白层粘连蛋白致密斑 中间纤 维细胞
40、与基质连接粘合斑整联蛋白外基质蛋白踝蛋白，-辅肌动蛋白，纽蛋白等微 丝 通讯连接 间隙连接：分布广泛，几乎所有的动物组织中都存在间隙连接。 神经细胞间的化学突触：存在于可兴奋细胞之间的细胞连接方式,它通过释放神经递质来传导神经冲动。胞间连丝：高等植物细胞之间通过胞间连丝相互连接,完成细胞间的通讯联络。胞间连丝结构 ：相邻细胞质膜共同构成的直径20-40nm的管状结构胞间连丝的功能：实现细胞间由信号介导的物质有择性的转运；实现细胞间的电传导；在发育过程中，胞间连丝结构的改变可以调节植物细胞间的物质运输。 锚定连接锚定连接在组织内分布很广泛,在上皮组织,心肌和子宫颈等组织中含量尤为丰富。1、桥粒（
41、desmosome）桥粒是中间纤维连接相邻细胞的方式。细胞间形成的纽扣状结构，将相邻细胞膜锚接在一起（间隙约30nm）。分布：承受强拉力的组织中，主要是上皮组织，如皮肤、口腔、食管、心肌中。-中间纤维直接与质膜下的盘状致密斑连接；-相邻两细胞之间的盘状致密斑由跨膜连接钙粘蛋白相互连接。2、半桥粒（ hemidesmosome ）是中间纤维连接细胞外基质的方式，形如半个桥粒。它将上皮细胞固着在基膜上。-通过跨膜整联蛋白与胞外基质的层粘连蛋白将上皮细胞固着在基底膜上。3、粘合带（adhesion belt） 是肌动蛋白纤维连接细胞的方式。呈连续带状环绕细胞，位于某些细胞紧密连接的下方。-细胞间隙约
42、为30nm，其间由Ca 2+依赖的跨膜钙粘蛋白形成胞间横桥相连接。-与粘着带相连的微丝在细胞中形成平行于细胞膜的可收缩的纤维束。4、粘合斑是肌动蛋白纤维与细胞外基质之间的连接方式。-参与连接的是整联蛋白。 间隙连接 间隙连接结构 间隙连接处相邻细胞质膜间的间隙为23nm 。 连接子(connexon) 是间隙连接的基本单位。每个连接子由6个跨膜连接蛋白分子组成。连接子中心形成一个直径约1.5nm的孔道。 连接单位由两个连接子对接构成。 间隙连接的蛋白成分 已分离20余种构成连接子的蛋白,属同一蛋白家族,其分子量2660KD不等；连接子蛋白具有4个-螺旋的跨膜区，是该蛋白家族最保守的区域。连接子
43、蛋白的一级结构都比较保守, 并有相似的抗原性。不同类型细胞表达不同的连接子蛋白，间隙连接的孔径与调控机制有所不同。 间隙连接的通透性是可以调节的 间隙连接对小分子物质的通透能力具有底物选择性； 降低胞质中的pH值和提高自由Ca 2+的浓度都可以使其通透性降低； 间隙连接的通透性受两侧电压梯度的调控及细胞外化学信号的调控； 间隙连接的功能及其调节机制 间隙连接在代谢偶联中的作用间隙连接允许小分子代谢物和信号分子通过 , 是细胞间代谢偶联的基础代谢偶联现象在体外培养细胞中的证实 代谢偶联作用在协调细胞群体的生物学功能方面起重要作用.间隙连接在神经冲动信息传递过程中的作用电突触(electronic
44、 junction) 快速实现细胞间信号通讯 间隙连接调节和修饰相互独立的神经元群的行为间隙连接在早期胚胎发育和细胞分化过程中的作用胚胎发育中细胞间的偶联提供信号物质的通路 , 从而为某一特定细胞提供它的“位置信息”，并根据其位置影响其分化。肿瘤细胞之间间隙的连接明显减少或消失，间隙联接类似“肿瘤抑制因子”。 13.细胞表面的粘连分子 同种类型细胞间的彼此粘连是许多组织结构的基本特征。细胞与细胞间的粘连是由特定的细胞粘连分子所介导的。 粘连分子的特征与类型粘连分子均为整合膜蛋白，在胞内与细胞骨架成分相连；多数要依赖Ca 2+或Mg 2+才起作用。粘连分子类型及细胞间粘着方式 粘着方式：1.同亲
45、性结合；2.异亲性结合；3. 衔接分子依赖性结合。 类型 ：1、 钙粘蛋白（Cadherins） 同亲性依赖于Ca2的细胞粘连糖蛋白。 胞外部分形成5个结构域，均含Ca2结合部位。分类：分布广泛，家族成员众多，如：E 钙粘素（表皮）、N 钙粘素（神经）、P 钙粘素（胎盘）等；作用：细胞连接；参与细胞分化。2、选择素（Selectin） 异亲性CAM，能识别并结合另一细胞表面伸出的特异糖基团（依赖于Ca2+）；结构：细胞外片段末端具有凝集素结构域；作用：参与白细胞在炎症（或血块）部位与血管壁细胞之间的识别与粘合；分类：P-选择素：在血小板、内皮细胞中表达；E-选择素：内皮细胞表达；L-选择素：各
46、种白细胞中表达。3、免疫球蛋白超家族的CAM(Ig-Superfamily，IgSF) Ig-SF指分子结构中含有免疫球蛋白（Ig）样结构域的细胞黏着分子； 一般不依赖于Ca2，包括同亲性或亲异性CAM作用：介导淋巴细胞和需要进行免疫反应的细胞之间的粘着；介导同亲性细胞粘着或介导异亲性细胞粘着,但其粘着作用不依赖Ca 2+，其中N-CAMs 在神经组织细胞间的粘着中起主要作用。 4、整联蛋白（Integrins）多为异亲性细胞粘附分子。作用依赖于Ca2。Cell外的球形头部露出脂双分子层，头部可同细胞外基质蛋白结全，而细胞内的尾部同肌动蛋白相连；整联蛋白的两个亚基和链都是糖基化的，并通过非共价键结合在一起，整联蛋白同基质蛋白的结合，需要二价氧离子，如Ca2+，Mg2+等的参与，有些细胞外基质可被多种整联蛋白识别。功能： 介导细胞与胞外基质的粘着,“RGD序列”； 介导从细胞外环境到胞内的信号转导（由外向内，由内向外） 依赖于酪氨酸蛋白激酶的信号转导粘合斑激酶FAK。（注意：质膜整合蛋白聚糖也介导细胞间的粘着。）补充：粘着方式(见第二版) 细胞中主要的粘连分子家族 与细胞锚定连接相关的粘连分子（2种） 非锚定连接（nonjunctional adhesion）的细胞粘连分子及其作用部位（5种）
