1、崇州医院细胞治疗中心 标准操作程序CIK 细胞制备 SOP-TC-001 第 1 页 共 12 页CIK 细胞制备标准操作程序1 目的和范围：1.1 目的：规范 CIK 细胞培养过程，保证操作准确，避免人为操作误差导致实验效果不良或失败。1.2 范围：该规程适用于实验室细胞培养技术人员 CIK 细胞培养操作的全过程。2 原理：2.1 外周血单核细胞经细胞刺激因子诱导后分分化为 CIK 细胞。3 相关文件：3.1 4 物料：4.1 试剂：75%酒精，碘伏，生理盐水，淋巴细胞分离液（Ficoll），GT-T551 培养基,CIK 条件培养基 1、CIK 条件培养基 2 。4.2 仪器设备：生物安全
2、柜，离心机，水浴锅，二氧化碳细胞培养箱，电动移液枪，10ul 移液枪，200ul 移液枪，医用剪崇州医院治疗中心 标准操作程序CIK 细胞制备 SOP-TC-001 第 2 页 共 12 页刀，医用止血钳，试管架。4.3 耗材： T175 透气培养瓶（175cm 2Flask） ，T75 透气培养瓶（75cm 2Flask） ，CO 2透气培养袋，15ml 离心管，50ml 离心管，5ml 移液管，10ml 移液管，50ml 一次性注射器,5ml一次性注射器，200ul 枪头。5 记录5.1 DC-CIK 细胞制备记录。6 职责：6.1 细胞培养技术人员应严格按照本规程的规定进行 CIK 细胞
3、培养操作。6.2 QA 负责监督细胞培养技术人员的操作全过程，确保 CIK 细胞培养操作的规范性。6.3 审核人负责保证本规程的审核和全过程准确有效。7 工作程序：7.1 实验前准备：7.1.1 洁净区及工作台紫外照射30min，风机开启 30 分钟。7.1.2 物料准备：将已灭菌且在有效期内器械放于物料传递窗进行紫外照射，30min 后，去包布，经酒精擦拭崇州医院细胞治疗中心 标准操作程序CIK 细胞制备 SOP-TC-001 第 3 页 共 12 页后放入生物安全柜中备用。7.1.3 单核细胞分离液（Ficoll）提前 30min 从 4冰箱取出待用。7.1.4 单核细胞分离液（Ficol
4、l） ，GT-T551 培养基，血清，在实验前需提前准备好放入生物安全柜中，以便其恢复常温，否则将会影响实验效果。7.2 分离7.2.1 制备血浆：7.2.1.1 将样本从医疗器械盒中小心地取出，用酒精擦拭消毒后放入生物安全柜。7.2.1.2 打开器械盒（注意手不得从打开的器械盒上方通过），用生物安全柜中的止血钳从器械盒中取出灭菌指示卡，确认已灭菌。取出器械盒中止血钳，用其夹紧血袋软管下方。7.2.1.3 用浸泡过碘伏和酒精的棉签对软管中上部交替消毒两次，（先碘伏，后酒精，如此交替两次）用生物安全柜中的止血钳取出器械盒中的医用剪刀，用碘伏和酒精对其交替消毒两次，用医用剪刀将软管剪断。将全血转移
5、至 50ml 离心管，每管 25ml。7.2.1.4 室温 1800rpm，离心 10 分钟（离心机升降速以 ST16 为例:升 9 降 4）。崇州医院治疗中心 标准操作程序CIK 细胞制备 SOP-TC-001 第 4 页 共 12 页7.2.1.5 取上层血浆至 50ml 离心管，灭活（56水浴30min）。7.2.1.6 4放置 30 分钟。7.2.1.7 2800rpm 离心 8min,，上清分于 3 支 15ml 离心管中，-20保存。7.2.2 提取 PBMC：7.2.2.1 将生理盐水经酒精擦拭消毒后放入生物安全柜中，用碘伏和酒精对生理盐水瓶瓶口进行 2 次交替消毒后，用止血钳将
6、瓶塞扒开并放置于工作台右上方位置。7.2.2.2 按生理盐水：血细胞=1.5:1 对血细胞进行稀释，混匀。7.2.2.3 按照 1.5：1 的比例，加生理盐水至吸弃血浆后的样本，混匀，缓慢加在 Ficoll 液面上（方法：将离心管倾斜 45，在 Ficoll 液面上 1cm处，缓慢注入稀释的血细胞，不要打乱液面界面），加入后终体积不超过 45ml， 2000 rpm，20min，室温(注意：调整离心机加速和减速过程为最低，调电动移液枪输出速度至最低）。7.2.2.4 离心后，小心取出离心管，可清晰看到细胞分层。注意轻拿轻放，保持离心管竖直放置，以免崇州医院细胞治疗中心 标准操作程序CIK 细胞
7、制备 SOP-TC-001 第 5 页 共 12 页破坏细胞分层。7.2.2.5 用巴氏滴管缓慢提取 Ficoll 层与血浆层交界处的白膜层细胞，按照二个离心管对应一个离心管进行漂洗的原则，将提取的白膜层细胞装入50ml 离心管中。补充生理盐水至 45ml，混匀，1600rpm， 5 分钟。7.2.2.6 弃上清，用生理盐水重悬，收集于一个 50ml离心管中，补充生理盐水至 45ml。1200 rpm，10min。7.2.2.7 弃上清，再次添加生理盐水重悬至 45mL，混匀，取 0.5ml 中层悬液至 1.5mlEP 管中计数，1000rpm，10min。7.2.2.8 取上清至 15ml
8、离心管中，标记，送检微生物并留样，上清量应满足检测及留样要求，其余上清废弃。7.2.3 接种：7.2.3.1 用培养基调整细胞浓度为 12106/ml。7.2.3.2 D0 天完全培养基配制：每 20ml 培养基（10%自体血清）添加 1 支 CIK 条件培养基（规格：500ul/支）。7.2.3.3 混匀，根据培养液体积添加到 25cm2Flask 或者 75cm2Flask 中。崇州医院治疗中心 标准操作程序CIK 细胞制备 SOP-TC-001 第 6 页 共 12 页7.2.3.4 水平放入 37，5%的二氧化碳培养箱中培养。7.2.3.5 填写相关记录,清场。7.3 加液7.3.1
9、时间及方式：当培养基颜色变黄或细胞浓度接近饱和时，以倍增方式补液。7.3.1.1 一般加液时间为：D2，D4，D6，D8，D10，D12（加液时间视细胞具体生长情况可提前或延后） 。7.3.1.2 D2-D14 天，完全培养基的配制：每瓶培养基（1000ml）添加 1 支 CIK 条件培养基 2（规格：1ml/支）7.3.2 添加方法：轻轻摇匀，避免起气泡；拧好瓶盖，水平放入 37、5%CO 2培养箱继续培养。7.4 转瓶：当 75cmFlask 细胞悬液总体积达到 60ml，且需要继续补液时。7.4.1 将 75cmFlask 中细胞悬液全部倒入新的 1752Flask培养瓶中。7.4.2
10、向 75cmFlask 中添加适量培养基对瓶内细胞进行涮洗并倒入 1752Flask 培养瓶中，再添加适量新鲜培养基（加 5%自体血清）。7.4.3 拧紧 175cmFlask 瓶盖，水平放入 37，5%的二氧崇州医院细胞治疗中心 标准操作程序CIK 细胞制备 SOP-TC-001 第 7 页 共 12 页化碳培养箱中培养。7.5 转袋或分瓶：当 175cmFlask 中细胞悬液总体积达到250ml，且需要继续补液时。转袋：7.5.1 取 50ml 注射器，弃去针头及助推器。放入注射器支架的圆孔内。7.5.2 用碘伏和酒精对培养袋导管盖子下 1-2处交替消毒两次。7.5.3 用止血钳取下前端盖
11、子，连接管口与注射器。7.5.4 将 175 cmFlask 中的细胞悬液缓慢倒入注射器内。7.5.5 用适量培养基涮洗 175 cmFlask，按 7.3.1.3 和7.3.2.2 的方法继续向细胞培养袋中添加培养基，至加液总体积达到应添加量。7.5.6 培养基添加完毕，用止血钳夹紧导管前端，将细管与注射器分离并将细管抬高，确保培养基全部进入细胞袋中。用止血钳将细管盖子盖上并拧紧，用塑料夹将导管末端夹紧。7.5.7 将培养袋平放，用双手轻轻按摩袋子十余下，使细胞与培养基混匀。用碘伏和酒精对培养袋取样口进行交替消毒，用一次性注射器取样 0.5ml，标记，送检微生物检测。7.5.8 培养袋标记后
12、双手托住培养袋下方自生物安全柜中崇州医院治疗中心 标准操作程序CIK 细胞制备 SOP-TC-001 第 8 页 共 12 页取出，用托盘将其送至培养室，水平放入 37，5%的二氧化碳培养箱中培养。7.5.9 分瓶：按培养瓶中培养基体积等分，按倍增的方式分瓶培养，加液按步骤 7.3.1.3 和 7.3.2.2 要求添加新鲜培养基。分瓶完毕，拧好盖子，每个培养瓶均做好标记后放入 37，5%的二氧化碳培养箱。（此步骤仅适用于分瓶培养）7.5.10 填写相关记录。7.5.11 培养袋转移方法：放置在托盘上。7.6 分袋：计划需求且培养袋中细胞悬液总体积达到 1000ml时。7.6.1 混匀后对应将样
13、本挂于生物安全柜中的挂钩上。7.6.2 取 50ml 注射器，弃去针头及助推器。放入注射器支架的圆孔内。7.6.3 取新的细胞培养袋，用碘伏和酒精对其盖子下 1-2处交替消毒两次。用止血钳取下盖子，连接管口与注射器。7.6.4 用止血钳夹紧原培养袋导管，碘伏和酒精对其盖子以下 1-2处交替消毒两次，取下盖子。（注意开盖时，细管的前端应高于培养袋中细胞培养液的液面，并且培养袋塑料夹处取夹紧状态，防止在拧开盖子时，液体突然涌出）崇州医院细胞治疗中心 标准操作程序CIK 细胞制备 SOP-TC-001 第 9 页 共 12 页7.6.5 再次混匀后，松开止血钳，通过注射器将原培养袋中的细胞悬液加入到
14、新的培养袋。加液时（按 7.3.1.3和 7.3.2.2 步骤），当液面增至注射器套筒 50ml 刻度线后，停止加液并松开新增培养袋导管止血钳，使液面降至 0 刻度线，再次用止血钳夹紧新增培养袋细管并加液，按上述方法每 50ml 一次，重复数次进行加液，至原培养袋中一半培养基转入新增培养袋。用止血钳夹紧细管前端，将其置于生物安全柜左上角。7.6.6 填写相关记录，清场。7.7 细胞收获：7.7.1 检查培养袋标记是否与回输计划相符。7.7.2 取出，酒精擦拭消毒后，放入生物安全柜，挂于生物安全柜内的挂钩上。7.7.3 取若干 50ml 离心管，标记，拧开离心管盖，整齐的置于工作台上方，调整离心
15、管刻度朝向操作者。7.7.4 混匀培养袋中细胞悬液。用止血钳夹紧培养袋导管，碘伏与酒精对导管盖子下方 1-2cm 处进行交替消毒，拧开培养袋的盖子并放于工作台左前方。7.7.5 一手握止血钳，一手拿导管，慢慢松开止血钳，由慢到快将细胞悬液引入离心管中。7.7.6 操作中导管口应处于离心管口正上方，待离心管装崇州医院治疗中心 标准操作程序CIK 细胞制备 SOP-TC-001 第 10 页 共 12 页满细胞悬液后，夹紧导管，转移至另一离心管中继续添加细胞悬液，直至达到收集体积。7.7.7 将导管口抬起，使部分培养基回流，若还需添加新鲜培养基，则用止血钳将导管前端夹紧，放置于工作台左上方，待离心
16、管移出生物安全柜后，可立即进行加液处理。若不进行加液则拧上导管盖子，并用塑料夹将导管末端夹紧，移出安全柜，放入培养箱继续培养。7.7.8 细胞清洗：7.7.8.1 配平，1300rpm，8 分钟。7.7.8.2 用碘伏和酒精对生理盐水瓶口进行交替消毒 2次，用止血钳拔开橡胶塞，将生理盐水置于工作台右上方备用。7.7.8.3 待离心完毕，弃上清，收集细胞于两个离心管中，1300rpm 离心 8 分钟。7.7.8.4 废上清，收集细胞于一个离心管管中，添加生理盐水至 45ml，混匀，取 0.5ml 中间层悬液计数及活率检测。7.7.8.5 1300rpm，8 分钟，取上清至 15ml 离心管中作革兰氏、内毒素检测并留样，多余的废弃。7.7.8.6 用生理盐水重悬细胞，如无自体血清用 5ml 人血白蛋白和 15ml 生理盐水重悬细胞，混匀。
