1、桂林理工大学生物工程专业生物分离工程实验讲义1实验一 牛乳中酪蛋白的提取一、实验目的1、掌握等电点法提取蛋白的基本原理及基本操作；2、掌握双缩脲法测定蛋白含量的基本原理及基本操作。二、实验原理酪蛋白是乳蛋白质中最丰富的一类蛋白质，约占乳蛋白的 8082%，酪蛋白不是单一的蛋白质，是一类含磷的复合蛋白质混合物，以一磷酸酯键与苏氨酸及丝氨酸的羟基相结合。它还含有胱氨酸和蛋氨酸这两种含硫氨基酸，但不含半胱氨酸。它在牛乳中的含量约为 35g/L，比较稳定，利用这一性质，可以检测牛乳中是否掺假。酪蛋白在其等电点时由于静电荷为零，同种电荷间的排斥作用消失，溶解度很低，利用这一性质，经牛乳调到 pH4.6，
2、酪蛋白就从牛乳中分离出来。酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被利用来从酪蛋白粗制剂中将脂类杂质除去。在乳制品加工或成品中，酪蛋白含量是一个常需测定的指标。常用于测定酪蛋白的方法是先将酪蛋白在等电点沉淀，再用凯氏定氮法测定。本实验采用双缩脲法测定酪蛋白。其原理为：蛋白质含肽键，肽键在碱性溶液中可与铜离子形成紫红色化合物，在 540nm 波长处有最大吸收，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸组成无关。三、材料与试剂市售牛奶10mg/mL 酪蛋白标准溶液（用 0.1M NaOH 配制）0.1M NaOH 溶液、 0.2 M pH4.6 的 HAcNaAc 缓冲液双缩脲试剂：称取硫酸铜（Cu
3、SO 45H2O）1.5 g，加水 100 mL，加热助溶；另称取酒石酸钾钠（NaKC 4H4O64H2O）6.0g、碘化钾 5g 溶于 500 mL 水中。两液混匀后，在搅拌下加入 10%NaOH 300 mL，后用水稀释至 1000 mL，贮存于塑料瓶中。此液可长期保存，若瓶底出现黑色沉淀则需重新配制。四、操作步骤1、牛乳中酪蛋白的等电点沉淀用量筒量取 25 mL 牛乳两份分别置于 50 mL 烧杯中，水浴加热至 40，在搅拌下慢慢加入到已预热至 40的等体积的 0.2 M pH 4.6 的 HAcNaAc 缓冲液中，混匀，冷却静置 30 min 沉淀酪蛋白后，3000 r/min 离心
4、15 min，弃上清液，收集沉淀。一份沉淀用于 “除杂”步骤，另一份沉淀用 0.1M NaOH 溶液溶解并定容至 100 mL，用于“酪蛋白含量测定”步骤。2、除杂将上述沉淀捣碎，加入 10 mL 95%乙醇，搅拌制成悬浮液。将此悬浮液倾于布氏漏斗中，抽滤除去乙醇溶液，再用 10 mL 乙醚乙醇混合液（11）洗涤沉淀两次，最后再用 10 mL 乙醚洗涤沉淀两次，桂林理工大学生物工程专业生物分离工程实验讲义2抽干。将沉淀从布氏漏斗中移去，在表面皿上摊开挥干乙醚后，置烘箱中 80干燥过夜，称重（m 1） 。3、酪蛋白含量测定（1）标准曲线的绘制分别移取酪蛋白标准液 0.0，0.2，0.4，0.6，
5、0.8，1.0 mL 于干燥试管中，不足 1.0 mL 者用 0.1M NaOH 溶液补足 1.0 mL，然后分别加入 4.0 mL 双缩脲试剂，混匀，室温下反应 30min，测定 540nm 波长处吸光度。以酪蛋白质量（mg ）为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。（2）酪蛋白含量测定取“步骤 1”中样品溶液 1.0 mL，加入 4.0 mL 双缩脲试剂，混匀，室温下反应 30 min，测定 540nm 波长处吸光度，查标准曲线，求得酪蛋白质量。平行测定 3 次，求其平均值，并计算 25 mL 牛乳中酪蛋白的质量（m 2） 。五、结果与讨论1、牛乳中酪蛋白含量的计算含量（g/mL）= ）牛
6、乳 体 积 （ mL25102、酪蛋白提取得率的计算得率（%）= %102六、思考题1、为什么在等电点沉淀时需加热至 40？2、除杂时，能否将三种溶剂的顺序颠倒？为什么？3、双缩脲法测定蛋白的原理是什么？4、比较牛乳中酪蛋白测定含量与理论含量大小，并对测定结果进行讨论。桂林理工大学生物工程专业生物分离工程实验讲义3实验二 大蒜细胞 SOD 酶的提取与分离一、实验目的1、掌握 SOD 酶的提取、分离、检测等一般步骤；2、掌握酶在提取过程中的两个重要参数：回收率和纯化倍数。二、实验原理超氧化物歧化酶（SOD）是一种就有抗氧化，抗衰老，抗辐射和消炎作用的药用酶。它可以催化超氧负离子（O -）进行歧化
7、反应，生成氧和过氧化氢：2O 2-+H2O 2+H2O2.大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的 SOD，通过组合组织或者细胞破碎后，可用 PH7.8 的磷酸缓冲液体提取。由于 SOD 不溶于丙酮中，可用丙酮将其沉淀析出。邻苯三酚在碱性条件下可迅速自氧化,释放出 O2-,生成带色的中间产物,在 325nm 有最大吸收峰。邻苯三酚自氧化产生的中间产物在 40s-3min 这段时间，生成物与时间有较好的线性关系。颜色深SOD 逐渐增多颜色浅，即酶活力越大，颜色越浅。三、试剂和材料新鲜蒜瓣，市售磷酸缓冲液：0.05 mol/L，pH7.8氯仿一乙醇混合溶剂：氯仿无水乙醇=35（V/V）丙酮：用前
8、冷却至 410 0.1 mol/LTrisHCl 缓冲液（pH=8.2,内含 2 mmol/LEDTA）10 mmol/L HCl45 mmol/L 邻苯三酚（内含 10mmol/LHCl）四、实验步骤1、组织或细胞破碎称取 5g 左右大蒜蒜瓣，置于研钵中研磨，使组织或细胞破碎。2、SOD 的提取将上述破碎的组织或细胞，加入 23 倍体积（10-15 mL）的 0.05 mol/L，pH7.8 的磷酸缓冲液，继续研磨搅拌 20min，使 SOD 充分溶解到缓冲液中，然后在 5000 r/min 下，离心 15 min，收集上清液得提取液。留出 1mL 备用，剩余提取液准确量取体积后进行下步实验
9、。3、除杂蛋白提取液加入 0.25 倍体积的氯仿一乙醇混合溶剂搅拌 15min，5000r/min 离心 15 min，去杂蛋白沉淀，收集上清液得粗酶液。留出 1mL 备用，剩余粗酶液准确量取体积后进行下步实验。4、SOD 的沉淀分离桂林理工大学生物工程专业生物分离工程实验讲义4将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌 15min，5000r/min 离心 15min，得 SOD 沉淀。将 SOD 沉淀溶于少量（ 5ml） 0.05 mol/L pH7.8 的磷酸缓冲液中，再加水 5mL，5000r/min 离心15min，收集上清液，得 SOD 酶液。准确量取体积。将上述提取液、粗酶液和酶液分别
10、取样，测定各自的 SOD 活力和蛋白浓度。5、SOD 活力测定参照李建武的生物化学实验原理和方法，采用邻苯三酚自氧化法测定 SOD 的酶活力。邻苯三酚在碱性环境中即可迅速发生自氧化作用，在自氧化过程中产生有色中间物和 O2-自由基，反应开始后溶液逐渐变成黄色，在有超氧化物歧化酶存在时，由于它能催化 O2-自由基与 +H 结合生成 02 和 H2O2，从而阻止了中间产物的积累，降低了自氧化速率。中间产物在 325nm 时有强力的光吸收，采用分光光度计即可检测。（1）邻苯三酚自氧化速率的测定：在试管中按表 1 加入各试剂，加入邻苯三酚后马上计时，迅速摇匀倒入石英比色皿中，在 325nm 波长下，从
11、第 1 分钟开始，每隔 30 秒测一次光吸光度，测至第 5 分钟。以吸光度为纵坐标，反应时间（min）为横坐标绘制反应曲线，计算邻苯三酚自氧化速率 k0（直线斜率）。表1 邻苯三酚自氧化测定加样表加 样 量 （ mL）试 剂校零管 测定管0.1mol/LTrisHCl 缓冲液（pH=8.2,内含 2mmol/LEDTA） 4.5 4.5蒸馏水 4.4 4.410mmol/L HCl 0.1 45mmol/L 邻苯三酚（内含 10mmol/LHCl） 0.1总体积 9.0 9.0（2）SOD 酶活的测定：在试管中按表 2 加入各试剂，加入邻苯三酚后马上计时，迅速摇匀倒入石英比色皿中，在 325n
12、m 波长下，从第 1 分钟开始，每隔 30 秒测一次光吸光度，测至第 5 分钟。以吸光度为纵坐标，反应时间（min）为横坐标绘制反应曲线，计算加入 SOD 酶样品后的邻苯三酚自氧化速率 k1（直线斜率）。表2 SOD酶活测定加样表加 样 量 （ mL）试 剂校零管 测定管0.1mol/LTrisHCl 缓冲液（pH=8.2,内含 2mmol/LEDTA） 4.5 4.5蒸馏水 4.3 4.310mmol/L HCl 0.1 待测样 0.1 0.145mmol/L 邻苯三酚（内含 10mmol/LHCl） 0.1总体积 9.0 9.0（3）酶活力测定酶活性单位定义为：在 lml 的反应液中，每分
13、钟抑制邻苯三酚自氧化速率达 50%时的酶量定义为一桂林理工大学生物工程专业生物分离工程实验讲义5个活力单位。按下式计算样品中 SOD 酶单位活力：单位体积活力（U/ml）= 活 性 单 位 定 义 体 积加 入 样 品 液 体 积样 品 液 稀 释 倍 数反 应 液 总 体 积 %50k-10总活力（U ）= 样 品 液 总 体 积单 位 体 积 活 力式中：反应液总体积=9mL；样品液稀释倍数 =1；加入样品液体积=0.1mL ；活性单位定义体积=1mLl；样品液总体积= 实验中各样品实测体积。6、样品中可溶性蛋白含量的测定从 1mL 备用的提取液、粗酶液、酶液中分别取 0.2mL、0.4m
14、L、0.5mL，按提取液 50 倍、粗酶液 20倍、酶液 10 倍进行稀释，分别测定稀释液在 260nm 和 280nm 波长处的吸光值，按下式计算可溶性蛋白的含量： 蛋白质浓度 (mg/mL) = (1.45A280 0.74A260) 稀释倍数总蛋白（mg）= 蛋白质浓度 样品液总体积五、结果与讨论将试验结果及相应的计算结果填入下表：体积（mL ）单位活力（U/mL）总活力（U）蛋白浓度（mg/mL）总蛋白（mg）比活力（U/mg）回收率（ %）纯化倍数提取液 100 1粗酶液酶液相关计算公式：比活力 U/mg = ；纯化倍数= ；回收率=）总 蛋 白 （ ）总 活 力 （ mgU提 取
15、液 比 活 力 力粗 酶 液 （ 或 酶 液 ） 比 活提 取 液 总 活 力 力粗 酶 液 （ 或 酶 液 ） 总 活六、思考题1、在 SOD 酶提取步骤中应注意的关键问题是什么？2、综合评价蛋白或酶的提取分离流程优劣的指标有哪些？桂林理工大学生物工程专业生物分离工程实验讲义6实验三 双水相体系中蛋白质分配系数的测定一、实验目的1、了解双水相系统成相的原理和方法；2、学习双水相相图的制作；3、掌握双水相溶液配制与双水相萃取的操作；4、掌握分配系数和萃取收率的计算方法。二、实验原理双水相系统中使用的双水相是由两种互不相溶聚合物（如聚乙二醇（PEG）与葡聚糖(Dextran)）或者互不相溶的盐溶
16、液和聚合物溶液（如 PEG 与(NH 4)2SO4）组成。双水相系统的制备，一般是将两种溶质分别配制成一定浓度的水溶液，然后将两种溶液按照不同的比例混合，静止一段时间，当两种溶质的浓度超过某一浓度范围时，就会产生两相。两水相形成的条件和定量关系可用相图来表示，它是一根双节线，当成相组分的配比取在曲线下方时，系统为均匀的单相，混合后，溶液澄清透明，称为均相区；在曲线的上方时，能自动分为两相，称为两相区；若配比取在曲线上，则混合后，溶液恰好从澄清变为浑浊。相图是研究两水相萃取的基础。双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同。当物质进入双水相体系后
17、，由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等) 的存在和环境的影响，使其在上、下相中的浓度不同。对于某一物质,只要选择合适的双水相体系，控制一定的条件，就可以得到合适的分配系数，从而达到分离纯化之目的。双水相萃取受许多因素的影响，如高分子聚合物种类、分子量及组成、无机盐种类及组成，pH 等。本实验选用 PEG硫酸盐为相系统，萃取酪蛋白。三、试剂与材料市售牛奶10mg/mL 酪蛋白标准溶液（用 0.1MNaOH 配制） ；0.1M NaOH 溶液；50%PEG2000；40% 硫酸铵溶液；固体硫酸铵；双缩脲试剂。仪器：天平、恒温水浴、离心机、刻度试管、吸管、分光光度计、试管、移液管
18、等。四、实验步骤1、PEG2000-硫酸铵双水相体系相图的测定取 50%PEG2000 溶液（w/v） 10 mL 于三角瓶中，用 40%硫酸铵溶液（w/v）装入滴定管中滴定至三角瓶中溶液恰好浑浊，记录硫酸铵消耗的体积。加入 1mL 水使溶液澄清，继续用硫酸铵滴定至恰好浑浊，重复 7 次记录每次硫酸铵消耗的体积，计算每次出现浑浊时体系中 PEG 和硫酸铵的浓度（w/v） ，并填入表 1 中。以硫酸铵的浓度（w/v）为横坐标，PEG 浓度（w/v）为纵坐标，绘制出 PEG2000-硫酸铵双水相体系相图。桂林理工大学生物工程专业生物分离工程实验讲义7表 1 PEG2000-硫酸铵双水相体系相图制作
19、表（PEG2000= g; 温度 t= 。 ）三角瓶中编号 H2O 累计添加量（mL） 硫酸铵溶液读数（mL） 纯硫酸铵累积量（g）溶液总体积（mL）PEG2000浓度（w/v）硫酸铵浓度（w/v）123456782、酪蛋白在 PEG2000-硫酸铵双水相体系中分配系数和萃取率的测定在刻度试管中加入 0.5 mL 牛奶，再加入 50%的 PEG2000 溶液 10 mL，加入固体硫酸铵，使硫酸铵的终浓度为 15%（忽略牛奶体积） 。振荡均匀，静置待其分层，分别量取、记录上下相的体积。分别取上下相溶液 1 mL 于 2 支试管，按双缩脲方法测定蛋白含量，计算出上下相的酪蛋白的含量和萃取收率。五、
20、结果与讨论根据实验所得数据，计算系统的相比，蛋白在双水相系统中的分配系数及收率。计算公式见下。表观分配系数： K = 相比： R = 下上C下上V收率： K1C下下上上 上上上 下 相 蛋 白 总 含 量下 相 蛋 白 含 量式中: C 上 、C 下 分别为上、下相蛋白浓度； V 上 、V 下 分别为上、下相的体积。 （关注下上下相蛋白总量与加入的蛋白总量是否一致？）六、思考题1、如何正确地绘制相图？如何根据相图配制双水相体系，并对混合物进行分离？2、试讨论 PEG 分子量及硫酸铵浓度对双水相萃取酪蛋白效果的影响。3、实验操作中应注意哪些问题？分析试验误差。桂林理工大学生物工程专业生物分离工程
21、实验讲义8实验四 离子交换树脂总交换容量的测定一、实验目的1、通过实验，加深对离子交换树脂的重要性能之一总交换容量的认识。2、熟悉静态法和动态法测定总交换容量的操作方法。二、实验原理离子交换树脂是一种高分子聚合物的有机交换剂，具网状结构，在水、酸、碱中难溶，对有机溶剂、氧化剂、还原剂及其它化学试剂具有一定的稳定性，对热也比较稳定。在离子交换树脂的网状结构的骨架上，有许多可以与溶液中离子起交换作用的活性基团，例如-SO 3H、-COOH、=NOH 等。离子交换树脂根据其基团的种系分为苯乙烯系树脂和丙烯酸系树脂，树脂中的化学活性基团的种系决定了树脂的主要性质和种系。首先区分为阳离子树脂和阴离子树脂
22、，它们可分别与溶液中的阳离子和阴离子进行交换。阳离子树脂有分为强酸性和弱酸性，阴离子交换树脂又分为强碱性和弱碱性两系。离子交换树脂主要性能参数包括：含水量，膨胀度，密度，交换容量，滴定曲线等。交换容量 Q 是表征树脂性能的重要数据，用 单位质量干树脂或者单位体积湿树脂所能吸附的一价离子的毫摩尔数来表示。732#（ 0017） 系 强酸性阳离子交换树脂（强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂一种磺酸化苯乙烯系凝胶型强酸性阳离子交换树脂，不溶于水，不溶于酸和碱的稀释液，适合用于软化剂顺向再生纯化系统）与碱作用生成水为一不可逆反应，故可用静态法测定总交换量：RH+NaOHRNa+H 2O；用标准 HCl滴定剩
23、余 NaOH 含量来测定总交换容量 。717#（201 7）系强极性苯乙烯系 型阴离子交换树脂，不溶于常规有机溶剂，本品系苯乙烯 -二乙烯苯共聚交联结构高分子基础上带有季胺基-N(CH 3)3，其碱性相当于一般季胺碱，在酸性、中性甚至碱性介质中显示离子交换功能。阴离子交换树脂不能用羟型测定交换容量，因为羟型阴离子交换树脂在高温下易分解，故测水含量不准确，且当用水洗涤时，羟型树脂要吸附 CO2，而使部分树脂成为碳酸型，所以应用氯型树脂来测定：R(NHCl) 2+NaSO4R(NH) 2SO4+2NaCl。 首先用足量的盐酸处理成氯型的，然后采用 Na2SO4 洗脱，最后 AgNO3 标准溶液滴定
24、流出液中 Cl-含量而测定其总交换量。本实验采用静态法和动态法测定 732#树脂的总交换容量。三、试剂与材料阳离子交换树脂 732#（H 型）饱和食盐水、2%-4%NaOH 、 5%HCl 、0.1M NaOH 标准溶液、0.1M HCl 标准溶液、0.5M Na2SO4 溶液、0.1%甲基橙指示剂、0.2%酚酞乙醇指示剂。250mL 三角瓶；交换柱；250mL 容量瓶，酸式滴定管；铁架台、玻璃棉等。四、实验步骤桂林理工大学生物工程专业生物分离工程实验讲义91、树脂的预处理首先使用饱和食盐水，取其量约等于被处理树脂体积的两倍，将树脂置于食盐溶液中浸泡 18-20 小时，然后放尽食盐水，用清水漂
25、洗净，使排出水不带黄色； 其次再用 2%-4%NaOH 溶液，其量与上相同，在其中浸泡 2-4 小时（或小流量清洗） ，放尽碱液后，冲洗树脂直至排出水接近中性为止；最后用 5%HCl 溶液，其量亦与上述相同，浸泡 4-8 小时，放尽酸液，用清水漂流至中性待用。2、树脂含水量的测定精确称取事先处理好并抽干的 732#阳树脂 2 克，105下烘干至恒重，按下式计算含水量：W% = %101W其中 W1 为烘前树脂重，W 2 为烘后树脂重3、静态法测定总交换容量精确称取事先处理好并抽干的 732#阳树脂 2 克，放入 250 mL 三角瓶中，用吸管吸取 100 mL 0.1M NaOH 标准溶液，加
26、入树脂中，将树脂全部浸入溶液中，放置 24 小时。用移液器取出 25 mL 放入 250 mL 三角瓶中，加入 2-3 滴甲基橙作指示剂，用 0.1M HCl 标准溶液滴定至溶液由黄色变为红色为滴定终点，平行测定三份。将结果记入实验记录表中。4、动态法测定总交换容量用长玻璃棒将润湿的玻璃棉塞在交换柱的下部(使其平整)，关闭出水口，加 10mL 纯水。精确称取事先处理好并抽干的 732#阳树脂 10 克，加水后湿法装柱（防止混入气泡） 。在装柱及之后的过程中，必须使树脂层始终浸泡在液面下约 1cm 处。水洗树脂至中性，放出多余的水。为防止之后的加试液时，树脂被冲起，在树脂上面也铺一层玻璃棉。向交
27、换柱内不断加入 0.5M Na2SO4 溶液，用 250 mL 容量瓶收集流出液，调节流量为 2 mL/min，流过100 mL Na2SO4 后，经常检查流出液的 pH，直至其 pH 与加入的 Na2SO4 pH 相同，停止交换。将收集液稀释到刻度，摇匀。移液管移取 25.00mL 流出液于 250mL 锥形瓶，加 2 滴酚酞，用 0.1M NaOH 标准溶液滴定至微红色半分钟不褪色，平行测定三份。将结果记入实验记录表中。实验记录表静态法 动态法第一次 HCl 滴定用量（mL） 第一次 NaOH 滴定用量（mL ）第二次 HCl 滴定用量（mL） 第二次 NaOH 滴定用量（mL ）第三次
28、HCl 滴定用量（mL） 第三次 NaOH 滴定用量（mL ）平均滴定用量 V1（mL） 平均滴定用量 V2（mL）湿树脂质量 G（g） 树脂质量 G（g）树脂含水量 W 树脂含水量 WHCl 的摩尔浓度 M1（mol/L） NaOH 的摩尔浓度 M2（mol/L ）NaOH 的摩尔浓度 M2(mol/L)桂林理工大学生物工程专业生物分离工程实验讲义10五、结果与讨论1、静态法总交换量的计算：总交换容量（ mmol/g 干树脂）= )1(4012WGVM2、动态法总交换量的计算：总交换容量（mmol/g 干树脂）= )1(02六、思考题1、什么是离子交换树脂的交换容量 两种交换容量的测定原理是什么？2、为什么树脂层不能存留有气泡？若有气泡如何处理？3、怎样装柱？应分别注意什么问题？注意事项1. 静态法测定时，不要将树脂吸入三角瓶中；2. 湿法装柱时，树脂不能漏掉，可以用蒸馏水冲洗完全，保证下一步中洗脱数据的正确性；3. 液体不能流干，柱中不能产生气泡，保证柱子在洗脱时流畅性和完全性。4. 滴定所用三角瓶要用去离子水洗一洗，不能有离子，以免影响滴定结果；5. 洗脱过程中保持流速为 2ml/min，不可过快，不然洗脱不完全，实验数据存在误差；
