1、学习要求：1.掌握吸光光度法的基本定律朗伯比尔定律。2.掌握吸光度、透过率、摩尔吸光系数的意义及其相互关系。3.熟悉显色反应和对反应要求。4.熟悉比色分析条件和分光光度计的光路原理。5.掌握标准曲线的绘制及其应用。6.了解比色和分光光度法在分析中的应用。,第7章吸光光度法,许多物质本身具有明显的颜色，例如KMnO4溶液呈紫红色，K2Cr2O7溶液呈橙色等。还有一些物质本身没有颜色，或者颜色很淡，可是当它们与某些化学试剂反应后，则可生成具有明显颜色的物质。如Fe2+与邻二氮菲形成稳定的红色配合物等。这些有色物质颜色的深浅与有色物质的浓度有关。溶液愈浓，颜色愈深。,吸光光度法,在分析中，可以用比较
2、颜色的深浅来测定溶液中该种有色物质的浓度，这种测定方法称为比色分析法。使用分光光度计，以窄波长范围的单色光作入射光，测定物质对光的吸收，这种分析方法称为分光光度法，根据入射光波长范围的不同，它又可分为可见及紫外分光光度法，红外分光光度法等。本章仅讨论可见光分光光度法。,光是一种电磁波。根据波长的不同，可以分为紫外区光谱（10400nm）， 可见区光谱（400760nm）和红外区光谱（7603105nm）。不同波长的光，其能量不同，波长愈短，光的能量愈大。由不同波长的光组成的光称为复合光。具有单一波长的光称为单色光。,7.1 物质对光的选择性吸收和光吸收的基本定律7.1.1 物质对光的选择性吸收
3、,吸收光谱有原子吸收光谱和分子吸收光谱。 分子吸收光谱比较复杂。由电子能级跃迁而产生吸收光谱，位于紫外及可见光部分。这种由价电子跃迁而产生的分子光谱称为电子光谱。由分子振动能级和转动能级的跃迁而产生的吸收光谱成为振动转动光谱或红外吸收光谱。,吸收光谱产生的原理,人们日常所见的白光（如日光，白炽灯光）称为可见光。它是由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫色等光按一定比例混合而成的，而且每一种颜色的光具有一定的波长范围。,颜色与波长,如果把适当颜色的两种光，按一定比例混合，可以成为白光，我们称这两种光为互补色光。在图中，处于直线关系的两种色光为互补色光，如绿光和紫光可混合成白光等。,光的互补色,当一束平行的
4、单色光照射到溶液时，光的一部分被吸收；一部分透过溶液；一部分被比色皿的表面反射回来。如果入射光的强度为I0，吸收光的强度为Ia，透过光的强度为It，反射光的强度为Ir，则I 0I aI tI r,7.1.2 光吸收的基本定律1. 朗伯比耳定律,在比色分析中，盛溶液的比色皿都是采用相同质料的光学玻璃制成的。因此反射光的相位相同，其影响可以相互抵消，故上式可简化为： I 0I aI t 透过光强度（I t）与入射光强度（I 0）之比称为透过率或透光度。常用T 表示： T I t I 0 溶液的透光率常用百分数表示。当入射光强度一定时， I t愈大，表示对光的吸收愈小；反之， I t愈小，表示I a
5、愈大。,透过率,若将厚度为b的液层分成无限小的相等薄层，每一薄层的厚度为db，设照射到每一薄层上的光强度为I，则当光通过该薄层时，光的减弱-dI与db及I成正比，即：-d II db -d II k1db将上式积分,朗伯定律液层厚度和光吸收的关系,当一束单色光通过液层厚度为b的溶液后，由于溶液吸收了一部分光能，透过光的强度就要减弱。,可以看出，如果I t I 0 ，则log ( I 0I t )0 说明单色光通过溶液完全不被吸收； 如果I t愈小， log (I 0I t ) 的值愈大，说明吸收程度愈大。因些log (I 0I t) 即表示单色光通过溶液时被吸收的程度，称为吸光度（或称消光度）
6、。用A表示，即：Alog（ I 0I t ） k2b 上式称为朗伯定律。表示当入射光强度和溶液浓度一定时，光的吸收与液层厚度成正比。式中k2为比例常数，它与入射光的波长和溶液的性质、浓度及温度有关。,吸光度,比耳定律溶液浓度和光吸收的关系,当单色光通过液层厚度一定的均匀溶液时，溶液中吸光质点浓度增加dc，则入射光通过溶液后减弱-d I ，-d I应与入射光强度I 成正比，也与浓度增加的变化值dc成正比，即：-d I I dc -d I k3 I dc -d II k3dc 推导同前 得 log (I 0 I t ) k4cAlog ( I 0 I t ) k4c 这就是溶液吸光度与浓度的关系式
7、，通常称为比耳定律。式中比例常数k4，与入射光波长及溶液的性质、液层厚度和温度有关。比耳定律表明，当入射光的波长、液层厚度和溶液温度一定时，溶液的吸光度与溶液的浓度成正比。,如果要求同时考虑溶液浓度c和液层厚度b对光吸收的影响，可将朗伯定律和比尔定律合并为朗伯比尔定律Alog （ I 0 I t ） Kcb 式中K是比例常数，与入射光波长、物质的性质和溶液的温度等因素有关，此式表明， 当一束单色光通过均匀溶液时，其吸光度与溶液的浓度和厚度的乘积成正比。这个规律称为朗伯比尔定律。吸光度与透过率之间的关系为：A-logT,朗伯比耳定律,式中K值随c、b所用的单位不同而不同，它与入射光波长及溶液的性
8、质有关。当c以克升、液层厚度b以厘米表示时，常数K以a表示，称为吸光系数，单位为Lg-1cm-1。此时Aabc,2. 吸光系数、摩尔吸光系数与桑德尔灵敏度吸光系数,AKbc,式中的浓度c用摩尔升，液层厚度b用厘米为单位表示，则K用另一符号来表示。 称为摩尔吸光系数，单位为Lmol-1cm-1。它表示物质的浓度为1摩尔升，液层厚度为1厘米时溶液的吸光度。这时Abc显然，我们不能直接取1摩尔升这样高浓度的有色溶液去测量其摩尔吸光系数， 而只能通过计算求得。在实际工作中，通常不考虑吸光物质的真正浓度，而以被测物质的总浓度计，故测得的实为表观摩尔吸光系数（）。,摩尔吸光系数,AKbc,显色反应的灵敏度
9、除用表示外，还常用桑德尔灵敏度（又叫桑德尔指数）S来表示。 则给定仪器的检测极限为A0.001时，单位截面积光程内所能检测出来的被测物质的最低含量。S 与的关系可推导如下：A0.001bcbc 0.001 c为摩尔升，即摩尔1000厘米3；b为吸收层厚度（厘米），故cb为单位截面积光程内的摩尔数，即mol1000cm2。再乘以吸光物质的摩尔质量M（gmol-1），就是单位截面积光程内吸光物质的量，即为SSc1000 bM106bcM103（gcm-2）将值bc代入S 0.001M103M(gcm-2),桑德尔灵敏度,AKbc,分光光度计的种类很多，一般按测定的波长范围分类；紫外、可见分光光度计
10、主要用于无机物和有机物含量的测定，红外分光光度计主要用于结构分析。,7.2 分光光度计及吸收光谱7.2.1 分光光度计,有钨丝灯和氢灯（或重氢灯）两种，其中钨丝灯作为可见光区的连续光源，发出的光波长在 320 2500nm。为了得到准确的测量结果，光源应该稳定， 这就必须保持电源电压的稳定， 一般需要采用电源稳压器或用蓄电池供电。氢灯、重氢灯常用于紫外光区180 375nm的连续光源，玻璃吸收紫外线，灯泡用石英制作。常见的紫外分光光度计波长范围是1801000nm。,a. 光源,又称单色仪或分光系统，其作用是将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。分为棱镜和光栅单色仪。 棱镜是根据光的折射原理
11、而将复合光色散为不同波长的单色光，然后再让所需波长的光通过一个很窄的狭缝照射到吸收池上。它由玻璃或石英制成。玻璃棱镜用于可见光范围，石英棱镜则在紫外和可见光范围内均可使用。 光栅是根据光的衍射和干涉原理将复合光色散为不同波长的单色光，然后再让所需波长的光通过狭缝照射到吸收池上。它的分辨率比棱镜大，可用波长范围也较宽。,b. 单色器,也称比色皿，比色皿有玻璃和石英的。石英的可用于紫外光区和可见光区，玻璃比色皿只能用于可见光区。比色皿的规格（光程长短）有多种规格，按其厚度分为0.5cm，1cm，2cm，3cm和5cm，不同材质的比色皿不能混用。 比色皿一般为长方形。同样厚度比色皿之间的透光率相差应
12、小于0.5。比色皿必须保持十分干净， 注意保护其透光面，不要用手指直接接触。,c. 比色皿,检测器的作用是接受从比色皿发出的透射光并转换成电信号进行测量。分为光电管和光电倍增管。,d. 检测器,光电管是一个真空或充有少量惰性气体的二极管。阴极是金属做成的半园筒，内侧涂有光敏物质，阳极为一金属丝。光电管依其对光敏感的波长范围不同分为红敏和紫敏两种。红敏光电管是在阴极表面涂银和氧化铯，适用波长范围为6251000nm；紫敏光电管是阴极表面涂锑和铯，适用波长200625nm。,光电倍增管是由光电管改进而成的，管中有若干个称为倍增极的附加电极。因此可使光激发的电流得以放大，它的灵敏度比光电管高200多
13、倍。适用波长范围160700nm。,显示装置的作用是把放大的信号以吸光度A或透射比T的方式显示或记录下来。分光光度计常用的显示装置是检流计、微安表、数字显示记录仪、信号经A/D转换由微机对信号进行处理。,e. 显示装置,7.2.2 吸收光谱,各种溶液会呈现不同的颜色，其原因是溶液对不同波长的光选择性吸收的结果。当白光照射某一溶液时，某些波长的光被吸收，其余波长的光则透过溶液。溶液的颜色就是透过的这部分波长的光所呈现的颜色。如果溶液对各种波长的光全部吸收，则溶液的颜色呈黑色；如果全部不吸收或对各种波长的光透过程度相同，则溶液呈无色；如果只吸收或最大程度吸收某种波长的光，则溶液呈现的是这种波长光的
14、补色光。例如高锰酸钾溶液因吸收或最大程度吸收了白光中的绿色光而呈紫色。,以上仅粗略地用溶液对各种光的选择性吸收来说明溶液呈现的颜色。其实，任何一种溶液对其它不同波长的光是有吸收的，只是吸收的程度不同而已。如果将各种不同波长的单色光，依次通过一定浓度的某一溶液，即可测得该溶液对各种单色光的吸收程度（即吸光度）。以波长为横座标，吸光度为纵座标作图，可得一条能清楚地描述物质对光吸收情况的曲线，称为光吸收曲线或吸收光谱曲线。,吸收光谱曲线,由四个不同浓度KMnO4溶液的光吸收曲线中可以看出：四条光吸收曲线的形状相似。可见光范围内，KMnO4溶液对525nm波长附近的绿色光吸收最大，紫色和红色光吸收很少
15、，因此，KMnO4呈紫红色。光吸收程度最大处波长叫做最大吸收波长，常用最大表示。KMnO4溶液最大525nm。浓度不同时，其最大吸收波长不变。各种物质都有其特征吸收曲线和最大吸收波长最大。,最大吸收波长,KMnO4溶液的浓度不同，因此溶液对光的吸收程度不同。溶液的浓度愈大， 溶液对光的吸收程度愈大，即吸光度愈大。这说明溶液的吸光度与溶液的浓度有一定的关系。,光的吸收程度,a. 当试液及显色剂均无色 可用蒸馏水作参比溶液。,参比溶液的选择,b. 显色剂为无色，而被测溶液中存在其它有色离子 可用不加显色剂的被测溶液作参比溶液。,c. 显色剂有颜色 可选择不加试样溶液的试剂空白作参比溶液。,d. 显
16、色剂和试剂均有颜色 可将一份试液加入适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，面显色剂及其它试剂均按试液测定方法加入，以此作为参比溶液，这样就可以消除显色剂和一些共存组分的干扰。,e. 改变加入试剂的顺序，使被测组分不发生显色反应，可以此溶液作为参比溶液消除干扰。 此外，对吸收池厚度、透光率，仪器波长，读数刻度等应进行校正。,参比溶液是用于调节仪器工作零点的，若选择不适当，对测量读数准确度影响较大。选择的方法是：,在比色分析或光度分析时，首先要利用显色反应把被测组分转变为有色化合物，然后进行比色或分光光度测定。将被测组分转变为有色化合物的反应叫显色反应。显色反应主要有配位反应和氧化
17、还原反应，而配位反应是最主要的显色反应。与被测组分形成有色物质的试剂称为显色剂。同一组分常可与多种显色剂反应，生成多种不同的有色物质。,7.3 显色反应及其影响因素7.3.1. 显色反应和显色剂,选择性要好 在一定条件下，显色剂仅与一个组分或少数几个组分发生显色反应，干扰少，或干扰容易消除。,1. 对显色反应的要求,灵敏度高 对微量组分的测定一定要选择灵敏度高的显色反应。当值为104105时可以认为该反应的灵敏度较高。,有色化合物的组成恒定，符合一定的化学组成，其化学性质稳定 保证在测定过程中不影响吸光度的准确度及再现性。,有色化合物与显色剂之间的颜色差别要大 有色化合物与显色剂之间的颜色差别
18、，常用 “对比度”或“反衬度”来表示，它是有色化合物MR和显色剂R 的最大吸收波长之差的绝对值MR最大R最大60nm一般要求在60nm以上。,显色反应的条件要易于控制 如果条件要求过于严格，难以控制，测定结果的再现性差。,在水质分析中，由于无机显色剂的灵敏度和选择性都不太高，所以应用较少。,2. 显色剂,有机显色剂,有机显色剂种类繁多，广泛用于水中微量物质的测定。如利用二苯碳酰二肼显色剂与六价铬发生氧化还原反应测定水中微量铬；利用4-氨基安替比林显色剂测定水中酚的含量。还有许多有机显色剂可与金属离子形成稳定螯合物，且呈现鲜明的特征颜色。因此，这些有机显色剂的显色反应的选择性和灵敏度都较高。许多
19、螯合物易溶于有机溶剂中，故还可以进行萃取比色，这对进一步提高选择性和灵敏度很有利。 下面介绍在水质分析中常用到几种显色剂。,属于OO型螯合剂，可与很多高价金属离子生成稳定的螯合物，主要用于测定Fe3+。磺基水杨酸与Fe3+在pH1.82.5的条件下生成紫红色的Feseal+；在pH48时生成褐色的Fe(seal)2-；在pH811.5时生成黄色的Fe(seal)33-；pH大于12时，有色络合物被破坏而生成Fe(OH)3沉淀（Feseal+ 1.6103 Lmol-1cm-1 ，最大520nm）。,a. 磺基水杨酸,属于NN型螯合显色剂，用于测定Ni2+。在NaOH碱性溶液中，有氧化剂（如过硫
20、酸铵）存在时，试剂与Ni2+生成可溶性红色络合物（1.1104，最大508nm）。,b. 丁二酮肟,邻二氮菲（又称邻菲罗啉）属于NN型螯合显色剂，是测定微量Fe2+的较好试剂。在pH56的条件下，Fe2+与邻二氮菲作用形成稳定的桔红色配合物，反应的灵敏度高（1.1104，最大508nm）。,c. 邻二氮菲,双硫腙（又称二苯基硫代卡巴腙）是比色分析中应用最广泛的有机显色剂，属于含S显色剂，主要用于测定微量金属离子，如Pb2+、Hg2+、Zn2+、Cd2+等。其结构式为：,双硫腙为紫黑色晶状粉末，难溶于水及无机酸，可溶于氯仿及四氯化碳。在氯仿中的溶解度大于在四氯化碳中的溶解度。溶液都呈绿色。微溶于
21、烃类溶剂。,d. 双硫腙,如Pb2+的二苯硫腙络合物（6.6104，最大520nm）。,双硫腙分子中具有可被置换的氢原子，因此它可与20多种金属生成电价键和配位键并存的螯合物，通常只有一个活泼氢原子被金属所取代。,双硫腙螯合物,此螯合物易溶于氯仿和四氯化碳，溶液呈红色或橙色，显色反应非常灵敏。,表,偶氮胂（铀试剂）属于偶氮类螯合剂。可在强酸性溶液中与Th()，Zr()，U()等生成稳定有色络合物，也可以在弱酸性溶液中与稀土金属离子生成稳定的有色络合物，是测定这些金属离子的良好显色剂。,e. 偶氮胂,属于三苯甲烷类螯合显色剂，是测定Al3+的很好试剂，在pH55.8的条件下显色（5.9104，最
22、大530nm）。,f. 铬天青S,属于三苯甲烷类碱性染料，常用于测定Tl3+。在HBr介质中，试剂与TlBr4-生成有色的离子缔合物，可被醋酸异戊酯萃取。,g. 结晶紫,多元络合物由三种或三种以上的组分所形成的络合物。目前应用较多的是由一种金属离子与两种配位体所组成的三无络合物。,3. 多元络合物,溶液的酸度对显色反应的影响很大，这是由于溶液的酸度直接影响着金属离子和显色剂的存在形式，以及有色化合物（配合物）的组成和稳定性。其影响关系如下： 当溶液的酸度降低时，金属离子M易水解，可生成一系列水解中间产物，甚至生成沉淀物， 影响了M。为防止金属离子M的水解，故溶液的酸度不能过低。,7.3.2 影
23、响显色反应的因素1. 溶液的酸度,对显色剂R来说，当溶液的酸度变化时，由于许多显色剂本身就是有机弱酸碱，故易发生结构上的变化，影响了R，也影响了显色剂本身的颜色变化。,显色反应一般可表示为：M（被测组分）R（显色剂） MR（有色化合物）从平衡考虑，加入过量显色剂，有利于反应趋向完全，但有时显色剂加入过多，会形成不同配位数的配合物，或是发生其它副反应，对测定反而不利。因此必须严格控制显色剂的用量。,2. 显色剂的用量,显色反应能否完全满足比色分析或光度分析的要求，除了与显色剂的性质有主要关系外，控制好显色反应的条件也是十分重要的，如果显色条件不合适，将会影响分析结果的准确度。,显色剂的用量通常是
24、根据实验来确定的。实验的方法是：固定被测组分的浓度和其它条件，分别加入不同量的显色剂，测定吸光度，绘制吸光度A和显色剂浓度CR的关系曲线。开始时，随差显色剂浓度的增加，吸光度增加。当CR达一定值时， 吸光度不再增大， 曲线出现ab平坦部分，因此可在ab之间选择合适的显色剂用量。,显色剂的用量,当溶液酸度变化时，某些有色化合物MR将形成不同配位比的配合物，或是配合物被H+分解。例如铁与水扬酸的配位反应，当 pH4 Fe3+(C7H4O3)2-+紫色 4pH9 Fe3+(C7H4O3)22-红色 pH9 Fe3+(C7H4O3)32-3-黄色 在这种情况下，必须控制合适的酸度，才可获得好的分析结果
25、。,铁与水扬酸的配位反应,显色反应的适宜酸度可通过实验来确定。其方法是固定被测组分和显色剂的浓度，改变溶液的酸度，测定溶液的吸光度，作出ApH曲线，选择曲线平缓部分相对应的pH值作为测定条件。,酸度实验,由于不同的显色反应，其反应速度不同，溶液颜色及色调趋于稳定的时间也不同，且与温度有关。因此，也应通过实验，作出在一定温度下吸光度时间关系曲线，找出合适的显色时间。,3. 显色时间,在一般情况下，显色反应大多在室温下进行。但是，有些显色反应必须加热至一定温度才能完成，然而有些有色化合物在温度较高时容易分解。因此，对不同的显色反应，最好也要通过实验，作出吸光度温度关系曲线。找出合适的温度范围。,4
26、. 显色温度,有机溶剂会降低有色化合物的离解度，使颜色加深，提高显色反应的灵敏度。同时，有机溶剂还还可能提高显色反应的速度，以及影响有色化合物的组成和溶解度，如在Fe(SCN)3溶液中加入可与水混溶的有机试剂（如丙酮），由于降低了Fe(SCN)3的离解度而使颜色加深，提高了测定的灵敏度。有时，由于溶剂不同，生成不同的溶剂化物而使溶液呈现不同的颜色。如Co(SCN)42-在水中呈无色，在乙醇溶剂中呈蓝色。因此，在比色分析或光度分析中，标准溶液和被测溶液均应采用同一种溶剂。并通过实验了解溶剂对显色反应影响的特点，从而选择合适的溶剂。,5. 溶剂,在比色分析或光度分析中，干扰离子的影响是多方面的。
27、干扰物质本身有颜色或与显色剂反应，在测量条件下也有吸收，造成正干扰。干扰物质与被测组分反应或与显色剂反应，使显色反应不完全，也会造成干扰。干扰物质在测量条件下从溶液中析出，使溶液变混浊，无法准确测定溶液的吸光度。,6. 干扰及其消除方法,在光度分析法中，除各种化学因素所引入的误差外，仪器测量因素也是误差的主要来源。 任何光度计都有测量误差。如光源不稳定、单色光不纯、比色皿透光率不一致、标尺读数不准等，都能引起误差。对于给定的光度计，透光率或吸光度的读数误差，是衡量测定结果准确度的重要因素，也是衡量仪器精度的主要指标之一，且其透光率读数误差是一个常数，约为0.010.02。,7.4 光度分析法的
28、误差,入射光的波长应根据吸收曲线，选择被测溶液有最大吸收的波长。因为在最大处，值最大，测定的灵敏度较高。同时在最大附近，吸光度随波长变化不大，由非单色光引起的对朗伯比耳定律的偏离较小，其测定的准确度较高。如果有干扰时，可选择另一灵敏度稍低，但能避免干扰的入射光，这样就可得到满意的测定结果。,为了使测量结果有较高的灵敏度，必须选择最合适的测量条件，主要有下述几方面。,7.4.1 测定波长的选择和标准曲线的制作1. 测量波长的选择,例,例如用丁二酮肟光度法测定钢中镍，络合物丁二酮肟镍的最大吸收波长为470nm，但试样中的铁用酒石酸掩蔽后，在470nm处也有一定吸收，干扰对镍的测定。为避免铁的干扰，
29、可以选择波长520nm处进行测定。在520nm虽然测镍的灵敏度有所降低，但酒石酸铁的吸光度很小，可以忽略，因此不干扰测定。,在分光光度分析中，通常固定吸收层的厚度不变，用比色计或分光光度计测量一系列标准溶液的吸光度，根据朗伯比耳定律 AKbcKc，吸光度与吸光物质的浓度成正比，故以吸光度为纵座标，浓度为横座标，应得到一通过原点的直线，称为标准曲线或工作曲线。,2. 标准曲线的制作,但在实际工作中，有时标准曲线不通过原点。造成这种情况的原因比较复杂，可能是由于参比溶液选择不当，吸收池厚度不等，吸收池位置不妥，吸收池透光面不清洁等原因所引起的。若有色络合物的解离度较大，特别是当溶液中还有其它络合剂
30、时，常使被测物质在低浓度时显色不完全。,吸光度在0.20.7时，测量的准确度较高。为此，可以从下列几方面进行讨论：计算而且控制试样的称出量，含量高时，少取样，或稀释试液；含量低时，可多取样，或萃取富集。如果溶液已显色，则可通过改变吸收池的厚度来调节吸光度的大小。,3. 吸光度范围的选择,7.4.2 对朗伯比耳定律的偏离,在实际工作中，经常发现标准曲线不成直线的情况。特别是当吸光物质的浓度比较高时，明显地看到标准曲线向浓度轴弯曲的情况（个别情况向吸光度轴弯曲）。这种情况称为偏离朗伯比耳定律。在一般情况下，如果偏离朗伯比耳定律的程度不严重，即标准曲线弯曲程度不严重，仍可用于定量分析，否则在标准曲线
31、严重弯曲部分进行测定时，将会引起较大误差。,严格地说，朗伯比耳定律只适用于单色光。但实际上目前各种方法所得到的入射光，实质上都是复合光，因而导致对朗伯比耳定律的偏离。,由于非单色光引起的偏离,当12时，即当入射光为单色光时，则Abc，b为定值，A与c成直线关系。 当12时，即当入射光为复合光时，则A与c不成直线关系。1和2差别愈大，A与c 之间对线性关系的偏离愈大。显然，单色光愈纯，1和2差别愈小，偏离朗伯比耳定律就愈小。,入射光所包含的波长范围,在实际工作中，通常选用一束吸光度随波长变化不大的复合光作入射光，或选用吸光物质的最大吸收波长作入射光进行测定。由于 变化不大，所引起的偏离就小，标准
32、曲线基本上成直线，测定时有较高的灵敏度。所以比色分析并不严格要求用很纯的单色光。只要入射光所包含的波长范围在被测溶液的吸收曲线较平直的部分，也可以得到较好的线性关系。,选择被测物质的最大吸收波长,应将入射光波长选择在被测物质的最大吸收处，这不仅保证了测定有较高的准确度，而且由于此处的吸收曲线较为平坦。在此最大吸收波长附近各波长光的值大体相等，由于非单色光引起的偏离要比其它波长处小得多。另外测定时应选择适当的浓度范围，使吸光度读数在标准曲线的线性范围内。,一般认为，朗伯比耳定律仅适用于稀溶液。这是因为稀溶液是均相的，对光具有吸收作用，而不具有反射和散射作用。如果溶液介质不均匀，以胶体、乳浊、悬浊
33、状态存在，则入射光透过溶液后，除一部分被吸收外，还有一部分被反射和散射，使透光率减少。,2. 介质不均匀引起的偏离,溶液中的吸光物质常因离解、缔合、形成新化合物或互变异构等化学变化而改变其浓度，因而导致偏离朗伯比耳定律。 大部分有机酸碱的酸式、碱式对光有不同的吸收性质，溶液的酸度不同，酸（碱）解离的程度不同，导致酸式与碱式的比例改变，使溶液的吸光度发生改变。 如果显色剂与金属离子生成的是多级络合物，且各级络合物对光的吸收性质不同，例如Fe()在与SCN-的络合物中，Fe(SCN)3颜色最深， Fe(SCN)2+颜色最浅，故SCN-浓度越大，溶液颜色越深，即吸光度越大。,3. 由于溶液本身的化学
34、反应引起的偏离,例如K2Cr2O7在弱酸性溶液中存在下列平衡Cr2O72-H2O 2HCrO4-今于450nm波长下测量不同浓度K2Cr2O7溶液的吸光度，由于Cr2O72-在浓度低时的离解度大， 浓度高时的离解度小，而且HCrO4-较Cr2O72-小很多，故低浓度Cr2O72-的吸光度降低特别严重，因而使标准曲线发生向上弯曲的情况，导致偏离朗伯比耳定律。,标准曲线发生向上弯曲,a. 控制溶液酸度,用双硫腙法测定Hg2+时，Cd2+、Cu2+、Co2+、Ni2+、Sn2+、Zn2+、Pb2+、Bi2+等均可能发生反应，但在稀酸（0.5 molL-1 H2SO4）介质中进行萃取，则上述离子不再与
35、双硫腙作用，从而消除干扰。,b. 加入掩蔽剂,选取的条件是掩蔽剂不与待测离子作用，掩蔽剂以及它与干扰物质的颜色应不干扰待测离子的测定。用双硫腙法测定Hg2+时，即使在稀酸（0.5molL-1H2SO4）介质中进行萃取，尚不能消除Ag+和大量Bi3+的干扰。这时，加KSCN掩蔽Ag+，EDTA掩蔽Bi3+，从而消除干扰。,c. 利用氧化还原反应，改变干扰离子的价态,如用铬天青S比色测定Al3+时，Fe3+有干扰，加入抗坏血酸将Fe3+还原为Fe2+后，干扰即消除。,d. 利用校正系数,例如，用SCN-测定钢中钨时，可利用校正系数扣除钒()的干扰，因为钒()与SCN-生成黄色(NH4)2VO(SC
36、N)4络合物而干扰测定。实验表明，质量分数为1的钒相当于0.20 钨（随实验条件不同略有变化）。这样，在测得试样中钒的量后，就可以从钨的结果中扣除钒的影响。,e. 利用参比溶液消除显色剂和某些共存有色离子的干扰,例如用铬天青S比色法测定钢中的铝，Ni2+、 Co2+等干扰测定。为此可取一定量试液，加入少量NH4F，使Al3+形成AlF6络离子而不再显色，然后加入显色剂和其它试剂，以此作为参比溶液，以消除对Ni2+、Co2+测定的干扰。,f. 选择适当的光度测量条件和方法,空白试验可以抵消有色共存离子或显色剂本身颜色所造成的干扰，选择适宜波长也可消除共存干扰物质的影响。 MnO4-的最大吸收波长
37、为525nm，测定MnO4-时，若溶液中有Cr2O72-存在，由于它在525nm也有一定的吸收，故影响MnO4-的测定。为此，可选用545 nm甚至575nm波长进行MnO4-的光度测定。这时测定的灵敏度虽较低，但在很大程度上消除了Cr2O72-的干扰。,g. 增加显色剂的用量,当溶液中存在有消耗显色剂的干扰离子时，可以通过增加显色剂的用量来消除干扰。,h. 分离,在上述方法均不奏效时，可采用适当的预先分离的方法，如采用蒸馏、萃取、沉淀等方法。 如测定水中的NH4+可在浓碱存在下将NH3蒸出来并用酸吸收，在 pH为 10.00.2 和有氧化剂铁氰化钾存在的情况下，4-氨基氨替比林（4-AAP
38、）可与挥发酚类生成安替比林染料用氯仿萃取，接取氯仿萃取液然后测定。测定水中的挥发酚可将水样在酸性条件下进行蒸馏，收集蒸馏液进行测定，大部分干扰物质均可消除。测水中的CN-可在酸性环境中与乙酸锌存在下蒸馏，用氢氧化钠溶液接收蒸馏出的HCN，分析结果包括了简单氰化物和部分形成配离子中的氰。,分光光度法是测定微量组分的一种很好方法，也能应用于常量组分和多组分的测定。同时，分光光度法不仅广泛地应用于化学平衡的研究，以及有机物纯度、分子量及结构的测定等等。本节仅作有关这些方面的简单介绍。,7.5 其它吸光光度法,用眼睛观察，比较溶液颜色深度以确定物质含量的方法称为目视比色法。常用的目视比色法是标准系列法
39、。用一套相同质料制造的、形状大小相同的比色管（容量有10，25，50及100毫升几种），将一系列不同量的标准溶液依次加入各比色管中， 再分别加入等量的显色剂及其它试剂，并控制其它实验条件相同，最后稀释至同样体积，这样便配成一套颜色逐渐加深的标准色阶。,7.5.1. 目视比色法,将一定量被测试液置于另一比色管中，在同样条件下进行显色，并稀释至同样体积。从管口垂直向下观察，也可以从比色管侧面观察，若试液与标准系列中某溶液的颜色深度相同，则说明这两个比色管中溶液的浓度相等；如果被测试液颜色深度介于相邻两个标准溶液之间，则试液浓度也就介于这两个标准溶液浓度之间。,分光光度法主要用于测定试样中的微量组分
40、。当用于测定高含量组分时，会产生很大误差。利用示差分光光度法，就可以克服这一缺点。 示差光度法是利用一个比试液浓度稍低的标准溶液（cS）作参比溶液与试样溶液（cX）进行比较。根据朗伯比耳定律，得：ASbcSAXbcX因cXcS，两式相减，得：AXASb（cXcS）bc由上述可知：两溶液吸光度之差与两溶液浓度之差成正比。这就是示差光度法的原理。 用A对c作图，可得一条工作曲线。,7.5.2 示差分光光度法,如果用cS作参比调零（透光率100），测得cX吸光度是试液与参比溶液的吸光度差值（相对吸光度）。,测量方式,差示法能提高测定结果准确度的原因，是差示法提高了测量吸光度的准确性。这可从下图看出。
41、在普通光度法中，以空白液作参比，测得cS和cX的透光率各为10和7。在差示法中以cS作参比， 调节其透光率为100，接着测cX的透光率得70，这相当于把仪器的读数标尺扩展了10倍。 恒定的仪器误差导致较小的浓度相对误差。一般情况下，示差法的测定误差小于0.5。在某些情况下， 可降低至0.1左右。,测量吸光度的准确性,对于吸收复光谱有重叠的单组分（显色剂与有色络合物的吸收光谱重叠）或多组分（两种性质相近的组分所形成的有色络合物吸收光谱重叠）试样、混浊试样以及背景吸收较大的试样，由于存在很强的散射和特征吸收，难以找到一个合适的参比溶液来抵消这种影响的测定可以采用双波长吸光光度法。,7.5.3 双波
42、长吸光光度法,1. 双波长吸光光度法的原理,双分光系统（单色器）得到的单色光1和2交替通过吸收池中的样品溶液，透过光的信号用光电倍增管检测器接收并转化成电信号，经调制器调节后进行放大，记录仪记录吸光度差值A 。根据朗伯比尔定律，试样在两个波长的吸光度差值A 与溶液中被测组分的浓度成正比，可以计算被测组分的含量或浓度。,2. 双波长吸光光度法的应用a. 混浊试样中组分的测定,在双波长光度法中，作为参比的不是另外的参比溶液，而是试液本身，它只需要用一个比色皿盛装试液，用两束不同波长的光照射试液时，两整光都受到同样的悬浮粒子的散射，当1和2相距不大时，由同一试样产生的散射可以认为大致相等，不影响吸光
43、度差A的值。一般选择待测组分的最大吸收波长为测量波长（1），选择与1相近而两波长相差在4060nm范围内且双有较大的A值的波长为参比波长。,用双波长吸光光度法进行定量分析，是以试液本身对某一波长的光的吸光度作为参比，这不仅避免了因试液与参比溶液或两吸收池之间的差异所引起的误差，而且还可以提高测定的灵敏度和选择性。在进行单组分测定时，以络合物吸收峰作测量波长，参比波长的选择有：以等吸收点为参比波长；以有色络合物吸收曲线下端的某一波长为参比波长；以显色剂的吸收峰为参比波长。,b. 单组分的测定,如果溶液中含有数种吸光物质，则总的吸光度应等于各个成分吸光度的总和，这就是说吸光度具有加和性。因此，对于
44、含多组分的试液，如果具有特征的光吸收曲线，且各组分的吸收曲线互不干扰时，可以不经分离，在不同的波长下对各组分进行分光光度测定。,c. 两组分共存时分别测定,当含多组分的试液具有特征的光吸收曲线，但相互之间有一定干扰时，如图所示。例如试液中含有浓度分别为c1和c2的两个组分，在不同波长1和2测得总的吸光度为A1和A2，并以1和2代表第一种组分在波长1和2处的摩尔吸光系数；“1和”2代表另一种组分在波长1和2处的摩尔吸光系数，若测定时用固定比色皿，则得到A11 c11 c2 A22 c12 c2,两组分相互干扰,用分光光度法研究溶液中配合物的组成、配位平衡、测定配合物的不稳定常数是十分有用的方法。
45、吸收光谱用于证明配合物的组成，具有独特的优点。光度法测定溶液中配合物组成常用的方法是：,7.5.4 其它应用,如果一种有机化合的酸性官能团或碱性官能团是发色团的一部分，则该物质的吸收光谱随溶液的pH值而改变，且可以从不同pH值时所获得的吸光度测定该物质的离解常数。例如酸HA在水溶液中的离解平衡可表示为：HAH2O H3O+A-,1、 弱酸和弱碱解离常数的测定,当HAA-时，则KaH3O+pKalog H3O+pH 因此，只要找出HAA-时溶液的pH值，该pH值就是该酸的pKa值。,测定方法是：配制一系列pH标准溶液（用pH计精确校正），测量不同溶液的吸光度，以吸光度为纵座标，pH为横座标，绘制
46、一条工作曲线。曲线A点以前，溶液中全为酸HA；B点之后，全为其共轭碱A-；曲线AB间溶液中HA和A-的形式共存，C点为HAA-时的吸光度，C点所对应的pH值即为pKa值。,测定方法,设配位反应为mMnR MmRn，通过固定其中一种组分的浓度，逐渐改变另一种组分的浓度，在选定的条件和波长下，测定溶液的吸光度。,2、 络合物组成的测定（1） 摩尔比法（饱和法、摩尔系列法）,一般操作是固定金属离子M的浓度，改变配位剂R的浓度，将所得吸光度对RM作图。曲线的转折点所对应的横座标数值，即为配合物的配位比n。,当曲线的转折点不敏锐时，可如图做延长线，由两延长线的交点向横座标做垂线，即可找出cM：cRm：n
47、之值。这种方法对离解度小的配合物可以得到满意的结果，尤其对配位比高的配合物组成的测定尤为适宜。但当配合物的离解度大时，将得至图中的虚线曲线，无明显转折点，这样将产生较大的误差。不能准确地测定配合物组成。,（1） 摩尔比法（饱和法、摩尔系列法）,此法是保持溶液中cM和cR总浓度不变，即cMcR常数，连续改变溶液中cR和cM的比值，在选定条件和波长下测定溶液的吸光度A，以A对作图。曲线转折点所对应的值即为配合物的配位比值。配合物很稳定时，曲线转折点敏锐；配合物稳定性差时，转折点不明显，可用画切线的方法找出转折点。 此方法不适宜稳定性差的配合物。,（2） 等摩尔连续变化法,在水质分析中，比色分析法广泛用于单一组分的测定，也可用于多组分的测定。通常各种水中的微量或痕量组分，如 K+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Al3+、F-、I-、S2-、PO43- 等都用比色分析法测定。就是水中重要的有害污染物质，如铅、铬、汞、镉、砷、氰化物、酚、有机农药、苯基烷烃类等也常用比色分析法测定。甚至反映水中氮素有机物污染的水质指标，如氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮等，也是利用比色分析法测定的。下面以水中氮素化合物、汞和余氯的测定为例，简要介绍比色分析法的应用。,
