1、第 2 章 综述CREB 是通过磷酸化与去磷酸化的形式来实现其调节细胞转录功能。目前研究表明，CREB 与细胞生长、增殖、分化、周期调控等细胞生物活动密切相关。临床研究发现，CREB 在多种常见肿瘤的发生、发展中起到重要作用。在非小细胞肺癌中，CREB 表达水平与非小细胞肺癌患者吸烟史、肿瘤组织类型以及总体生存期密切相关。而 CREB 表达水平在非小细胞肺癌血清中的研究目前仍未开展。2.1 CREB 的概念环腺苷酸反应元件（cAMP response element，CRE）是广泛存在于真核生物许多基因启动区的一段 DNA 序列，具有转录调节功能。 Montryminy 在 20 世纪 80
2、年代后期通过对生长激素释放因子基因转录效率的研究发现, 基因上游 CRE 的缺失, 可导致转录活性下降 7 倍。1环腺苷酸反应元件结合蛋白（cAMP response element bindingprotein，CREB） ，是由 Yamamoto2在 PCI2 细胞系的核抽提物和大鼠脑组织中分离得到的一种选择性结合 CRE 的核蛋白。它的功能是调节 CRE，被称为调节转录的核因子。 CREB 与 CRE 结合之后, 能刺激基因转录，大大提高 CRE 下游基因的转录活性, 有些基因的转录水平可提高 20 倍。2.2 CREB 的分子结构CREB 由 341 个氨基酸残基构成，分子量为 43K
3、D，是真核细胞核内转录因子。CREB 分子结构分两个区域，C 端区域为天冬氨酸，是与启动子结合部位；N 端区域为蛋氨酸，与调节转录有关3。CREB 属转录因子亮氨酸拉链家族中的一员，包含碱性区（basicregion）和亮氨酸拉链（Leucine zipper）模体，合称为 bZIP 结构。该结构是与 DNA 结合的重要区域，可细分为 KID 区、 区、PRO 区、Q2 区、Q3 区以及 X 区。激酶诱导结构域（ kinase inducible domain，KID 区)是第 98 位至第 144 位氨基酸残基的肽段 , 包含有许多种蛋白激酶对 CREB 分子进行磷酸化的部位，其中 Ser1
4、33 是蛋白激酶 A（PKA）的磷酸化位点4 。这一段序列的二级结构以 -螺旋为主。CREB 的 KID 区域包含着许多与调节 CREB 活性有关激酶的磷酸化位点 。 区由 CREB 基5因 5 号外显子编码，为 螺旋结构。缺乏 区的 CREB 分子，其激活转录的活性明显降低，故 区是 CREB 调节转录的必需区域。PRO 区富含脯氨酸，是分隔 CREB 与启动子结合部位和转录区域的部分。PRO 区可增加分子柔韧性，有助于转录调节功能的执行。Q2 区呈 片状结构，起到辅助基因转录的调节功能。Q3 区亦呈 片状结构，是刺激转录活性的关键部位。X 区是第 142 位到第 165 位氨基酸的肽段，它
5、在一定程度上可以削弱 KID 区的调节作用。CREB 基因组包括至少 11 个外显子，基因全长约为 40kb。人类 CREB 基因位于 2 号染色体长臂，其功能区域与外显子的分布是相对应的。mRNA 的稳定性、翻译初始位点的改变以及 CREB 蛋白的修饰方式的差异使得细胞内产生结构各异的 CREB 分子。目前的研究将 CREB 分子分为 8 个亚型。其中最重要的是 CREB 和 CREB。二者广泛表达与动物细胞内。余者由于缺乏 DNA 结合位点和转位信号，只在成年动物的睾丸中存在。2.3 CREB 的生物学功能转录因子是能够与某基因上游特异核苷酸序列相结合的蛋白。其通过活化识别和结合基因启动子
6、区的顺式作用元件、启动和调控基因表达，把遗传信息从 DNA 转录到 RNA。转录因子不仅是正常细胞中许多重要细胞信号传导通路的最终调节因子，其在肿瘤的发生、发展和转移中也起重要作用。CRE 是广泛存在于真核细胞中的转录因子，是调节基因转录的重要细胞核内蛋白。目前已经知道，CREB 是多种蛋白激酶磷酸化的底物，CREB 通过自身磷酸化实现调节转录的功能3。CREB 以去磷酸化形式在静止期细胞中，可被腺苷酸环化酶、生长因子、激素、维甲酸、细胞因子3以及前列腺素6通过多种信号传导通路激活1,7。最早被确认的激酶是 PKA，其可识别 CREB 中 KID 区域 Ser133 位点。研究认为，Ser13
7、3 被磷酸化后引起分子构象改变，从而提高 CREB 调节转录的活性。相对于激活过程，CREB 的去磷酸化则可使其调节转录的活性降低。研究表明，CREB 的去磷酸化作用是由 PP1 和 PP2A 两种蛋白磷酸酶引起的。使用冈田酸可抑制这两种蛋白磷酸酶，增强 CREB 调节转录的能力。2 CREB 通过对一系列与细胞生长、炎症和增殖相关基因的调节，在细胞分化5、生存8，9、增殖10、生长11,12、细胞周期10以及糖代谢13等过程中都起到重要的作用。目前研究发现，CREB 通过调节多种基因转录，其特别引起分子神经学领域的关注。早期的研究发现，CREB 激活蛋白表达可促进果蝇长时程记忆的形成。后来，
8、CREB 这种作用的研究范围被扩展到海兔和小鼠。研究认为，信息在神经系统中长时程储存与 CREB 调节转录的活性以及其磷酸化水平密切相关。在记忆活动中，CREB 是从共价修饰短期过程到转录依赖长期过程的重要枢纽。152.4 CREB 与肿瘤的研究现状许多信号传导通路最终集中在转录水平。肿瘤发生时，其通过转录因子异常启动某些与癌症相关基因的转录和翻译过程，从而促进肿瘤细胞增殖、分化、促进肿瘤细胞血管化生、抑制肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的粘附聚集，导致肿瘤发生、发展、浸润和转移。研究显示，CREB 通过调节与细胞生长、增殖及炎症反应相关的基因来调节细胞的增殖、分化与凋亡。目前已报道 CREB 在黑
9、色素瘤5、前列腺癌16、肝细胞癌17、乳腺癌18等多种常见肿瘤的发生、发展中起重要作用。CREB 磷酸化水平在前列腺癌和出现转移的组织中的表达比其在正常组织和良性前列腺肿瘤中的表达明显增高，并已证实 CREB 直接参与了肿瘤的进展和转移。另外 CREB 与乳腺癌预后关系密切，CREB mRNA 表达水平越高，乳腺癌无病生存时间和总体生存时间就越短，而且淋巴结转移患者表达水平显著高于未转移者。18最新的研究还显示，CREB 在急性白血病细胞较正常骨髓细胞表达水平明显增高，并且 CREB 高表达者预后比低表达者差。另外，CREB 作为原癌基因可调节血液中的细胞生成，从而影响白血病的表型19,20。
10、2.5 CREB 与非小细胞肺癌2.5.1 肺癌的现状目前，肺癌（lung cancer）在全球总体发病率及死亡总人数已位居各类癌症的首位。21国外报道显示，自从 20 世纪 30 年代起，男性肺癌发病率开始迅速上升，至 20 世纪中期已经成为男性最主要的恶性肿瘤死亡原因。而从 20 世纪 60 年代起，女性肺癌的发病率也出现上升趋势，并仍然在持续。在我国，从 2000 年到 2005 年男性肺癌发病率上升 14%女性肺癌发病率上升 19.9%，而且未来 20 年我国肺癌患者仍会急剧增加22, 23。根据生物学特性，肺癌可分为小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）
11、和非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)。其中以鳞癌、腺癌、大细胞癌为主的 NSCLC 占癌总数的 85%。24众多研究表明，NSCLC 分型受到吸烟因素的直接影响，吸烟史越久、吸烟越频繁者，越容易成为 NSCLC 患者。一项纳入了超过 5000 名患者的联合研究中25，过 60%的患者为长年吸烟人群。目前我国和其他一些发展中国家的吸烟人群数量仍处于高峰期。我国，大约 2/3 的成年男性为吸烟者，其总数占据世界全部吸烟者数量的 1/3。26另外，吸二手烟，饮食习惯、空气污染以及工作环境等也成为肺癌的潜在致病因素。27-30多年以来，治疗 NSCLC 的
12、主要方法是以手术、化疗、放疗为主。手术切除仍然是治愈肺癌患者的唯一持久有效的方法。为了提高手术治疗效果，NSCLC 瘤体必须完全切除，并且需要患者能够耐受手术打击。31另外，接近 70%的肺癌患者伴有局部或者远处转移灶，化学疗对这类患者有益。32目前的研究发现，肺癌切除术后的患者出现复发的几率极大。但术后采用辅助化疗的患者 5 年生存率明显提高。 在纳入了 186733名A 期至A 期患者的国际肺癌辅助化疗试验（International Adjuvant Lung CancerTrial）中发现，辅助化疗组 5 年绝对生存率较未采用辅助化疗组升高近 15%，而死亡率降低了 30%。34分子靶
13、向治疗是在细胞分子水平针对肿瘤细胞信号传导通路中的细胞基因、转录因子、膜表面受体等靶点，通过使用药物来抑制血管生成、关闭细胞膜受体、阻止肿瘤细胞信号传递，从而抑制肿瘤细胞生长并促进其凋亡的治疗方法。现有的大多数 NSCLC 靶向药物都将肿瘤细胞信号传导通路中的某些激酶或者细胞膜表面受体作为靶点。近年来，针对 NSCLC 表皮生长因子和血管内皮生长因子受体信号传导通路的分子靶向治疗发展的最快、应用也最为广泛。而且与传统化疗相比，靶向治疗在部分 NSCLC 患者中有着更高的疗效和更低的毒副作用。35-36目前，过表达的或基因序列发生改变的细胞传导通路中主要的因子已经成为肺癌研究中的常用研究对象。细
14、胞信号传导通路是指细胞本身在细胞外环境的信号刺激下产生的一系列反应机制。正常细胞中的信号的传导是在严格调节控制下有效进行的。膜整合蛋白或者膜表面受体将信号传递到细胞内，通过激活细胞内各种激酶将信号传递到细胞核，从而完成调节细胞内的各项生理活动。而肿瘤细胞在信号传递这一过程中失去有效控制和调节，导致细胞增殖信号的异常传递。造成肿瘤细胞信号传递异常的机制包括：生长因子、生长因子受体和信号通路中激酶的过度表达，基因突变导致激酶或者磷酸化酶的活性改变，以及信号通路中其它调节因子的活性和表达发生改变等。37肿瘤细胞信号传导通路出现的异常激活使相关的信号因子如生长因子、细胞膜表面受体、细胞内的第二信使以及
15、转录因子等调节因子成为肿瘤诊断和治疗的潜在靶点或生物标记物。通过在细胞分子水平对肺癌的细胞信号传导通路进行分子生物学特征进行研究，可能发现更多与肺癌密切相关的重要靶点和生物标记物。2.5.2 CREB 与 NSCLC尽管目前还不清楚 CREB 是否直接参与肺癌的发生发展，但是此前与肺癌相关的体外实验均支持 CREB 在肺癌的发病机制中扮演重要角色的这一假设。在肺腺癌细胞株 A549 中发现，IGF-II 通过 Erk 信号传导通路诱导 CREB 磷酸化，并促进肿瘤细胞增殖和抑制肿瘤细胞凋亡。15。此外，通过药物抑制 CREB 表达，受 CREB 调控的基因如 c-fos、c-jun、Bcl-2
16、、Bcl-xL 和 cyclinD1 表达亦随之降低，肺癌细胞生长受到抑制，其凋亡得到促进。8,38还有研究表明，与烟草引起肺癌密切相关的致癌物 4-（甲基亚硝胺）-1-（3-吡啶）一 1-丁酮能够通过 PKA 信号传导通路促进 CREB 磷酸化而导致肺腺癌的发生。39总之，通过体外实验的研究表明，CREB 磷酸化很可能是各致癌因素引起 NSCLC 细胞过度生长、分化以及抑制 NSCLC 细胞凋亡的必经之路。所以 CREB 的持续激活与肺癌发生、发展的关系密切，有可能作为未来治疗肺癌的重要靶点。直至目前为止，关于 CREB 在 NSCLC 中的表达状况及其与临床病理因素和预后关系的研究报道仍然
17、有限。第一篇临床研究来自于 Seo 等人于 2008 年发表的关于 CREB 表达与 NSCLC 临床病理及预后因素意义的相关报道。40其研究发现，CREB 及 p-CREB 在非小细胞肺癌细胞株中表达高于正常肺上皮细胞株；NSCLC 冰冻组织标本中 CREB 表达高于癌旁正常肺组织标本； NSCLC 石蜡标本中 CREB 表达高于癌旁正常肺组织标本；鳞状细胞癌 CREB 及 p-CREB 免疫组化评分高于腺癌；CREB 及 p-CREB 过表达与 NSCLC 患者生存期显著相关， CREB 及 p-CREB 表达水平越高，总体生存期越低； NSCLC 非吸烟患者的 CREB 及 p-CREB
18、 表达水平显著低于吸烟患者。而目前国内唯一的一篇关于 CREB 在 NSCLC 中表达及其临床意义的研究报道来自于刘伟等人。41其研究证实了 CREB 在鳞状细胞癌组织中表达显著高于腺癌；在吸烟者中表达显著高于非吸烟者；腺癌患者肺癌组织 CREB 低表达预后显著优于高表达者。总结以上对早期 NSCLC 研究显示，CREB 表达水平与非小细胞肺癌患者吸烟史、肿瘤组织类型以及总体生存期密切相关。但 CREB 与晚期 NSCLC 的研究及对抗肿瘤药物疗效的监测能力仍为空白。血清中 CREB 含量与 NSCLC 关系的研究目前国内外尚未开展。目前关于野生型 CREB 蛋白及其磷酸化的研究在神经病学中甚
19、为广泛和深入，但在 NSCLC，甚至在肺癌中的研究却知之甚少，且实验数据多来源于动物、细胞系及肺癌组织标本。血清 CREB 及其磷酸化在 NSCLC 患者中的意义仍有待于探索。2.6 小结肺癌目前已经成为我国首要恶性肿瘤死亡原因。而作为细胞核内转录因子的 CREB 在诸多细胞传导通路的激活下，调节着细胞的转录水平，从而控制细胞增殖、分化、凋亡、细胞周期、肿瘤细胞血管化生以及肿瘤细胞的粘附聚集。目前临床研究认为，CREB 高表达与 NSCLC 患者吸烟史、肿瘤的类型及预后有密切的联系。但对于 CREB 在 NSCLC 患者血清中的检测研究仍为空白。随着 CREB 研究的深入，其不仅可能成为肺癌诊
20、断、筛查、肿瘤检测及预后的重要标记物，同时也有可能成为新的药物个体化治疗靶点。1 Montrminy M R,sevarino K A,Wagner J A, et al. Identification of a cyclic AMPresponsive element within the rat somatostatin gene J.Proc Natl Acad Sic USA, 1986,83:6682-6686.2 Yamamoto K K, Gonzalez G A, Biggsl W H, et al. Phosphorylation induced binding andtra
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