1、堆肥中高温降解菌的筛选及鉴定摘要：从五指山土壤腐殖质样品中分离得到 54 株高温细菌，经水解实验以及酶活力测定，获得一株可同时降解纤维素、蛋白质、淀粉的高温细菌，命名为 3-5，其纤维素酶活力、蛋白酶活力、-淀粉酶活力分别为 7.308U/ml、13.296U/ml 、76.136U/ml 。通过对菌株的形态特征观察、部分生理生化实验和 16SrDNA 基因鉴定，初步确定其土芽孢杆菌属的菌株（Geobacillus） 。菌株最适生长温度为;最适生长 pH 为 6.0；NaCl 浓度为 1%、装液量为 10%时，菌株生长量最大。关键词：高温菌；酶活力；鉴定；土芽孢杆菌属 GeobacillusI
2、solation and Identification of thermophilic bacteria with strong degradation ability from compstingAbstract: Fifty-Four thermophilic bacterium were isolated from agron in Wuzhishan mountain region of Hainan province, then a thermophilic bacterium strain 3-5were screened out for hydrolysis experiment
3、 and enzyme activity, which can degrade cellulose、protein and starch simultaneously. Its cellulose activity、amylase activity and protease activity were 7.308U/ml、13.296U/ml、76.136U/ml respectively. The strain 3-5 is identified as Geobacillus primarily based on its morphological characteristers、some
4、physiological characteristers and 16SrDNA gene sequence. Its optimum temperature for growth was ; optimum pH for growth was 6.0;3-5 achieve its maximum growth when the concentration of sodium chloride is 1% and liquid medium volume is 10%.KeyWords: thermophilic bacteria; enzyme activity; identificat
5、ion; Geobacillus引言堆肥高温期是有机大分子破坏、断裂和分解的主要阶段，也是保证堆肥无害化的重要阶段。但是由于温度的影响，堆肥高温期的微生物种群受到很大的限制，极大地限制了大分子难降解物质的快速降解。高温菌具有代谢快、活性高、代时短、酶的热稳定性高、营造高温条件杀死病原菌等特点，对于高温环境下有机物质的生物转化具有不可估量的作用1，与常温菌相比具有更高的微生物代谢活性和有机物降解速率，在固体废弃物利用领域具有广阔的应用前景 2，通过接种高温降解菌可以增加堆肥高温期微生物的数量，加速难降解有机物质的快速转化，从而有效提高堆肥效率。已有研究表明堆肥中接种高温降解菌可促进有机物降解、提
6、高堆肥高温期温度、延长高温期、加快堆肥腐熟 3-6。目前对于高温降解菌的研究大多仅关注一种大分子物质的降解，对于能同时降解多种有机物的高温菌研究较少。本研究从五指山土壤腐殖质样品中筛选具有同时降解纤维素、蛋白质、淀粉三种有机大分子能力的高温菌，旨在为堆肥提供优良菌株，有效的促进堆肥物料快速腐解、缩短堆肥周期，提高堆肥物料的腐熟程度和稳定化程度，得到高品质的堆肥产品。2.材料与方法2.1 材料供试样品包括：海南五指山石隙灌丛、路边腐木、树下山沟采集的土壤腐殖质样品共4 个。 河北保定康帝生态肥业有限公司污泥秸秆鸡粪堆肥、海南裕沃生物科技有限公司出垛堆置 10d 的滤泥堆肥、诸诚金土地有机肥有限责
7、任公司发酵 3d 的鸡粪堆肥、张家口市金农生物科技有限公司发酵 16d 的牛粪堆肥。2.2 培养基2.2.1 驯化培养基牛肉膏 10g，蛋白胨 5g，NaCl 5g，H 2O 1000ml，pH7.0 ，121灭菌 20min2.2.2 选择培养基纤维素刚果红培养基：羧甲基纤维素钠 1.88g，KH 2PO4 0.5g，MgSO 47H2O 0.25g，明胶 2.0g，刚果红 0.2g，植物凝胶 10g，琼脂 15g，H 2O 1000mL pH 7.07.2g，121灭菌20min7。蛋白选择培养基：蛋白胨 10g，牛肉膏 3g，NaCl 5g，酪蛋白 5g，CaCl 2 0.1g，L酪氨酸
8、 0.1g，植物凝胶 15g，H 2O 1000mL，pH 7.0-7.2，121灭菌冷却至 60，加入 1% 115灭菌的吐温 808。淀粉选择培养基：可溶性淀粉 10g，蛋白胨 10g，酵母粉 5g，氯化钠 10g，pH 7.0，植物凝胶 15g-20g，曲利苯蓝 0.05-0.1g，H 2O 1000mL ，121灭菌 30 min。2.2.3 发酵培养基纤维素发酵培养基：羧甲基纤维素钠 5g，NaNO3 2.5g，KH 2PO4 1g，MgSO 4 0.6g，NaCl 0.1g，CaCl 2 0.1g，FeCl 3 0.01g，明胶 2g，酵母粉 0.1g，H 2O 1000mL，pH
9、 6.8-7.29。蛋白发酵培养基：干酪素 5%，Mandel A 盐 10%，Mandel B 盐 1%，pH6.0Mandel A 盐：KH 2PO4 2g/L， （NH 4） 2SO4 1.4g/L，MgSO 4 0.3g/L，CaCl 2 0.3g/LMandelB 盐：FeSO 4 5mg/L，MnSO 4 1.6mg/L，ZnSO 47H2O 1.4mg/L，CoCl 2mg/L 2.3 高温降解菌筛选2.3.1 初筛样品制成悬浮液经 70高温富集后，将样品悬浮液制成不同稀释度的菌液并涂布于牛肉膏蛋白胨平板上，倒置与 70培养箱中培养 24h。将形态特征不同的菌落挑出，在牛肉膏蛋白
10、胨平板上经过若干次划线纯化，分离得到耐高温纯菌株。将分离得到的耐高温菌株分别接种至纤维素刚果红培养基、淀粉选择培养基、蛋白选择培养基中，观察菌落周围是否出现透明水解圈。若出现透明水解圈说明该种底物已经被水解，菌株具有降解该种底物的能力，按公式 up=(D/d)2 来进行计算， Up 值的大小反映该菌水解能力的强弱其中 D 为透明圈直径(mm)，d 为菌落直径(mm)。2.3.2 复筛将初筛得到的菌株接种至纤维素、淀粉、蛋白液体发酵培养基中，70静止培养 72 小时后，取发酵液 5000rpm 离心 10min，得到粗酶液。分别用 DNS 法 10、改良的 Yoo 法 11和福林试剂法 12测定
11、菌株的纤维素酶活力、淀粉酶活力和蛋白酶活力。测定结果用 SAS 软件进行主成分分析，对菌株降解能力进行综合评价。2.4 菌种鉴定2.4.1 形态学特征和部分生理生化特性菌株纯化后，通过菌落特征以及简单染色初步判定菌株的形态特征。生理生化特性参照文献 13。2.4.2 菌株生长特性将 3-5 菌液接种至牛肉膏蛋白胨培养基中，改变某一条件，并保持其他条件不变，通过测定菌液的 OD600 值来研究温度、pH、盐度、装液量对菌株生长的影响。2.4.3 16S r DNA 鉴定以菌液为模板，用一般细菌的通用引物 27f、1492r 进行 PCR 扩增。体系：ddH 2O 37.5L ；27f 0.5L；
12、1492r 0.5L；10Taq Buffer 5 L；dNTP 1L；模板 5L；Taq 酶 0.5L。程序： 94预变性 10min；94变性 10s；退火温度采用梯度温度，退火 40s，温度分别为 52.1、53.5、54.7、55.6、56.9、58.1； 72延伸 1.5min；共 30 个循环。上述 30 个循环结束后，72眼神 10min。PCR 产物送至生物技术公司进行序列测定。所得序列与 GeneBank 数据库中序列进行 Blast 分析比对，用 MEGA4.0 软件构建系统发育树。3.结果与分析3.1 高温降解菌筛选结果样品经 70高温富集培养后，四 4 个样品中分离得到
13、 54 株耐高温细菌。经选择性培养基筛选，其中 9 株细菌具有降解至少一种底物的能力，将 9 株菌进行摇瓶发酵培养，测定粗酶液纤维素、蛋白、淀粉酶活，酶活力测定结果见表 1。表 1 酶活力测定结果Table1 Results of enzyme activity菌种名称纤维素酶活力（U/ml）蛋白酶活力（U/ml）淀粉酶活力（U/ml）综合指数1-6 14.380 2.119 55.829 26.483551-10 12.300 1.6889871-12 5.132 13.673 79.724 36.18592-5 19.330 8.9013912-15 69.820 30.264423-5
14、7.308 13.296 76.136 39.842773-6 13.420 3.718 3.3501224-3 4.510 6.329 4.0909184-7 6.004 7.290 54.462 27.70958从表 1 可以看出，综合考虑菌株的纤维素酶活力、蛋白酶活力和淀粉酶活力，分析计算得到 3-5 综合指数最高。菌株纤维素酶活力、蛋白酶活力、淀粉酶活力分别达到7.308U/ml、13.296U/ml、76.136U/ml，故选择该菌进行后续研究。3.2 菌种鉴定结果3.2.1 菌株 3-5 形态学特征和部分生理生化特性图 1 菌株 3-5 的菌落形态及菌体形态Fig.1 Coloni
15、al morphology and Morphology micrograph of 3-5菌株 3-5 在琼脂平板上的菌落呈白色、圆形，菌落表面干燥、较厚、不透明、边缘圆整（图 1） ；培养 24 小时后显微镜下菌体形态为长杆状，有芽孢产生，孢子内生，椭圆，位于菌体一端（图 2） ；革兰氏染色呈阳性。菌株部分生理生化特性见表 2。表 2 菌株 3-5 部分生理生化特征Table2 some physiological characteristers of 3-5菌株编号 运动性 接触酶 V-P MR 葡萄糖 -乳糖 蔗糖3-5 + + + 3.2.2 菌株 3-5 生长特性3.2.2.1 生
16、长曲线取菌株 3-5 的菌液接种于牛肉膏蛋白胨培养基中， 70静止培养，每隔 4 小时测定培养液 OD600 值。生长曲线如图 2 所示。菌株潜伏期较短，很快进入对数生长期，且对数期持续时间较长（24h） ，36h 后菌株进入稳定期。图 2 菌株 3-5 生长曲线Fig.2 growth curve of 3-53.2.2.2 最适生长温度图 33.2.2.3 最适生长 pH 值将培养 24h 的种子液接种至 pH 分别为 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 的牛肉膏蛋白胨培养基中，36h 后测定菌液 OD600 值，确定菌株最适生长 pH。培养基 pH 为5.0
17、9.0 时菌株生长良好，说明菌株对 pH 耐受范围较宽； pH 小于 4.0 或者大于 10.0 时菌株几乎不生长，菌株最适宜 pH 为 6.0（图 4） 。图 4 pH 对菌株生长的影响00.10.20.30.40.50.60.70.80 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56时 间 （ t）OD60000.10.20.30.40.53 4 5 6 7 8 9 10pH值OD600Fig.4 Effects of pH on the growth of 3-53.2.2.4 NaCl 浓度对菌株生长的影响将牛肉膏蛋白胨培养基中 NaCl 浓度设为 0%
18、、0.25% 、0.5%、1%、2% 、4%、8%，将培养 24h 的种子液接种至上述培养基中，培养 36h 后测定菌液 OD600 值。实验结果如图 5所示，菌株在 NaCl 浓度为 1%时生长最快，NaCl 超过 2%时菌株生长受到限制，浓度为 4%时，菌株几乎不再生长，而高朝辉（2005）筛选的菌株 CW2 在 10%NaCl 的培养基中仍可生长14， 与 CW2 相比，3-5 耐盐性较差。图 5 NaCl 浓度对菌株生长的影响Fig.5 Effects of concentration of sodium chloride on the growth of 3-53.2.2.4 装液量
19、对菌株生长的影响由于菌株在高温条件下静止培养，因此装液量会直接影响培养基中溶解氧含量的多少，从而影响细菌的生长。装液量在 10%时，细菌的生长达到最大值，而装液量大于 10%时，菌体生长量迅速下降（图 6） 。可能的原因为装液量 10%时，静止状态下供氧的速率能保证培养基中充足的氧浓度，而装液量大于 10%时，供氧速率下降，不能保证菌株生长所需的氧浓度，因此菌体生长量有所下降。00.20.40.60.80% 0.25% 0.50% 1% 2% 4% 5%NaCl浓 度OD60000.511.5210% 20% 30% 40% 50% 60%图 6 装液量对菌株生长的影响Fif.6 Effect
20、s of liquid medium volume on the growth of 3-53.2.3 3-5 16S r DNA 鉴定结果以 3-5 菌液为模板，利用细菌 16S rDNA 基因通用引物进行 PCR 扩增，成功扩增出长约 1. 5 kb 的 DNA 片段，测序结果与 GeneBank 中序列进行相似性分析，结果表明 3-5 与Geobacillus kaustophilus NCIMB 8547(T)的 16S rDNA 具有 99.103 的相似性。用 MEGA5.0构建系统发育树（图） ，图中可以看出 3-5 属于 Geobacillus 属中的一个种，与 Geobaci
21、llus uzenensis UT、 Geobacillus kaustophilus NCIMB 8547T（ X60618） 、 Geobacillus thermocatenulatus DSM730T（ Z26926） 形成 Geobacillus 属的一个进化种群。分离菌株与Geobacillus kaustophilus NCIMB 8547(T)具有 99.103%的相似性，但不在同一个分支上。图 7 3-5 系统发育树Fig.7 Phylogenetic Tree of 3-54.讨论高温菌筛选过程中由于培养温度过高，培养基中水分蒸发较快，培养基容易变干。将培养物置于培养箱中一
22、密闭的塑料桶内，并在培养箱中放一盛满水的容器，可有效缓解水分蒸发，防止培养基变干。目前国内外关于高温降解菌的报道多为降解一种底物的菌株，本研究所筛选到的菌株3-5 可同时降解三种底物的耐高温菌。该菌株纤维素酶活力、蛋白酶活力、淀粉酶活力分别达到 7.308U/ml、8.786U/ml、76.136U/ml，由于酶活测定条件、酶活力单位的定义等存在较大差异，因此菌株之间酶活力的可比性不大。Geobacilus garensi DSM 15378T(FR74979) Anoxybacilus thermarum AF/04T(AM402982) Anoxybacilus aylolyticus R
23、3CT(AJ61897)Anoxybacilus caldiprotelyticus DSM 15730T(FN428698)Bacilus methanolicus NCIMB 1313T(AB127) Geobacilus garensi GaT(AY1938) Geobacilus galctosidasius CF1BT(AM40859) Geobacilus vulcani 3S-1T(AJ293805)Anoxybacilus tepidamns S5-97T(AY56303) HN-5e Geobacilus zensi UT(AF276304) eobacilus kausto
24、philus NCIMB 8547T(X6018)Geobacilus thermocatenulatus DSM 730T(Z26926) Anoxybacilus rupiensi R270T(AJ879076) Bacilus mithi NBRC 1531T(AB27149) Geobacilus toebi BK-1T(AF32678)Anoxybacilus voinvskiensi TH13T(AB108) Geobacilus tearothermophilus NBRC 1250T(AB27157) Caldibacilus debils Tf(AJ56416) Geobac
25、ilus thermolevorans BGSC 96A1T(AY608936)eobacilus lituanicus N-3T(AY0405) Anoxybacilus contaminas LMG 2181T(AJ5130) Bacilus thermantrctius DSM 9572T(FR74957) Geobacilus thermoglucosidasius BGSC 95A1T(AY60891)Geobacilus ubteraneus 34T(AF276306) Geobacilus thermodenitrifcans NG80-2(CP057) Sacharoccus
26、thermophilus ATC 43125T(X70430) Geobacilus caldoxylosilyticus ATC 70356T(AF06751)Thalsobacilus devorans G-19.T(AJ7129)Geobacilus jurasicus DS1T(AY31240) Aeribacilus palidus DSM 3670T(Z26930) Geobacilus thermodenitrifcans DS 465T(Z26928)Anoxybacilus bogrvensi BT13T(AM409184)98928570234065646361353753
27、483272521918522 131Anoxybacilus caldiproteolyticus DSM 15730T(FN428698) Bacilus methanolicus NCIMB 1313T(AB127) Anoxybacilus contaminas LMG 2181T(AJ5130)Bacilus thermantarctius DSM 9572T(FR74957) Geobacilus thermoglucosidasius BGSC 95A1T(AY60891) Geobacilus thermodenitrifcans NG80-2(CP057)Anoxybacil
28、us rupiensi R270T(AJ879076) Geobacilus toebi BK-1T(AF32678) Anoxybacilus voinvskiensi TH13T(AB108)Bacilus mithi NBRC 1531T(AB27149) Geobacilus lituanicus N-3T(AY0405)Geobacilus thermolevorans BGSC 96A1T(AY608936)Geobacilus gargensi GaT(AY1938) Anoxybacilus tepidamans GS5-97T(AY56303) Geobacilus ubte
29、raneus4T(AF276306)Ge vulcni 3S-1T(J29385) Geobilus galtoidasius CF1B(AM059) Caldibacilus debils Tf(J56416)Geobacilus tearothermophilus NBRC 1250T(AB27157) eobacilus jurasicus D1T(Y31240) Ari il plidus DM 367T(Z26930)Gobcilus caldoxylosilyticus ATC 70356T(AF06751)il thrmodenitrifcans DSM 465T(Z26928)
30、 Anoxybacil bogrovensi B13T(AM409184)Thalsil dvora -19.1(129)Geobacilus kaustophilus NCIM 857T(X6018)Geobacilus thermocatenulatus DSM 730T(Z26926)HN-5e Gocilu uzeni UT(AF7634)Anxybaciluthermarum F/04T(AM402982)Sacharc therophilAC 312T(X70430) Geobacilus grgenis 138( 9) Anoxybcilus ayllytic M3T(J6897
31、)9830916123866519116100700110005667000001经过形态学、生理生化以及 16SrDNA 分析，将 3-5 鉴定为 Geobacillusi sp. 的菌株。Geobacillusi sp.是 2001 年新命名的一类细菌，是从 Bacillus 属中新分离出来的新属。Geobacillusi sp.为一组在表型上相近和系统发育上一致的嗜热菌群，它们的 16SrDNA 序列具有高达 98.5%到 99.2%的相似性，大多数能够在 50以上生长 15。Geobacillusi 的菌株可以产生耐高温的生物酶，Shang-Kai Tai 等 2004 年已从制糖厂的
32、废水中中筛选到可产生纤维素酶的高温菌株 Geobacillusthermoleovorans T4，其纤维素酶活力在 70达到最大值11.3mU/ml16；Dheeran 等 2009 年从印度喜马拉雅地区的温泉中分离的菌株 Geobacillus sp. IIPTN 可产生耐高温的 - 淀粉酶，其最适产酶温度为 60，最大酶活力可达到 135U/ml17；Rahman 等从马拉西亚棕榈油厂的肺水肿筛选到可产生脂肪酶的菌株 Geobacillus zalihaeT1T，其脂肪酶活力在 70最大，为 0.150U/ml18。在 60左右的中等高温度条件下，Geobacillus. 一般处于优势地
33、位，本研究筛选到的3-5 可在 80下生存，并且可以降解三种底物，因此在促进堆肥腐熟、提高堆肥品质方面具有很大的应用前景。1Xiao Y, Zeng G M, Yang Z H, etal. Continuous thermophilic composting (CTC) for rapid biodegradation and maturation of organic municipal solid waste J. Bioresource Technology, 2009,100:4807-4813.2薛红卫，赵树欣. 高温菌及用于废物处理的研究J. 天津轻工业学院学报，2002,42（
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