1、微生物检测培养基及试剂原理1.细菌与培养有关的生理结构。1.1 细胞壁（cell wall）主要成分：肽聚糖革兰氏阳性菌（G+）:细胞壁有 15-50 层肽聚糖，厚 20-80nm，组成三维立体框架，结构坚固致密。革兰氏染色紫色。革兰氏阴性菌（G-）:细胞壁有 1-2 层肽聚糖，厚 10-15nm，不能形成三维结构。但在肽聚糖之外，有 G-特有的结构-外膜。革兰氏染色红色。1.2 细胞膜（cell membrance）细胞膜位于细胞壁内侧，紧包住细胞质，结构为平行的磷脂双分子层，其中镶嵌有多重蛋白质，大多为酶类和载体蛋白。功能：物质转运 呼吸 分泌 生物合成胞质周围间隙：G-菌的细胞膜与细胞壁
2、之间的空间。此处聚集了若干种胞外酶，主要是水解酶。1.3 细胞质（cytoplasm）细胞质的主要成分是水、蛋白质、核酸、糖、无机盐等。细胞质含有多种酶系统，是细菌合成蛋白质和 RNA 的场所。细菌的分解代谢和合成代谢都在胞质中进行。1.4 核蛋白体核蛋白体是细菌合成蛋白质的场所。链霉素能与细菌核蛋白体的 30s 亚基结合；红霉素能与50s 亚基结合，干扰细菌的蛋白质合成，从而杀灭细菌。2. 细菌的物理性状细菌虽小，也有独立的生命活动。能从外界环境中摄取营养原料，获得能量，合成菌体自身成分。同时排出废物，完成新陈代谢，从而得以生长繁殖。-表面积葡萄球菌直径约 1um，则每立方厘米的表面积可达
3、60000cm2.一般生物体直径约 1cm，则每立方厘米体积的表面积只有 6cm2.-带电现象PHPI(带负电) PH=PI PH0.碳源（约占干重 50%）：碳源是细菌合成菌体成分和获得能源的主要来源。培养基碳源的供应主要来自糖类（C.H.O） 、有机酸、醇类和脂类。氮源（约占细胞干重的 12%-15%）:构成重要生命物质蛋白质和核酸等的主要元素。氨基酸异养型-需从外界吸收现成的氨基酸作为氮源；培养基中的氮源主要来自蛋白胨、氨基酸以及动、植物组织浸出液。氨基酸自养型-能把尿素、铵盐、硝酸盐甚至氮气等简单氮源自行合成所要的氨基酸-菌体蛋白（SCP 或食用菌）无机盐：参与构成菌体成分：调节细胞内
4、外渗透压：与酶活性有关。其中P、K 、Na、Mg、S、Fe 等需要量较多（K2HPO4、MgSO4） ；Cl 、 Mn、Zn、Co 、Cu等只需微量。生长因子：许多细菌的生长还必需一些其自身不能合成的生长因子，主要是 B 族维生素（硫胺素 VB1,核黄素 VB2，泛酸 VB3，吡哆素 VB6,烟酸 VB5，对氨基苯甲酸 PABA）和某些氨基酸、嘌呤、嘧啶。细菌摄取营养的机理：1. 单纯扩散 被动吸收2. 促进扩散（细胞膜上的特异性载体蛋白/渗透酶）3. 主动吸收（耗能，通过膜上载体蛋白）4. 基团转位（耗能，通过膜上载体蛋白，运送前后溶质分子改变）环境条件：5. PH 值：大多数细菌生长最适酸
5、碱度为中性或弱碱性即 PH7.2-7.6。在此 PH 时，细菌的酶活性最强。考虑培养基成分对 PH 的调节能力（PH 的内源） 。6. 1.1 借助磷酸盐缓冲溶液（K 2HPO4 和 KH2PO4）7. 1.2 以 CaCO3 作“备用碱”进行调节。8. 2.渗透压（由溶液中所含的分子或离子的数量决定）与细胞渗透压相等的等渗溶液最适宜微生物的生长，高渗透溶液则会使细胞发生质壁分离9. 低渗溶液则会使细胞吸水膨胀，形成很高的膨压。10. 水活度（aw）：表示微生物可实际利用的自由水或游离水的含量。11. 氧（氧化还原电势）：需氧菌利用分子氧作为最后受氢体以完成呼吸作用。厌氧菌则在无氧环境中才能生
6、长。12. .二氧化碳：一般细菌在代谢过程中都需要 CO2.13. 温度：细菌生长的温度极限为-7_90 度。病原菌最适生长温度为人体温度 372.4. 细菌分类检测原理革兰氏染色法的意义就在于鉴别细菌，把众多的细菌分为两大类，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。大多数化脓性球菌都属于革兰氏氏阳性菌，它们能产生外毒素使人致病。而大多数肠道菌多属于革兰氏阴性菌，它们产生内毒素，靠内毒素使人致病。1. 培养基中各种抑菌物质对革兰氏阴性，阳性细菌的不同影响。2. 各种细菌发酵糖类物质的不同结果。产酸产气/产酸不产气/不产酸不产气3. 对相应物质的代谢产物不同，各种生化鉴定。5. 分离与鉴定培养基中相关物质的
7、作用原理5.1 对革兰氏阳性细菌（大肠菌群，沙门氏菌， ）起抑制作用的物质。1. 月桂基硫酸钠：别名月桂醇硫酸钠；十二烷基硫酸钠 ；K12；发泡粉；表面活性作用强，属阴离子表面活性剂具有乳化作用。2. 胆盐/牛胆粉/三号胆盐/去氧胆酸钠：是一种胆酸的钠盐，是胆酸的羧基和甘氨酸或牛磺酸(C 2H7NO3S)的氨基(C 2H5NO2)，通过酰胺键结合而成。可降低培养基与细菌细胞膜界面上的表面张力，使细胞膜紊乱，导致细菌自溶。肠杆菌科细菌在肠道内长期与胆汁接触。对胆盐有一定的抵抗力。合适的胆盐量能促进该科细菌的生长。胆盐遇酸生成沉淀，使菌落色素不致扩散从而有利于鉴别。胆盐中含有一定量的胆红素、粘蛋白
8、、色氨酸，对不受胆盐抑制的细菌生长有营养作用。3. 煌绿：煌绿（亮绿）：（C 27H35N3ClBr）抑制革兰氏阳性菌和大多数非沙门氏菌的革兰氏阴性杆菌，通常抑制发酵乳糖、蔗糖的细菌，抑菌原理同结晶紫。常用于分离除伤寒外的沙门氏菌培养基。煌绿和枸櫞酸钠对大腸菌的生长、菌体蛋白质的合成和糖的利用都有显著的抑制作用,以煌绿的作用为较强。枸酸钠能抑制大腸菌的呼吸,而煌绿的抑制作用则较弱。混合胆盐及硫代硫酸钠对大腸菌的上述代谢活动都没有抑制作用。4. 伊红-美兰：两种苯胺类染料，它们可以抑制革兰氏阳性菌的生长。伊红 美兰5. 结晶紫：结晶紫 是一种医药名称，俗称：紫药水，属三苯甲烷类染料消毒剂，能与微
9、生物酶系统发生氢离子的竞争性对抗，使酶成为无活性的氧化状态，而发挥杀菌作用。主要对革兰阳性菌如葡萄球菌、白喉杆菌，以及绿脓杆菌、白念珠菌、表皮癣菌有杀灭作用，对其它革兰阴性菌和抗酸杆菌几乎无作用；无刺激性及毒性。1g 溶于 10ml 乙醇、15ml 甘油，溶于水和氯仿，水溶液和乙醇液呈紫色，几乎不溶于乙醚酸碱指示剂，pH 0.5(绿)2.0( 蓝) ；非水溶液滴定指示剂6. 氰化钾（KCN）:氰化钾是剧毒药 , 使用时应小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行。试验失败的主要原因是封口不严, 氰化钾逐渐分解，产生氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低，细菌生长，因而造成假阳性反应。试验
10、时对每一环节都要特别注意。7. 亚硫酸盐：是一类很早即在世界范围内广泛使用的食品添加剂:可作为食品漂白剂,防腐剂;可抑制非酶褐变和酶促褐变,防止食品褐变,使水果不至黑变,还能防止鲜虾生成黑斑;在酸性介质中,还是十分有效的抗菌剂.5.2 对大肠埃希氏菌起抑制作用的试剂：1.亚硒酸盐（Na2SeO3，NaHSeO3）:抑制大肠埃希氏菌，对沙门氏菌抑制较弱；应用不高于 100的流动蒸汽灭菌。若灭菌不当，培养基出现红色，为硒析出，不能使用。2.四硫磺酸盐（Na2S4O6 ）: Na2S2O3 + I2 = Na2S4O6 + 2NaI抑制大肠埃希氏菌，对沙门氏菌无抑制作用。四硫磺酸钠对热颇为敏感，极易
11、分解。故加碘后不能加热。5.3 对革兰氏阴性菌起抑菌作用的试剂：1.萘啶酮酸：抗细菌性合成化合物之一，具有宽广的抗菌谱，特别对革兰氏阴性菌有很强的效力，对大肠杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌及变形杆菌等，具抑菌和杀菌作用。对动物及人毒性低。其作用机制是抑制细菌脱氧核苷酸的合成。2.吖啶黄素： 3,6-二氨基吖啶盐酸盐与氯化 3,6-二氨基-10-甲基吖啶饯盐酸盐的混合物为吖啶黄素(acriflavine，熔点 260分解):红棕色结晶粉末，水溶液为暗红色，稀释时带荧光；溶于醇，几乎不溶于氯仿、乙醚；用作抑菌剂，杀菌剂及荧光指示剂。也可作为酵母菌小菌落突变型的诱变剂和用于布鲁氏菌属(Brucetla)光
12、滑型和粗糙型菌株的检出3.多粘菌素：由多粘芽胞杆菌（bacilluspolymyxa）产生的一组多肽类抗生素。多粘菌素b和e供药用。常用其硫酸盐，为白色结晶性粉末，易溶于水，有引湿性。在酸性溶液中稳定，其中性溶液在室温放置一周不影响效价，碱性溶液不稳定。其抗菌谱及临床应用与多粘菌素E相似，对革兰阴性杆菌，如大肠杆菌、绿脓杆菌、副大肠杆菌、肺炎克雷白杆菌、嗜酸杆菌、百日咳杆菌及痢疾杆菌等有抑制或杀菌作用4.头孢他啶：为半合成的第三代头孢菌素。抗菌活力较强，抗菌谱较广，对革兰阳性或阴性菌均具有较强作用。对革兰阳性菌、阴性菌产生的 内酰胺酶具有高度的稳定性 ，该品对绿脓杆菌、大肠杆菌、克雷白杆菌、变
13、形杆菌、肠球菌、沙门菌、志贺菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、金葡菌、溶血性链球菌、肺炎球菌及产气杆菌等具有强的抗菌活性，特别是对于绿脓杆菌作用最强抗生素。抗菌作用机制为影响细菌细胞壁的合成。与其它头孢菌素类药相似，该品能抑制转肽酶在细胞壁合成的最后一步交叉连接中的转肽作用，使交叉连接不能形成，从而影响细胞壁合成，导致细菌溶菌死亡 5.亚碲酸钾：抑制革兰氏阴性菌生长；由于弧菌对其抵抗力较强，故也常用于霍乱、副溶血弧菌的分离培养基中；一些细菌能还原亚碲酸钾，使菌落中心呈现黑褐色，便于鉴别。5.4 对非葡球菌起抑制作用的试剂：1. 2%,7.5%,10% NaCl 溶液：抑制大部分非葡球菌的生长。2.
14、 氯化锂（LiCl）5.5 培养基中常用抗生素：多粘菌素 B；链霉素；万古霉素；新生霉素；二性霉素；磺胺嘧啶；放线菌酮。6. 培养基中常用的酸碱指示剂指示剂大多为弱酸或弱碱物质， 。单色指示剂：如：酚酞（PH8.3 红色，8.3 无色）双色指示剂：如：酚红 （分子态显色）HindH + + Ind-用于观察细菌对糖、醇类是否利用分解。氧化还原指示剂，如：美兰，刃天青等。抑菌作用。6.1 伊红-美兰（指示酸碱，产酸则出现紫黑色菌落，带金属光泽）伊红为酸性染料，美蓝为碱性染料。当大肠杆菌分解乳糖产酸时细菌带正电荷被染成红色，再与美蓝结合形成紫黑色菌落，并带有绿色金属光泽。而产气杆菌则形成呈棕色的大
15、菌落。 在碱性环境中不分解乳糖产酸的细菌不着色，伊红和美蓝不能结合，故沙门氏菌等为无色或琥珀色半透明菌落。金葡菌在此培养基上不生长。 常用的伊红美蓝乳糖培养基，可用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌等细菌。如果有大肠杆菌，因其强烈分解乳糖而产生大量的混合酸，菌体带 H+，故菌落被染成深紫色，从菌落表面的反射光中还可以看到金属光泽。6.2 对二甲基苯甲醛（用于生化鉴定-吲哚鉴定实验）对二甲氨基苯甲醛称为埃利希试剂（Ehrlich reagent ）,用于检测及定量分析色氨酸的反应。它可使吡咯、吲哚衍生物显色，在被测试溶液中加入数滴稀盐酸或稀硫酸时，加热后则呈现紫红色。显色是由于引起吡咯环的
16、位与试剂发生缩合反应，产生有色物质所致。该反应广泛用于含色氨酸蛋白质的定量分析。在临床上还可用于检测尿中色胆素原。二甲氨基苯甲醛还可用于定量测定微量联氨，原理是：在酸性条件下，联氨与对二甲氨基苯甲醛生成黄色的络合物，然后采用分光光度法测定。用于测定吲哚、粪臭素、尿蓝母、色氨酸、白蛋白、过氧化氢、胂凡钠明、邻氨基苯甲酸、安替比林麦角碱等，还用以区别血清发疹和腥红热。制造染料。吲哚：吲哚及其同系物和衍生物广泛存在于自然界，主要存在于天然花油，如茉莉花、苦橙花、水仙花、香罗兰等中。吲哚是一种亚胺，具有弱碱性；杂环的双键一般不发生加成反应；在强酸的作用下可发生二聚合和三聚合作用；在特殊的条件下，能进行
17、芳香亲电取代反应，3 位上的氢优先被取代，如用磺酰氯反应，可以得到 3-氯吲哚。3 位上还可发生多种反应，如形成格氏试剂，与 醛缩合，以及发生曼尼希反应等。色氨酸： 色氨酸是植物体内生长素生物合成重要的前体物质，其结构与 IAA 相似，在高等植物中普遍存在。可以通过 色氨酸合成生长素，有两条途径： （1）色氨酸首先氧化脱氨形成吲哚丙酮，再脱羧形成吲哚乙醛；吲哚乙醛在相应酶的催化下最终氧化为吲哚乙酸。（2）色氨酸先脱羧形成色胺，然后再由色胺氧化脱氨形成吲哚乙酸。6.3 甲基红 甲基红是常用的酸碱指示剂之一，常浓度为 0.1%乙醇溶液，也用于原生动物活体染色。pH 变色范围 4.4(红) 6.2(
18、黄) ；滴定氨、弱有机碱和生物碱，但不适用于除草酸和苦味酸以外的有机酸；可与溴甲酚绿和亚甲基蓝组成混合指示剂以缩短变色域和提高变色的敏锐性；沉淀滴定的吸附指示剂，如用硝酸钍滴定氟离子；检定游离氯、亚氯酸盐等氧化剂；甲基红（MR）试验：肠杆菌科的细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖，产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，生成甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸。大肠杆菌分解丙酮 酸，次生的酸类较多，pH 为 4.5 或更低，甲基红呈现红色（阳性） 。在产气杆菌的培养液中一部分丙酮酸变为中性的乙酰甲基甲醇，生成的酸类较少，pH 在 5.4 以上，甲基红呈现桔黄色（阴性） 。 丙酮酸：体内产生的三碳酮酸，它是糖酵解途径的最终产
19、物，在细胞浆中还原成乳酸供能，或进入线粒体内氧化生成乙酰CoA，进入三羧酸循环，被氧化成二氧化碳和水，完成葡萄糖的有氧氧化供能过程。因此，丙酮酸是糖代谢中具有关键作用的中间产物。丙酮酸可通过乙酰 CoA 和三羧酸循环实现体内糖、 脂肪和氨基酸间的互相转化，因此，丙酮酸在 三大营养物质的代谢联系中起着重要的枢纽作用。乙酰甲基甲醇生成试验（VP 试验）：细菌发酵葡萄糖生成丙酮酸，某些细菌可使丙酮酸脱羧形成乙酰甲基甲醇。在碱性溶液中，乙酰甲基甲醇可在空气中氧化成二乙酰（丁二酮） 。二乙酰再与蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物。试验中加入 萘酚是作催化剂，使反应的颜色加深，提高反应的敏感性。 精
20、氨酸：精氨酸可以算为一种双性氨基酸，这是因与主链最接近的旁链部份是较长、有机及疏水的，而 另一端的旁链则是一个胍基。这个胍基的酸度系数（pKa 值）为 12.48，在中性、酸性或碱性的环境下都是带正电殛的。因为在其双键及氮孤立电子对之间的共轭体系，使得其正电殛离开原位。这个胍基能形成多重的氢键。6.4 溴麝香草酚蓝（酸碱指示剂，用于枸橼酸盐利用实验）：也叫溴百里酚蓝。 浅玫瑰色结晶性粉末，熔点 200202， 易溶于乙醇醚甲醇及稀氢氧化碱溶液。稍溶于苯甲苯及二甲苯，微溶于水，几乎不溶于石油醚。 在碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈黄色。 变色范围 pH6.0(黄) 7.6( 蓝) 。 普通水是中
21、性，pH 也就是 7 左右，差不多呈淡蓝. 溶有二氧化碳后，由于会形成碳酸，碳酸是弱酸，因此 pH 不会降太多，变黄。当中过渡颜色是绿色或检测 CO2 的产生：使澄清石灰水变浑浊，并使溴麝香草酚蓝水溶液由蓝变绿再变黄6.5 中性红：学名“3- 氨基-7- 甲氨基-2- 甲基吩嗪盐酸盐” ，是细胞活体染色和酸碱性指示剂的一种碱性吩嗪染料。中性红是一种弱碱性 pH 指示剂，变色范围 pH6.48.0 之间（由红变黄） 。在中性或微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收中性红并向液泡中排泌，由于液泡在一般情况下呈酸性反应，因此，进入液泡的中性红便解离出大量阳离子而呈现樱桃红色，在这种情况下，原生质和细胞
22、壁一般不着色；死细胞由于原生质变性凝固，细胞液不能维持在液泡内，因此，用中性红染色后，不产生液泡着色现象，相反，中性红的阳离子，却与带有一定负电荷的原生质及细胞核结合，而使原生质与细胞核染色。 中性红的 0.1%的 60%乙醇溶液的变色范围是 6.88.0 红黄橙 pK=7.4 配方:中性红 0.1 g; 蒸馏水 100 ml. 使用时再稀释 10 倍左右.6.6 革兰氏染液：6.7 硫酸亚铁-亚硫酸铋/柠檬酸铋铵 -亚硫酸钠 ：亚硫酸产生硫化氢，并与铁产生沉淀，亚硫酸铋被还原生成金属铋，使阳性培养物为具有金属光泽的棕色到黑色菌落,亚硫酸铋被还原生成金属铋6.8 苯酚红：由酚红(Phenols
23、ulfonphthalein)所配制成的 0.020.05%的醇溶液。当被测溶液的 pH 值小于6.8，则指示剂呈现黄色的酸性反应；若被测溶液的 pH 值大于 8.4，则指示剂呈现红色的碱性反应。赖氨酸：赖氨酸是人体必需氨基酸之一，能促进人 体发育、增强免疫功能，并有提高中枢神经组织功能的作用。赖氨酸为 碱性必需氨基酸。由于谷物食品中的赖氨酸含量甚低，且在加工过程中 易被破坏而缺乏，故称为第一限制性氨基酸。6.9 酸性复红： 酸性复红，绿色金属光泽的深红色 粉末或橄榄色到深橄榄绿色粗粉或小块；为玫苯胺(RosAnilinE)二磺酸钠盐和三磺酸钠盐、铵盐的混合物；1g 溶于 7ml 水，微溶于乙
24、醇；稀水溶液呈紫红色，极稀的水溶液(110000) 滴入浓氢氧化钠溶液而褪色，但对浓盐酸不褪色；红色到无色的 pH为 1214；最大吸收波长 540545nm(10mg/L,0.01%盐酸) ；有刺激性6.10 溴甲酚紫：酸碱指示剂，也可以用作乳酸乳球菌的培养基制备时的指示剂，其 pH 变色范围 5.2(黄色) 6.8(紫色) ；吸附指示剂；氨基酸色谱法内标；银盐法滴定硫氰酸盐；分光光度法沉淀血清蛋白。6.11 ONPG: ONPG 可迅速进入细菌细胞，被半乳糖苷酶水解，释出黄色的邻位硝基苯酚 (Orthonitrphenyl，ONP)，可以比色测定。乳糖测定就比较麻烦。另外，乳糖迟缓发酵菌只
25、有 -D半乳糖苷酶(胞内酶) ，而缺乏-半乳糖苷酶透性酶，因而乳糖进入细菌细胞很慢6.11 七叶苷具有抗炎、抗菌、抗血凝、镇痛等活性，对小鼠有显著的利尿作用。可抑制大鼠眼晶状体的醛糖还原酶，是枯草杆菌的生长抑制剂，同时对化学性至癌亦有抑制作用。6，7 二羟基香豆素：白色或淡黄色针状结晶6.12 甘露醇：白色针状结晶。熔点 166，相对密度 1.52，1.489（20），沸点 290-295（467kPa）。1g该品可溶于约 5.5ml 水(约 18%，25) 、83ml 醇，较多地溶于热水，溶于 吡啶和苯胺，不溶于醚。水溶液呈碱性。该品是山梨糖醇的异构化体，山梨糖醇的吸湿性很强，而该品完全没有吸湿性。甘露醇有甜味，其甜度相当于蔗糖的 70%。
