灵芝多糖的结构特征研究.doc

上传人:创****公 文档编号:3279335 上传时间:2019-05-28 格式:DOC 页数:12 大小:346KB
下载 相关 举报
灵芝多糖的结构特征研究.doc_第1页
第1页 / 共12页
灵芝多糖的结构特征研究.doc_第2页
第2页 / 共12页
灵芝多糖的结构特征研究.doc_第3页
第3页 / 共12页
灵芝多糖的结构特征研究.doc_第4页
第4页 / 共12页
灵芝多糖的结构特征研究.doc_第5页
第5页 / 共12页
点击查看更多>>
资源描述

1、 灵芝多糖的结构特性分析何晋浙 邵平 孟祥河 孙培龙 (浙江工业大学生物与环境工程学院食品系, 杭州 310032) 摘要 采用沸水回流法从灵芝子实体中提取多糖,经 Sevage法除蛋白,乙醇沉淀,离心、透析、膜分离,浓缩、冻干后得灵芝多糖。经高碘酸氧化、Smith 降解及甲基化反应,并利用多糖及刚果红混合液在碱性溶液中的波长的红移变化,通过 UV-VIS、IR、GC、GC-MS、NMR 对灵芝水提多糖的结构特征及三螺旋体结构进行分析研究。 结果表明:灵芝多糖含有三螺旋体构型,GC-MS 分析灵芝多糖的主要单糖组分为葡萄糖,和少量的半乳糖、甘露糖、木糖、艾杜糖,IR 及 1HNMR分析多糖为

2、-构型, 高碘酸氧化、Smith降解和甲基化分析说明:多糖主要为(13)糖苷键连接构型, 并伴有少量的 16 位支链键连接的结构, 灵芝多糖是由 D-葡萄糖单元通过 -(13)糖苷键连接葡聚多糖,其主要构型特征为 (13)- D-线性连接的骨架结构,其主要结构为下列构型:关键词 灵芝多糖,结构特性,-葡聚糖,三螺旋体1 引 言灵芝是中国名贵的中药材,其具有滋补强身、扶正固本、久服有轻身延年之功效,属多孔菌科类真菌 1。 其水提物的主要活性组分是多糖。近年来越来越多的报告显示真菌多糖具有强烈的抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗氧化、降血糖及免疫活性作用 2。而真菌多糖的生物活性与多糖的结构存在特别重要的

3、构效关系 3。目前,虽然对灵芝多糖的活性研究报道较多,但对其多糖结构作全面深入的分析研究报道并不是很多。蒋志国等 4采用HSCCC方法分离纯化香菇中的多糖;孙元琳等 5采用红外光谱和GC方法分析当归多糖水解后的单糖组成。本研究主要对赤灵芝多糖结构进行提取、纯化、通过膜分离,并经高碘酸氧化、及甲基化反应,通过紫外可见光谱(UV-VIS) 、红外光谱(IR) 、GC-MS、核磁共振(NMR)对灵芝多糖进行三旋螺旋体结构及多糖的结构特性进行了全面的分析研究。以进一步促进灵芝多糖的药理作用及其构效关系的研究。2 实验部分本文系浙江省科技厅和国家高技术研究发展计划 863 计划资助项目(No.2008C

4、32030,No.2007AA10Z337)2.1 仪器与试剂Labscale小型切向流超滤系统(美国 Millipore公司), UV2450紫外分光光度计(日本岛津公司);Nicolet6700 型红外光谱仪(美国尼高力公司);美国Agilent 6890N 气相色谱仪,毛细管色谱柱:DB1701;质谱为 Finnigan trace DSQII气相色谱质谱联用仪(美国热电公司) ,色谱柱:DB1;核磁共振仪为:ANANCE (500M)(瑞士 Bruker公司)。三氟乙酸、赤鲜醇、岩藻糖、阿拉伯糖为进口试剂,其余单糖、化学试剂均由国内化学试剂公司采购,为分析纯试剂,Sevage 为氯仿-

5、正丁醇(4:1,v/v)混合溶液。 2.2 实验方法2.2.1 多糖的提取与纯化 灵芝子实体为灵芝(金华寿县谷药业有限公司提供) 。灵芝子实体切片后粉碎,分多次称取 60克,按料液比 1:10 在微沸状态下回流 2h,取上层清夜,残渣反复提取 3次,合并上清液,真空浓缩。并以 Sevage法除蛋白,在每 100mL 的浓缩液加 20mLSevage 试剂,剧烈震荡 30 min,以4000rmin-1的速率离心 15min,取上清液加无水乙醇至溶液含量达 95%,静置过夜, 收集沉淀物。再依次用 95%乙醇,乙醚,丙酮洗涤各两次,得粗多糖。再用蒸馏水溶解,经 Millpope超滤器和采用 10

6、K膜包蒸馏水透析 8 h,分别以10K、30K、50K、100K 膜包下截流组分,浓缩、以乙醇沉淀提取,冷冻干燥制得灵芝多糖。2.2.2 甲基化反应 以改良Hakmori法进行多糖甲基化反应 6。经O 2P5充分干燥的灵芝多糖样品 15mg置于反应瓶中,在充N 2及磁力搅拌下,以6mL干燥的二甲亚砜(DMSO)至充分溶解多糖样品,加入240mgNaOH,搅拌30min,在室温下避光过液,随后在冰浴中,缓慢加入3.6mLICH 3,在常温超声浴中反应8min后,通N2驱赶剩余的ICH 3,重复2次甲基化,12K MWCO透析袋流水透析24 h,浓缩和冻干,至多糖甲基化IR图谱在3400cm -1

7、处无羟基吸收峰。2.2.3 多糖乙酰化反应 在 6mg甲基化多糖样品中加入 2mL 甲酸,100密闭水解 6h,减压蒸发至干,再加人 2 mol/L三氟乙酸 4 mL,110密闭水解 6h,减压蒸发至干,加甲醇 3mL, 减压蒸发至干,如此重复 3次。溶解于 5 mL蒸馏水中,加 30mg硼氢化钠(NaBH4)于室温下还原 3 h,然后用冰醋酸中和过量的NaBH4,加入少量甲醇,减压浓缩蒸干,重复 3次。真空干燥过夜后,加 12mL醋酸酐,100反应 1h。再加入少量甲苯,减压浓缩蒸干,溶于 3 mL氯仿中,用少量蒸馏水充分振荡洗涤,如此重复 3次。氯仿层以适量无水硫酸钠过夜干燥后,过滤用氯仿

8、定容至 10mL,供 GC-MS分析。 2.2.4 多糖高碘酸氧化 分别取 0、0.5、1.0、1.5 、2.0、4.0mL 15 mmol/L高碘酸钠标准溶液蒸馏水定容至 4mL,取 0.1mL稀释 250倍后,在紫外 223nm下测定其光密度,进行标准曲线制作。称取灵芝多糖 25mg,少量水溶解后,加入 15 mmolL-1高碘酸钠溶解,定容至 25mL,置于暗处,室温下进行反应,于0、6、12、18间隔 6小时取样 0.1mL,蒸馏水稀释 250倍后测定,直至光密度达稳定值,加乙二醇终止反应,由高碘酸钠标准曲线,计算高碘酸消耗量,同时取2 mL反应液测定甲酸耗量。剩余部分进行 Smith

9、降解:12K MWCO透析袋流水透析 48h,未透出液减压蒸馏浓缩至约 30 mL, 置小烧瓶中, 加 150mg硼氢化钠避光还原 28 h, 然后用醋酸中和反应液至中性,浓缩、蒸干,如此重复 3次,获多聚糖醇。称取 10mg多聚糖醇,再加人 2 mol/L三氟乙酸 2mL,同上述乙酰化方法进行水解、乙酰化反应,进行 GC-MS分析。2.2.5 三螺旋体结构分析 由多糖和刚果红混合物在 NaOH碱性介质下,由可见光谱的最大吸收波长的漂移变化进行分析。2.2.6 色谱操作条件 检测器为火焰检测器(FID),气相色谱条件为:柱温初温150,以 10/min,升至 220,恒温 30min。进样口温

10、度 230,分流比1:25,检测器温度 250,氢气 35mL/min,空气 350mL/min,尾吹气35mL/min。气质色谱条件以 2/min 升温,其他操作条件与 GC同。3.结果与讨论3.1 多糖的红外光谱(IR)分析多糖分别经 10K、30K、50K、100K 膜包分离后,以 100K以上的膜分离多糖截留组分含量最高,以该组分多糖进行特性分析研究。图 1 显示了灵芝多糖(GLP )的红外光谱,其特征谱线分别在 3419.1, 2926.1, 1623.2, 1400.3, 1078.4 and 894 cm-1, 具有明显的多糖特征谱线 7,3419 cm -1是由于 O-H基的伸

11、缩振荡引起的,2926 cm-1较弱的峰是 C-H 键伸缩振动引起的,1623 cm -1处出现的较强的峰是 C=O 伸缩振动,1400cm -1附近出现的峰是由于 C-H的变角振动, 1078 cm-1附近出现的峰是常见的吡喃糖环内酯和羟基的吸收峰共振吸收峰,是由于糖环上 C-0-C醚键的不对称伸缩振动, 构成了糖类的特征吸收峰,也是葡聚糖典型的红外光谱信号。此外,894.8 cm -1是典型的吡喃葡聚糖和 -型糖苷键连接特征吸收峰 8。说明灵芝多糖是 -型葡聚糖构型。40350302502015010500240608010 894.1078.4140.31623.296.13419. 5

12、32. T%Wavenumbers (cm-1)图 1 灵芝多糖的红外光谱Fig.1 The FT-IR spectrum of GLP3.2 高碘酸氧化及 Smith 降解灵芝多糖经高碘酸氧化 100h稳定后,用紫外分光光度法 223 nm 波长检测反应终止产物,测得每摩尔己糖消耗 0.035mmol mol IO-4, 释放甲酸0.017mmol。分析结果显示,高碘酸消耗量极低,说明灵芝多糖很可能主要存在一些不可被高碘酸氧化的 13 糖苷键, 而高碘酸的消耗量与甲酸的释放量约为2:1,提示可能存在少量的以 16 糖苷键或非还原末端基(1)连接的糖苷键。由于 12, 14 位键合的糖基经高碘

13、酸氧化后,每个糖基仅消耗一分子高碘酸,并不释放甲酸,结合 Smith 降解产物 GC及 GC-MS的分析,定量测定的主要单糖糖醇产物为葡萄糖,少量的为半乳糖、甘露糖、木糖,并有极少量的甘油,而生成的降解产物中未测得赤藓糖,推测可能不存在 12, 14 位键,说明多糖主干结构为 13 葡聚糖。3.3 甲基化反应灵芝多糖甲基化产物的GC-MS总离子图如2所示,灵芝多糖的主要组分为葡萄糖(Glc,RT:18.78)(气相色谱外标定量分析得到同样结果)。 甲基化分析结果如表1所示,糖链的骨架结构主要是由3)Glup1组成,并存在少量的13链接的半乳糖(Gal) 、甘露糖(Man) 、木糖(Xyl)、艾

14、杜糖(Idi) ,和少量的以16位键连接葡萄糖和艾杜糖,其他的产生的一些单糖数量非常低可忽略不计。离子碎片图见图3,其中质谱中的m/z=43是甲基化乙酸糖酯(PMAA)的基峰,是失去乙酰基离子(CH 3CO+)形成的,质谱峰中m/z比为145、259,289的碎片是己糖质谱图的特征蜂,PMAA的次级碎片离子主要为:CH 3COOH(60)、 CH 3OH(32)、CH2O(30)。分析结果与高碘酸氧化、Smith降解和部分酸水解等结果一致。 图2 甲基化糖醇GCMS总离子图Fig.2 GCMS total ion graph for methylated alditol 图 3 甲基化乙酰基葡

15、萄糖醇离子碎片 Fig.3 Methylation acetyl glucitol ion fragments mapRelativeAbundance相对吸收强度 m/zRelativeAbundance相对吸收强度Time(min)表 1 灵芝多糖 GCMS主要甲基化糖分析数据Tab.1 GCMS data for the methylated sugar of GLP甲基化糖醇Methylated alditol主要离子碎片Mainion ion fragment (m/z) 连接类型Type of linkage摩尔比Mol ratio 2,4,6-tri-O-methyl galac

16、titol 2,4,6-tri-O-methyl glucitol 2,4,6-tri-O-methyl mannitol 2,3,4-tri-O-methyl iditol2,3,4-tri-O-methyl glucitol43, 85,103,115,139,187,217,259,28943, 85,103,115,145,187,217,259,28943,85,103,115,145,187,217,259,28943,85,103,115,145,161,187,25943,85,103,115,145,161,187,2593)Glap13)Glup13)Manp16)Idip

17、16)Glup15.7970.138.557.158.733.4 核磁光谱(NMR)分析核磁分析 1H谱和 13C谱分别见图4a和图4b。 1H-NMR谱显示,质子信号几乎都出现在3.34.89区间内,提示是典型的多糖信号,且H-1质子化学位移4.95,可判断为型-链接的吡喃糖苷键构型 9,10。此外, 13C -NMR谱显示有六个清晰的碳信号,表明共有六个碳,推测该化合物为单糖,其中化学位移104异头碳信号为 1个,是型-糖苷键构型,为-D-葡聚糖的异头碳 11,而且碳信号在11090之间只有一个信号,这进一步说明每个重复糖单位中有1个糖基单元的存在 10,12 ,从而可确认每个重复单位中1

18、个糖基单元都是六碳糖,其它的碳信号化学位移在 105.19, 78.54, 76.72, 72.25,70.75 和 62.63处,62.6378.54是糖环碳,据碳谱信号、位移及结合GC-MS分析,该糖信号为一个葡萄糖构型,六个碳信号化学位移分别相应于C-1(105.19), C-3(78.54) , C-5(76.72),C-2(72.25), C-4 (70.75)和 C-6(62.63),而未发生取代的C-2,C-3,C-4的化学位移通常在70.0-77.0,如在78以上有信号表示肯定有一个碳发生取代 6,说明C-3发生了取代。在多糖结构中,异头碳C-1信号出现在105.19是由于(1

19、3)-D-吡喃葡萄糖连接构型产生的 ,C-3 和 C-6信号分别出现在78.54和62.63处,是由于-吡喃葡萄糖基的存在,碳谱的信息给出了非常明显的灵芝多糖是由- (13)-D-糖苷键连接的葡聚糖结构信号。这与红外及GC-MS分析相一致。以上结果分析,灵芝多糖的结构是一个主链为线性骨架结构 (13)-连接的-D-Glcp多糖,并伴有少量的16位键连接的,其主要结构为下列构型:3)-D-Glcp-(13)-D-Glcp-(13)- n-D-Glcp-(1.61 -D-Glcp这也与许多真菌多糖结构为 -(13)-链接为主链,伴有 -(16) 支链的D-葡聚糖结构报道相一致 13. (10 -6

20、)(10 -6)图 4 灵芝多糖 1H NMR 谱图(a)和 13C 谱图(b)Fig.4 1H NMR spectrum (a)and 13C spectrum(b) of GLP 3.5 三螺旋体结构分析据文献14报道葡聚糖的抗氧化性和免疫性与三螺旋体结构的存在具有重要的相关性。三螺旋体结构分析主要采用刚果红及刚果红多糖混合液在碱液中,其紫外光谱会发生位移变化进行分析。图 5中显示, 刚果红溶液、刚果红-多糖混合液在 0.2 M NaOH浓度的碱液中,其紫外波长发生了 18 nm的位移,刚果红溶液波长在max=500 nm处,刚果红-多糖混合液波长在max=518 nm处,随着碱液浓度增加

21、至 0.6M,多糖的三螺旋体结构被破坏,红移消失,说明了多糖结构由于碱浓度的增加将从有序结构破坏至无序结构,这也是一个典型的(13)-D- Glcp的三螺旋体结构性质。 因为卷链能影响线性分子间氢键的稳定性 15。 ba图 6 不同碱浓度下刚果红与多糖混合液的波长变化 Fig.5 Absorption wavelength change of the Congo red- polysaccharideComplex at different NaOH solutions1- 0.2N NaOH 刚果红与多糖混合液( Congo red- polysaccharide complex at 0.

22、2N NaOH)2- 0.2N NaOH 多糖溶液(Polysaccharide at 0.2N NaOH)3- 0.6N NaOH 刚果红与多糖混合液 (Congo red- polysaccharide complex at 0.6N NaOH)4-0.2N NaOH 刚果红溶液 (Congo red at 0.2N NaOH)References 1 Jiang Yan(江艳),Wang Hao(王浩),Lv Long(吕龙) ,Tian Genyuan (田庚元).Acta Pharmaceutica Sinica(药学学报),2005,40(4):347-350 2 Russell

23、R, Paterson M. Phytochemistry,2006, 69, 14691495 3 Gao Xiaorong(高小荣), Liu Pei(刘培勋).Chinese Tradit ional and Herbal Drugs( 中草药),2004,35(2):229-231 4 JIANG Zhi-Guo(将志国) ,DU Qi-Zhen(杜琪珍),SHENG Li-Yi(盛利燚). Chinese J.Aanl.Chem.(分析化学),2009,37(3):4124165 SUN Yuan-Lin(孙元琳),SHEN Rui-Ling(申瑞玲),TANG Jing(汤坚),G

24、U Xiao-Hong(顾晓红),LIYuan-De(李远德). Chinese J.Aanl.Chem.(分析化学),2008,36(3):3483526 Zhang Weijie(张惟杰). Techniques of Sugar Complex Biochemistry(糖复合物生化研究技术).Hangzhou(杭州):Zhejiang University Press(浙江大学出版社),1994:140,142,204,244 7 Kang Xuejun(康学军),Qu Jiansong(曲见松),Gu Zhongze(顾忠泽).Chinese J.Anal.Chem.(分析化学),

25、2006, 34(4):533-535 8 Virkki L, Johansson L, Ylinen M, Maunu S, Ekholm P. Carbohydrate Polymers, 2005, 59(3):357-366 9 Wu Y L, Pan Y J,Sun C R. International Journal of Biological Macromolecules, 2005, 36 (4):241-245 10 Liu Yuhong(刘玉红), Wang Feng-shan(王凤山).Food and Drug( 食品与药品),2007,9(8):39-43 11 Sh

26、i Le(石磊), Chen Kaosan(陈靠山), Dong Qun(董群),Fang Jinian(方积年), Ding Kan(丁侃).Chem J.Chinese universities( 高等学校化学学报), 2007, 28(6):1088 -1091 12 Cai Mengshen(蔡孟深), Li Zhongjun(李中军).Carbohydrate Chemistry Fundamentals, Reactions, Synthesis,Isolation and Structures(糖化学 基础、反应、合成、分离及结构) , Absorbency吸收强度波长Wavel

27、ength ( nm)4321Beijing(北京): Chemical industry press (化学工业出版社),2007:37413 Frank S, Bruce A S, Robert T C B, Barbara M M, Robert J S. Carbohydrate Research, 2006,341:365373 14 Mao C F, Hsu M C, Hwang W H. Carbohydrate Polymers, 2007, 68:502-510 15 Dilip R, Soumitra M, Indranil C, Syed S I. Carbohydrat

28、e Research, 2008, 343:982987 灵芝多糖的结构特性分析何晋浙,邵平,孟祥河,孙培龙 本文系浙江省科技厅和国家高技术研究发展计划 863 计划(No.2008C32030,No.2007AA10Z337)资助项目(浙江工业大学生物与环境工程学院食品系,杭州 310032 )摘要 采用沸水回流法从灵芝子实体中提取多糖,经 Sevage法除蛋白,乙醇沉淀,离心、透析、膜分离,浓缩、冻干后得灵芝多糖。经高碘酸氧化、Smith 降解及甲基化反应,并利用多糖及刚果红混合液在碱性溶液中的波长的红移变化,通过 UV-VIS、IR、GC、GC-MS、NMR 对灵芝水提多糖的结构特征及三

29、螺旋体结构进行分析研究。 结果表明:灵芝多糖含有三螺旋体构型,GC-MS 分析灵芝多糖的主要单糖组分为葡萄糖,和少量的半乳糖、甘露糖、木糖、艾杜糖,IR 及1HNMR分析多糖为 -构型, 高碘酸氧化、Smith 降解和甲基化分析说明:多糖主要为(13)糖苷键连接构型, 并伴有少量的 16 位支链键连接的结构, 灵芝多糖是由 D-葡萄糖单元通过 -(13)糖苷键连接葡聚多糖,其主要构型特征为 (13)- D-线性连接的骨架结构,其主要结构为下列构型:3)-D-Glcp-(13)-D-Glcp-(13)- n-D-Glcp-(1.61 -D-Glcp关键词 灵芝多糖,结构特性,-葡聚糖,三螺旋体A

30、nalysis of the Structural Characteristics of Polysaccharide from Ganoderma Lucidum He Jin-Zhe, Shao Ping, Men Xianghe,Sun Pei-Long *Food Dep., College of Biology and Environmental Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310032 AbstractThe polysaccharide was extracted by boiling wate

31、r reflux method from the fruiting body of Ganoderma lucidum. Additionally, the purified polysaccharide was obtained by removing protein with Sevage way, ethanol precipitation, centrifugation, run water dialysis, membrane separation, concentration and frozen-drying. The structural characteristics, ch

32、ain conformation and triple-helix conformation of GLP were distinguished by Smith degradation, methylation analysis, and the wavelength change of the red shift of the mixture of polysaccharide and Congo red in alkaline solution,as well as IR, GC-MS, NMR, and Vis spectra, The results indicated that G

33、anoderma lucidum polysaccharide was a linear (13) -D-Glcp main chain linkage. Its monosaccharide component was predominantly composed of D- Glc, and small amount of galactose, mannose, xylose and idose, residues of branches terminated with substituted at 16 by a small number of single-unit -D-Glcp side-chains, its also been observed that the (13)-linked -D- glucan

展开阅读全文
相关资源
相关搜索

当前位置:首页 > 教育教学资料库 > 课件讲义

Copyright © 2018-2021 Wenke99.com All rights reserved

工信部备案号浙ICP备20026746号-2  

公安局备案号:浙公网安备33038302330469号

本站为C2C交文档易平台,即用户上传的文档直接卖给下载用户,本站只是网络服务中间平台,所有原创文档下载所得归上传人所有,若您发现上传作品侵犯了您的权利,请立刻联系网站客服并提供证据,平台将在3个工作日内予以改正。