1、分解纤维素的微生物的分离栾旭东，张兴敏，周雪霞， 闫 超，何溢涛（山东大学生命科学学院 2005 级生科基地班，济南 250100）摘要：纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，它能被土壤中某些微生物分解利用，是因为它们能够产生纤维素酶。本实验通过从土壤中分离分解纤维素的微生物，初步鉴定了其形态特征和生理生化特性，为日后更进一步的研究打下基础。关键词：纤维素 土壤微生物 纯培养 刚果红染色法Abstract: cellulose is the most abundant polysaccharide on the earth, which can be digested by some micr
2、oorganisms in the earth because they produce cellulase. In our experiment, we isolated these microorganisms from the earth and checked up the cells and colonies morphology and the bioreactions they can act.Key words: cellulose, microorganisms in the earth, pure culture, Congo red staining 资源和环境问题是人类
3、在 21 世纪面临最主要的挑战。生物质资源是可再生资源，地球上每年光合作用的产物高达 1.510112.01011，是人类社会赖以生存的基本物质资源，其中 90%以上为木质纤维素类物质 1。目前这部分资源尚未得到充分的开发利用。随着世界人口迅速增长，矿产资源日渐枯竭，开发高效转化木质纤维素类可再生资源的微生物技术，利用工农业废弃物等发酵生产人类急需的燃料、饲料及化工产品，即化工原料的“绿色化” ，具有极其重要的意义和光明的发展前景。地球上的植物每年产生的纤维素超过 70 亿吨，其中 40%60%能被土壤中的某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。而要研究这些微生物，首先要将它们从土壤
4、中种类乏多的微生物中分离出来。1.土壤中纤维素分解菌的分离 2土壤有“微生物的天然培养基”之称，同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。在富含有机质的土壤表层，有更多的微生物生长。实验的具体操作步骤如下。1.1 土样的采集土壤中的微生物，大约 70%90%是细菌。细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在距地表约 38cm 的土壤层。因此，土壤取样时，一般要铲去表层土。另外，土样的采集要选择富含纤维素的环境，这是因为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。综合各种因素，本小组从图书馆后院的落叶堆积丛取土样。1.2.选择培养1.2.1 富集培养在将
5、样品稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基之前，先通过选择培养增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。富集培养所需要的仪器有：250ml 锥形瓶、天平、药匙、玻璃棒、电炉、摇床、玻璃珠、称量纸等。选择培养基的制备比例见下：纤维素分解菌的选择培养基纤维素粉 5gNaNO3 1gNa2HPO47H2O 0.5gKH2PO4 0.9gMgSO47H2O 0.5gKCl 0.5g酵母膏 0.5g水解酪素 0.5g将上述物质溶解后,用蒸馏水定容到 1000ml按上表比例配制 50ml 选择培养基。在 250ml 锥形瓶中装入 50ml 培养基，放 56 颗玻璃珠，用 8 层纱布做成瓶
6、塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层牛皮纸，用线绳扎紧，在121下高压蒸汽灭菌 20min。称取土样 20g，在无菌条件下加入装有 50ml 培养基的锥形瓶中。将瓶置于摇床上，在30下振荡培养 34d，至培养基变浑浊。1.2.2 梯度稀释所需仪器：试管（7 支） 、移液器、枪头。需要先经高压蒸气灭菌的仪器：试管（每只内装 9ml 蒸馏水） 、枪头（黄色、蓝色） 。用量程为 1000L 的移液管从富集培养土壤液中吸取 1ml 土壤悬液加入盛有 9ml 无菌水的试管中充分混匀。然后换枪头从此试管中吸取 1ml 加入另一盛有 9ml 无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成 10-1,10-2,10-3
7、,10-4,10-5,10-6不同稀释度的土壤溶液。1.2.3 刚果红染色法分离（涂布平板）所需仪器：无菌培养皿（12 个） 、涂布器（3 个） 、移液器、枪头、温箱等。需要灭菌的仪器：无菌培养皿（12 个） 、涂布器（3 个） 、移液器、枪头。(1)鉴别培养基的制备培养基的制备比例如下：鉴别纤维素分解菌的培养基CMC-Na 5-10g酵母膏 1gKH2PO4 0.25g琼脂 15g土豆汁 100ml将上述物质溶解后,用蒸馏水定容到 1000ml按以上比例配制 200ml 鉴别培养基和 10mg/ml 的刚果红（CR）溶液，灭菌后，按照每200ml 培养基加入 1ml 的比例往培养基中加入 C
8、R 溶液，混匀后倒平板，凝固后待用。(2)涂布平板将上述已倒培养基的十个平板底面分别用记号笔写上 10-4,10-5,10-6三种稀释度（每个稀释度写 3 个）和一个空白平板（留作对照用） 。然后用移液器分别由 10-4,10-5,10-6三管土壤稀释液中各吸取 0.1ml 对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌涂布器在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置 510min，使菌液吸附进培养基。30倒置培养，至菌落长出，产生纤维素酶的菌落周围将会出现明显的透明圈。(3)菌落形态观察12d 后，平板上长出菌落，并在个别菌落周围出现明显的透明圈。图表 1 空白图表 2 10 -4图表 3 10 -5图表
9、 4 10 -6挑菌 2 种，根据菌落大小、形状、高度、干湿等特征记录不同的菌落形态特征。菌落 大小 形态 干湿 高度 透明度 颜色 边缘1 中 不规则 湿 隆起 不透明 粉红 波状2 小 圆形 湿 隆起 不透明 浅黄 整齐(4)划线分离将步骤(1)中的鉴别培养基加热熔化后倒入 2 个无菌平皿中，凝固后，用接种环挑取(3)中2 种菌落在平板培养基上作连续划线。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于温室培养，至长出单菌落。由此，即从土壤中分离纯化出纤维素分解菌。2.纤维素分解菌的染色与形态结构观察及菌种保存2.1 染色镜检（革兰氏染色）基本原理：革兰氏染色法是 1884 年由丹麦病理学家 Christai
10、n Gram 氏创立的，而后一些学者在此础上作了某些改进。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红)复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌。革兰氏染色的主要原理是由于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染色反应不一样。现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合程度底，吸附
11、染料差，易脱色，这是染色反应的主要依据。另外，阳性菌菌体等电点较阴性菌为低，在相同 PH 条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料很多，因此不易脱去，阴性菌则相反。所以染色时的条件要严格控制。例如，在强碱的条件下进行染色，两类菌吸附碱性染料都多，都可呈正反应；PH 很低时，则可都呈负反应。此外，两类菌的细胞壁等对结晶紫碘复合物的通透性也不一致，阳性菌透性小，故不易被脱色，阴性菌透性大，易脱色。所以脱色时间，脱色方法也应严格控制。所需仪器或试剂：菌种 1，2 的平板培养物、革兰氏染色液（结晶紫碘液，番红染液） 、显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶（内装香柏油和二甲苯） 、擦镜纸、蒸馏水等。操作步骤
12、：制片（涂布、干燥、固定）结晶紫初染 12min，水洗碘液媒染 1min，水洗乙醇脱色30s，水洗番红复染 1min，水洗干燥镜检，油镜观察镜检结果：菌 1、2 均为革兰氏阴性菌，100x 油镜下个体都很小，形似杆状。图表 5 菌一（10x100 油镜）图表 6 菌二（10x100 油镜）2.2 菌种保存重新配制鉴别培养基 100ml（配制比例参前） ，装入 4 支试管后用牛皮纸包扎好 12120min 灭菌，摆斜面。将平板中的菌 1、菌 2 移接入斜面培养基保存。3.生理生化鉴别反应3.1 糖类发酵与氧化实验绝大多数细菌都能利用糖类作为能源和碳源，但由于不同的菌存在酶系的差异，因而对糖类的发
13、酵与氧化的能力就有所不同。有的能利用这种而不能利用那种，有的正相反；有的在糖类发酵与氧化代谢中能分解糖类，产酸产气，有的则只能产酸而不产气。酸产生与否，以及是发酵型产酸还是氧化型产酸，可由预先加在培养基中的指示剂（溴百里酚蓝水溶液）呈现出来。这样把接好菌种的培养基放在厌氧或好氧的条件下培养，培养基由绿色变黄色为产酸，是否产气是通过观察培养基中是否产生气泡或培养基断裂来测定，如产生气泡或断裂则证明有气体存在。所需仪器：试管、接种针、恒温箱等。操作步骤：1. 糖类发酵及氧化实验培养基的制备培养基配方蛋白胨 0.2% KH 2PO4 0.03%NaCl 0.5% 糖 1%溴百里酚 0.003% 琼脂
14、 0.50.7%PH 7.07.4按以上配方配制含不同种类的糖（葡萄糖，蔗糖，淀粉）的培养基各 200ml，调 PH 后110灭菌 20min。2. 待灭好菌的培养基稍冷却，分装到小试管， 。每种培养基倒 10 支小试管，冷却至其凝为半固体。3. 接种：用培养了 1824 小时的菌穿刺接种，每种菌每个培养基接 4 支，其中 2 支用灭菌的甘油封盖（以隔绝空气，称为闭管） ，另 2 支不封为开管。同时要有不接种的闭管作对照。4. 培养：置 37下培养 816h，1d，3d，7d。5. 观察：在上述培养时间内观察试管中指示剂的变化情况。结果：培养约 3 天时观察到下面的现象号菌 号菌颜色变化 下部
15、变黄 上部变黄产酸类型结论 发酵型 氧化型现象 甘油封盖的不变色未封盖的变色甘油封盖的不变色未封盖的变色淀 粉 培 养 基是否需O2结论 好氧 好氧颜色变化 下部变黄 上部变黄产酸类型结论 发酵型 氧化型现象 甘油封盖的不变色未封盖的变色甘油封盖的不变色未封盖的变色蔗 糖 培 养 基是否需O2 结论 好氧 好氧颜色变化 上部变黄 上部变黄产酸类型结论 氧化型 氧化型现象 甘油封盖的不变色未封盖的变色甘油封盖的不变色未封盖的变色葡萄糖 培 养 基是否需O2结论 好氧 好氧用淀粉和蔗糖做出的结果一致，而与用葡萄糖做出的结果稍有不同，初步判断号菌为好氧菌，发酵型产酸，号菌为好氧菌，氧化型产酸，但 1
16、 号菌的产酸类型有待于进一步实验验证。3.2 过氧化氢酶测定H2O2酶又称接触酶，能把 H2O2分解为 H2O 和 O2，O 2变成气泡跑出来。有气泡产生则为过氧化氢酶阳性实验，否则为阴性。许多厌氧菌是阴性的。实验材料：菌种、移液枪、接种环、载玻片、3% H 2O2溶液。操作步骤：取一环培养 1824h 的菌苔涂在干净的载玻片上，然后滴一滴 3%的 H2O2。结果：将 H2O2滴在两种菌上之后，都会产生气泡（号菌上气泡产生剧烈，2 号菌上气泡产生的缓慢） 。证明二者均为 H2O2酶阳性。3.3 细胞色素氧化酶测定细胞色素氧化酶是氧化酶的一种，人们习惯将其称为氧化酶。所以在细菌分类鉴定中所说的氧
17、化酶就是指细胞色素氧化酶。氧化酶在有 O2和细胞色素 C 存在时，可氧化对氨基二甲基苯胺，使其呈玫瑰色至暗紫色，在此基础上还能与 -苯酚结合而出现蓝色。 （苯 or萘）实验材料：菌种、滤纸、火柴棒、牛肉膏蛋白胨培养基、1%盐酸对氨基二甲基苯胺溶液、1%-萘酚。操作步骤： 将菌种接到灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基上 37培养 1824h。 在干净的培养皿里放一张滤纸。以下有两种方法：方法一：用火柴棒（切勿用含 Fe 物质，否则呈假阳性）取菌苔，粘在滤纸上。在滤纸的菌苔上滴一滴 1%盐酸对氨基二甲基苯胺溶液。方法二：用 1%盐酸对氨基二甲基苯胺溶液湿润滤纸。滴加等量 1%-萘酚乙醇溶液。用火柴棒取菌苔于
18、上述滤纸。判断标准：方法一：在 10 秒钟内涂抹的菌苔呈现红色者为阳性；1060 秒钟呈现红色者延迟反应，也为阳性；60 秒以上呈现红色者都不计，按阴性处理。方法二：出现蓝色者为阳性，出现变色的时间要求同上。结果：二者均未出现红色或蓝色，可判断为阴性。4 实验总结通过本实验我们分离到了能分解纤维素的细菌，得到了他们的纯培养。从我们分离到的这两种菌来看，能分解纤维素的细菌时革兰氏阴性菌，菌落特征粉红色或浅黄色，好氧型，过氧化氢酶阳性，细胞色素氧化酶阴性，这些特征与伯杰氏手册中关于噬纤维菌属的描述类似，我们的初步判断分离出的两种菌是这一属的，但是要最终确定属及种仅仅靠这些表型特征是不够的，还需要更
19、多的实验验证。我们下一步想做的是提取 16sRNA，根据16sRNA 的序列特征确定两种菌的归属直至确定种; 另外，我们分离到的两种菌都是细菌，而已有不少的研究发现分解纤维素的还有真菌如白腐菌 3（white-rot） 、褐腐菌（brown-rot）等，而且他们在树林生态系统中对木质纤维素的分解起重要的作用，因此有必要对分解纤维素的真菌展开研究。参考材料：1. 高培基. 纤维素酶降解机制及纤维素酶分子结构与功能研究进展. 自然科学进展，2003，13(1):212. 孙冬梅. 纤维素分解菌的分离与特性初探. 黑龙江八一农垦大学学报, 2004,01:0193. 杜甫佑. 白腐菌木质纤维素降解次序研究. 中国知网, 2005-03-30感谢：山东大学生物质资源实验室在实验药品方面给与我们的支持；山东大学微生物基础实验室在实验场所、实验器材上给与我们的支持；山东大学庞昕导师在实验操作上给我们的指导。
