1、第七章 维生素(Vitamins)的测定,维生素：是活细胞为维持正常生理功能所必需而需要极微量的天然有机物质。维生素是从营养观点归纳而成的一类有机化合物，它们的化学结构各不相同，生理功能各有所异。有的维生素参与所有细胞中的物质与能量的转移过程，它们作为生物催化剂酶的辅助因子而起着各种生理作用，例如B族维生素；有的维生素则专一性地作用于高等有机体的某些组织，例如维生素A对视觉起作用，维生素D对骨骼构成起作用，维生素E具有抗不育症作用，维生素K对于血液凝结起作用等等。 维生素按其溶解性分类；可分为脂溶性维生素，包括VA、VD、VE、VK；水溶性维生素，包括B族类和VC。,维生素是人体生命活动不可缺
2、少的营养物质，它们一般在动物和人体内不能合成或合成数量少，满足不了动物和人体的需要，必须依靠从食物中摄取。在食物中缺乏了任何一种维生素，人和动物都会发生特有的缺乏症状，如缺乏维生素A、B和C时，可分别引起夜盲症、脚气病和坏血病等，严重时足以致命。某些维生素含量的高低，是评价农产品品质的重要指标之一。,维生素是维持人体正常生理功能所必需的一类有机化合物。 维生素按其溶解性可分为： 水溶性维生素 抗坏血酸（Vc） 具有酸性和强还原性，水果中柑橘、柠檬含量较高，为40-50mg/100g，红果和枣的含量更高，枣中540mg/100g。,硫胺素（B1） 缺少，则神经组织功能不足，可出现相应的神经肌肉症
3、状如多发性神经炎、肌肉萎缩及水肿。谷类、豆类及肉类含量较多，动物性食品中以肝、肾、脑含量较多。 核黄素（B2） 需要量与能量代谢有关。动物性食品比植物性食品含量高，肝脏达2mg% 烟酸（Vpp） 可预防癞皮病发生。含量最多的是蘑菇、酵母等，肝脏为10mg%。,维生素B6 可帮助糖类、脂肪和蛋白质分解、利用，也帮助糖元由肝脏或肌肉中释放热能。蛋黄、肉、鱼、乳，以及谷类、种子外皮、蔬菜含量丰富。 叶酸 叶酸为各种细胞生长所必需。动物肝脏、豆类、各种绿叶蔬菜和水果含量较多。 生物素 参与体内的固定CO2（羧化）和转羧基作用。分布广泛，肠道细菌亦能合成,维生素B12 唯一含金属（钴）的维生素，机体中含
4、量降至0.5mg%左右便会出现贫血，即恶性贫血。主要来源为肉类，以内脏、鱼类、蠔类及蛋类为多。 泛酸（VB3） 与糖类、脂肪和蛋白质代谢有密切关系。广泛存在于动、植物食品中。,脂溶性维生素 VA 具有促进正常生长与繁殖、维持上皮组织与视力正常的生理功能。只存在于动物性食品中，肝、肾、鸡蛋、鱼卵和全奶等。植物则可提供作为维生素A元的类胡萝素或胡萝卜素，如菠菜、胡萝卜、红心甘薯辣椒，以及水果如杏、柿子等。,VD 人体VD的主要来源并非食物，而是皮下7-脱氢胆固醇经紫外线照射转变而来。海水鱼的肝脏含量最为丰富。 VE 具有抗氧化的功能，与机体的抗衰老有关。人体所需大多来自谷类植物油。 VK 作用主要
5、是促进肝脏生产凝血酶原，从而具有促进凝血作用。绿叶蔬菜含量最为丰富，蛋黄、大豆油和猪肝也是良好来源。,一.脂溶性维生素,1.维生素A（VA） 维生素A又称视黄醇(retinol) ，与视觉有关，在视觉杆状细胞中构成视紫红质（视Pr+VA）。 结构与性能,C,H,2,O,R,C,H,3,C,H,3,C,H,3,C,H,3,C,H,2,O,R,C,H,3,C,H,3,C,H,3,C,H,3,(a)维生素A1,（,b,）,维,生,素,A,2,R,=,C,O,C,H,3,乙,酸,酯,或,C,O,（,C,H,2,）,1,4,C,H,3,棕,榈,酸,酯,C,H,3,它是由20个碳构成的不饱和碳氢化合物其羟
6、基可被脂肪酸酯化或生成醛或酸，也可以以游离醇的形式存在。 通常所说的维生素A1就是视黄醇。由于视黄醇结构中有共轭双键，属于异戊二烯类所以它可有多种顺、反立体异构体。食品中的视黄醇主要是全反式结构生物效价最高，脱氢视黄醇即维生素A2，存在于淡水鱼中其生物效价为维生素A1的40，而1、3顺异构式即所谓的新维生素A它的生物效价为全反式的75。,维生素A的含量常常用国际单位(International Unit,IU)来表示，一个国际单位相当于0.344g结晶维生素A醋酸盐或0.600g胡萝卜素(或1.2g其它的类胡萝卜素)，根据RDA(每日推荐量)，成人每天所需的维生素A为5000IU或1mg。青少
7、年、孕妇或哺乳期妇女需要增加供应量。,维生素A主要存在于动物中，而不存在于植物中。如维生素A、在动物和海鱼中存在，维生素A2在淡水鱼中存在而不存在于陆地动物中。蔬菜中所含的胡萝卜素可经动物肠道吸收后而转化成维生素A1，故又称维生素A原。其中转化最有效的为胡萝卜素,它能生成两个等量的维生素A。除鱼的鱼肝油中维生素A的含量比较丰富外，在鱼肉、牛肉、蛋黄、牛乳及乳制品中含量也较丰富，胡萝卜素则在蔬菜中含量较高。如胡萝卜、甘薯、番茄和花椰菜等。,2.维生素D 维生素D是一些具有胆钙化醇生物活性的类固醇的统称。 结构与功能,2,维生素D主要包括维生素D2和D3，二者结构十分相似，D2只比D3多一个甲基和
8、一个双键。植物性食品、酵母等含有麦角固醇，经紫外线照射后转变成维生素D2，即麦角钙化醇(ergocalciferol)。人和动物皮肤中含有的7一脱氢胆固醇，经紫外线照射后可得维生素D3，即胆钙化醇 (cholecalciferol)。维生素D3广泛存在于动物性食品中，并在鱼肝油中含量较丰富，在鸡蛋、牛乳、黄油和干酪中含有少量的维生素D3。,维生素D的活性单位也用国际单位(IU)表示，一个国际单位的维生素D相当于0.25g结晶的维生素D2或D3。也即1g的维生素D相当于40个国际单位。维生素D的强化，一般常用于黄油和牛乳等食品中。, VD的稳定性 维生素D非常稳定，在加工和储藏时很少损失。消毒、
9、煮沸和高压灭菌都不影响维生素D的活性。冷冻储存对牛乳和黄油中维生素D的影响不大。但维生素D2和D3遇光、氧和酸迅速破坏，故需保存于不透光的密封容器中。结晶的维生素D对热稳定，但在油脂中容易形成异构体。油脂氧化酸败时也会使其中的维生素D破坏。 缺乏维生素D时，儿童会引起佝偻病，成年人可引起骨质软化病。,3.维生素E 维生素E又称生育酚。 结构与功能 已知有8种，其中四种、 、 较为重 要， 生育酚在食品中可用作抗氧化剂，尤其用于动 植物油中，其抗氧化能力依次；而在机体内的抗氧化能力恰恰相反。,它在谷物胚油含量最高，为150500mg100g，但植物油在精炼时生育酚会受到破坏。,VE在加工、贮藏中
10、的变化 食品在加工和贮藏过程中会引起维生素E大量损 失，这种损失或是由于机械作用损失或是由于氧化作用。因氧化而引起的损失通常伴有脂类的氧化，金属离子如Fe2+能促进维生素E的氧化，氧化分解产物包括二聚物、三聚物、二羟基化合物以及醌类。 维生素E对氧、氧化剂不稳定，对强碱不稳定。,4. 维生素K,维生素K(Phylloquinone)是醌的衍生物。其中较常见 的有四种,天然的维生素K1和K2，还有人工合成的维生素K3和K4。,维生素K在绿色蔬菜中含量丰富，如菠菜、洋白菜等.鱼肉中维生素K含量较多，但麦胚油、鱼肝油中含量很少。 维生素K是黄色粘稠油状物，可被空气中氧缓慢地氧化而分解，遇光则很快破坏
11、，对热酸较稳定，但对碱不稳定。 维生素K缺乏导致血中凝血酶原含量下降，从而导致皮下组织和其它器官出血，而且会延长凝血时间。 对于脂溶性维生素来说，人体易缺乏的顺序一般为VDVAVEVK。,二.水溶性维生素,1. 维生素CVC的生理功能a.促进细胞间质的合成，防止出血b.参与体内的氧化还原反应（保护-SH等）c.参与体内一些代谢反应（叶酸 FH4 ）d.解毒作用（Pb2+、As3+ 、苯及细菌毒素等）.结构与性质 VC为酸性己糖衍生物，是烯醇式己糖酸内酯。维生素C成为一种强还原性的化合物。它具有四种异构体，D抗坏血酸、D异抗坏血酸、,L抗坏血酸、L异抗坏血酸。L抗坏血酸的生物活性最高。 VC的C
12、2、C3位上的羟基的H能以原子形式释放，成为脱氢抗坏血酸，还原型和氧化型都具有生物活性，其结构如下：, VC的变化 在所有维生素中VC是最不稳定的，在加工储藏过程中很容易被破坏。如放置在有氧气的地方或在有氧时持续加热或暴露在光下、或在碱性条件下均会有Vc损失。其破坏率随金属作用而增加，尤其是铜和铁的作用最大,金属化合物对Vc有稳定作用,其中有花青素、黄烷醇及多碱基或多羟基的酸,如苹果酸、柠檬酸和聚磷酸等.对酸稳定,对加热氧气、氧化剂、碱、光、酶、金属的稳定性差.VC易被水降解成无活性的二酮古乐糖酸，后者前一步氧化分解成草酸和L-苏阿糖酸。,在食品加工中很多方面都要利用VC。（1）它可防止水果蔬
13、菜产生褐变和褪色（2）作抗氧化剂（脂肪、鱼、乳制品中） （3）稳定剂( 肉中色泽的稳定剂 )（4）改良（面粉）（5）啤酒中可作氧气载体, 富含VC的食品 维生素C广泛存在于自然界中，主要是植物，如水果蔬菜中存在，柑桔类、绿色蔬菜、番茄，辣椒、马铃薯及桨果中含量较为丰富，而在刺梨、猕猴桃，蔷薇果和番石榴中含量最高。在水果的不同部位中其浓度差别也很大，例如：苹果皮中的浓度要比果肉中高2-3倍。 唯一的动物来源为牛乳和肝。,2.VB1（硫胺素） VB1的生理功能 a.维持代谢的正常进行（ VB1 TPP参与丙酮酸氧化脱羧） b.抑制胆碱酯酶的活性、减少胆碱水解、增加胃肠蠕动。治疗神经炎、心肌炎、食欲
14、不振、消化不良、脚气病等。, 结构 VBl分子中含有硫和NH2故称硫胺素，分子结构中包括嘧啶和噻唑两部分，其结构如下：,VBl盐酸盐, 稳定性 VBl是B族维生素中最不稳定的，它在酸性、中性溶液中稳定，但在碱性溶液、加热、一些盐溶液（亚硫酸盐）中不稳定。,如VBl在亚硫酸盐破坏和在碱性条件下所发生 的降解反应是相似的，两种反应均产生5-羟乙基-4-甲基噻唑和一个相应的取代嘧啶。和亚硫酸盐作用时，后一个化合物为-甲基-5-磺甲基嘧啶，而与碱作用时则为羟甲基嘧啶。噻唑环可进一步开环生成硫、硫化氢、呋喃、噻吩和二氢噻吩，这便是烹调食品中的“肉“香味。 所以在含硫胺素多的食品中最好不用二氧化硫添加剂。
15、但当酪蛋白和可溶性淀粉存在时，二氧化硫对硫胺素的破坏作用要减低些，这可能是这些保护剂生成的不相关的连接反应产生了保护效果，如使SH氧化，或由于蛋白质对亚硫酸盐的竞争性氧化等。,3.维生素B2(核黄素) VB2 的生理功能 核黄素(Riboflavin)为一含核糖醇侧链的异咯嗪衍生物，在自然状态下它常常是磷酸化的，而且起着辅酶的作用。它的一种形式为黄素单核苷酸(FMN)，另一种形式为黄素腺苷酰二核苷酸(FAD)，它们是某些酶如细胞色素C还原酶、黄素蛋白等的组成部分，后者起着电子载体的作用，在葡萄糖、脂肪酸、氨基酸和嘌呤的氧化中起作用。,O, 稳定性a.核黄素属热稳定，不受空气中氧的影响，在酸性中
16、稳定。b.但在碱性介质中不稳定，对光则非常敏感，若将其曝光很容易破坏，在光下的破坏率随PH和温度的增加而增加在碱性溶液中辐射会引起核黄素裂解而产生光黄素 。光黄素是一种很强的氧化剂，它可以催化破坏许多其它的维生素，尤其是抗坏血酸，若将牛乳在日光下曝晒2h后可损失50以上。,富含VB2的食品 在食品中核黄素与磷酸和蛋白质结合而形成复合物，动物性食品一般含核黄素较高，尤其以肝、肾和心的含量最为丰富，奶类和蛋类中核黄素含量也较多，绿色蔬菜和豆类也含一定量的核黄素。,4. VB5（尼克酸和尼克酰胺） 维生素PP（Niacin）亦称烟酸，维生素PP为尼克酸和尼克酰胺的总称 。（1）生理功能 尼克酰胺为两
17、种重要的NAD（辅酶）和NADP（辅酶）的组成，它们在糖酵解、脂肪合成和呼吸作用中起着重要的作用。,（2）稳定性 VB5是维生素B族中最稳定的。对热、光、空气、酸和碱都不敏感。但蔬菜经非化学处理如淋洗和休整，会使VB5损失；猪肉和牛肉在贮藏过程中产生的损失是由生化反映引起的；而烤肉不会带来损失，不过烤下的肉滴中含有肉中VB5的26%；乳类加工中似乎没有损失。,（3）富含VB5的食品 食品中除玉米较缺外，其它食品都含有。玉米中缺乏会造成癞皮病，因为玉米蛋白中色氨酸含量较低，而色氨酸在体内可以转化成尼克酸。在动物组织中的VB5的主要形式为尼克酰胺。,5. VB6 （吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺 ） 结构
18、, 功能,H,O,C,H,2,O,H,N,H,3,C,H,O,C,H,2,O,H,N,H,3,C,H,O,C,H,2,O,H,N,H,3,C,C,H,2,O,H,C,H,O,C,H,2,N,H,2,吡,哆,醛,吡,哆,醇,吡,哆,胺,还,原,氧,化,V,B,6,H,3,P,O,4,H,2,O,磷,酸,吡,哆,醛,（,胺,）,P,r,脱,酸,酶,转,氨,酶,参,与,体,内,代,谢, 富含VB6的食品 VB6广泛分布在许多食品中，例如牛乳中的含量为54g100ml。此外它还存在于肉、肝、蔬菜、全谷粒和鸡蛋黄中，所以不太会发生缺乏症，对它的需要还随蛋白质的高消耗而增加。动物体内的VB6以吡哆醛和吡哆
19、胺的形式存在，谷物主要为吡哆醇。, 稳定性 吡哆醇对热、强酸和强碱都很稳定，但在碱性溶液中对光敏感，尤其对紫外线更敏感。吡哆醛和吡哆胺当暴露在空气中，加热和遇光都会很快破坏，形成无活性的化合物如4吡哆酸。在三种化合物中以吡哆醛最为稳定，可用来强化食品。 加工过程对牛乳及牛乳制品中的吡哆醇的影响,如：奶粉在巴氏消毒、均质及生产过程中损失不多，但高温消毒可损失36-49。不仅加热可引起损失，而且持续保存也会引起损失，这种损失可能是吡哆醛和活化的巯基基团相互作用而引起的，巯基是牛乳蛋白在加热过程中形成的。将牛乳置透明玻璃中在日光下照射8h可使VB6损失20-30，小麦粉碎过程中可损失80-90，烘烤
20、面包时损失17以上。,6.维生素VB7（生物素） 结构,是由噻吩和尿素缩合的骈环，并带有戊酸侧链。, 生理功能 VB7构成羧化酶（固定CO2 ）的辅酶，它与酶蛋白结合是通过它的羧基和Pr-lys-NH2结合形成肽键。,富含VB7的食品 广泛存在于动植物食品中，其中蔬菜、牛奶、水果中以游离态存在，内脏、种子和酵母中与蛋白质结合。生物素在脂肪酸合成中起着重要作用。人体：生物素的供应只是部分依靠膳食，而其中大部分是肠道细菌合成的。生物素可因食用生鸡蛋清而失活，这是由一种抗生物素的糖蛋白所引起的。, 稳定性 VB7相当稳定，加热只引起少量损失，在空气中，中性微酸性溶液中稳定。生鸡蛋因含有抗生物素糖Pr
21、易使生鸡蛋中VB7损失。,7.叶酸 叶酸最初由肝脏分离出来，但后来发现绿色植物叶子中含量十分丰实，故名叶酸。 结构： 由蝶酸和谷氨酸结合而成，蝶酸是由2-NH2-4-CH-6-CH3喋呤+-NH2苯甲酸组成 。,嘌呤、嘧啶合成和某些AA的特殊代谢。 富含VB11的食品 叶酸在许多食物中部存在，绿色蔬菜尤为丰富。, 生理功能,叶酸,四氢叶酸：携带一碳基团参与,叶酸还原酶,VC NAPD+H+, 稳定性 叶酸对热、酸比较稳定，但在中性和碱性条件下能很快地破坏，受光照射更易分解。叶酸能与亚硫酸和亚硝酸盐作用，生成致癌物质，加入Vc会大大增加叶酸的稳定性。,8.泛酸 又称遍多酸，广泛存在与自然界，因而
22、得名。结构由 Ala与、 二羟， 二甲基丁酸以肽键相连的酸性物质，结构如下：,生理功能 是生物体内合成HSCoA 的原料。HSCoA 是酰基转移酶的辅酶，在糖、脂类和Pr的代谢中起着载体作用。,9.胆碱 胆碱在体内有几个重要功能： 防止脂肪肝。 胆碱 磷脂酰胆碱 VLDL（极低密度脂蛋白、肝内脂肪运出物质）。胆碱是一种“亲脂剂”，可促进脂肪以卵磷脂的形式被输送，或者提高脂肪酸本身在肝里的利用，防止脂肪在肝里的反常积累，保证肝的正常功能。,神经传导。 胆碱 已酰胆碱（一种神经逆质），它有助于一个神经元想另一个神经元传导。它可帮助越过神经细胞的间隙，产生传导脉冲。 促进代谢。 胆碱 已酰胆碱（增加
23、胃肠蠕动，有助于消化吸收）,维生素的分析是一项比较复杂的工作。其样品分析的一般程序是：用酸、碱或酶分解样品，使其中的维生素游离出来；用溶剂进行提取；分离干扰物质，对样液进行分离提纯；用适当的方法进行定量等。维生素的分析方法很多，选用方法时应根据样品的品种、类型、待测维生素的性质、含量以及干扰物质多少等因素来决定。,维生素的分析,一、维生素C的测定,维生素C又称抗坏血酸。纯品为白色无臭结晶，熔点为190192。溶于水或乙醇中，不溶于油剂。在水溶液中易被氧化，在碱性条件下易分解，在弱酸条件下较稳定。,总抗坏血酸包括 还原型、氧化型抗坏血酸和2，3-二酮古乐糖酸。 Vc测定主要有： 测定还原型Vc和
24、氧化型Vc的总含量（如荧光法，2,4二硝基苯肼法、高效液相色谱法等) 还原型Vc测定法(2,6二氯靛酚滴定法，电位滴定法，碘滴定法，钼蓝比色法，碘酸钾萃取分光光度法等)两类, 其中,有些方法既可测定Vc全量,也可测定还原型Vc,如酶法。,高效液相色谱法、荧光法要求样品的纯度较高，高效液相色谱法可以同时测得抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的含量，具有干扰少，准确度高，重现性好，灵敏、简便、快速等优点，是上述几种方法中最先进、可靠的方法，但需要有昂贵的仪器，目前尚无法普遍采用。,2.6-二氯靛酚滴定法测定的是还原型抗坏血酸，该法简便，也较灵敏，但特异性差，样品中的其它还原性物质(如Fe2+、Sn2+、Cu2
25、+等)会干扰测定，使测定值偏高。对深色样液滴定终点不易辨别，如山楂，树莓，草莓等 。,2，4-二硝基苯肼比色法和荧光法测得的是抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量，操作麻烦，耗时较长。易受色素影响,当待测液本身有颜色时,消光值会受到影响,从而影响到测定结果的准确性。,钼蓝比色法则不然,该法不易受样品提取液颜色的影响。紫外分光光亮法是操作简便，不受样品提取液颜色的影响，但重复间偏差较大 。碘滴定法不适于花青素含量高的果蔬样品Vc测定。,（一）还原型维生素C的测定,维生素C具有较强的还原性，对光敏感，氧化后的产物称为脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性。进一步水解则生成2,3一二酮古乐糖酸，失去生理作用。在食品
26、中，这三种形式均有存在，但主要是前两者，故许多国家的食品成分表均以抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量表示。,1、方法原理 抗坏血酸(Vc)结构中有烯二醇结构存在，因此具有还原性，能将蓝色染料2，6-二氯靛酚还原为无色的化合物，Vc则被氧化为脱氢Vc，反应式如下：,2，6-二氯靛酚具有酸碱指示及氧化还原指示的两种特性。氧化态时呈深蓝色(碱介质中)或浅红色(酸性介质，变色范围pH45)，还原态时为无色。根据这个特性用碱性蓝色染料的标准溶液滴定植物样品酸性浸出液中Vc到刚变浅红色为终点，由染料的用量即可计算Vc的含量。滴定终点的红色是刚过量的未被还原的(氧化型)染料溶液在酸性介质中的颜色。,注释,（1）偏
27、磷酸是Vc的最佳稳定剂，且具有沉淀蛋白质的作用。但其价格较贵，在室温下放置易转化为正磷酸，降低对Vc的稳定性。草酸廉价易得,有与磷酸相近的稳定性。而醋酸适于浸提含有Fe2+的样品。 根据Vc在酸性溶液中相对较稳定这一特性，历来采用的提取剂都是各种各样的酸性溶液,现在一般采用的主要是2%偏磷酸、2%草酸溶液，其次是8%醋酸、10%三氯乙酸及偏磷酸-醋酸混合液。,(2)所用的提取剂草酸、标定Vc用的碘酸液以及标准Vc液均不稳定，须避光、低温保存。碘酸液以贮备液保存（较高浓度，0.1mol.L-1）。Vc临用临配，不能加热配制。(3) 样品采取后，应浸泡在已知量的2草酸溶液中，以防止抗坏血酸氧化损失
28、。测定时整个操作过程要迅速，防止抗坏血酸被氧化。,(4)KIO3与还原Vc的主要反应如下： 从上述反应式可知1mol(1/6 KIO3)与1mol (1/2C6H8O6)完全反应，故1/2 C6H8O6的摩尔质量为88gmol-1。,(5)2，6-二氯靛酚固体试剂有时含有分解产物，染料溶液长久贮存时也会生成分解主物，从而使滴定终点不敏锐，因此应在使用前检查。检查方法：取15mL染料溶液加入过量的Vc溶液，若还原后的溶液带有颜色，表示此溶液已不能使用。保存在棕色瓶和冰箱中。,(6)样品中可能有其它还原性物质也可使染料还原。但其还原染料的速度较慢，故滴定终点以浅红色在15s不褪色为准。(7)本法适
29、用于测定还原型抗坏血酸，不适于有亚铁、亚锡、亚铜、亚硫酸盐或硫代硫酸盐共存的样品。,(8) 样品切碎、缩分及称量等过程会使样品切口接触空气而促进维生素C氧化，应尽量动作迅速, 维生素C提取液对光敏感，操作室内应设置窗帘，以防加速维生素C氧化。(9) 所有试剂最好用重蒸馏水配制。(10) 标定靛酚滴定液时与滴定样品液时，滴定终点的掌握应严格一致，否则将引起误差。,(11)测定样液时，需做空白对照，样液滴定体积扣除空白体积。(12)维生素C的含量随样品个体或部位的不同差别很大，因此测定维生素C时取样的代表性尤为重要。测定样品平均含量时，一般至少取均匀个体5个以上，纵切分成48等分，再分别取对角的2
30、4片，切碎，充分混合后四分法分取样。,(13)滴定时，可同时吸二个样品。一个滴定，另一个作为观察颜色变化的参考。(14)在处理各种样品时，如遇有泡沫产生，可加入数滴辛醇消除。（15）还原型Vc含量（mg.kg-1）100 允许误差（ mg.kg-1 ）5.0，100 -1000 允许10.0,（二）维生素C总量的测定 (2，4二硝基苯肼比色法),1、方法原理： 维生素C总量包括还原型Vc、脱氢型Vc和二酮古乐糖酸，将样品中的还原型抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸，进一步水解为二酮古乐糖酸。二酮古乐糖酸与2，4-二硝基苯肼耦联生成红色的脎。其呈色的强度与二酮古乐糖酸浓度成正比，可以比色定量。,2、操作
31、步骤,称样加等量2%草酸于高速捣碎机捣碎取匀浆20g用1%草酸定容100ml过滤取滤液10ml加1%草酸10ml加少量活性炭摇1分钟静置过滤各取滤液2ml于样品管和样品空白管各管加入1滴硫脲溶液于样品管中加入2,4-二硝基苯肼0.5ml分别于两个管加盖于37保温箱3小时取出后样品管放入冰水中样品空白管取出后冷至室温在样品空白管加入2,4-二硝基苯肼 0.5ml样品管和空白管都于冰浴中滴加91H2SO4 2ml于各管中边滴边摇防止温度升高炭化后呈黑色 冰浴中取出室温下放置30分钟后，在540nm测消光值，从标准曲线上查出相应的含量。,3、注意事项（1）本法为国家标准方法，适用于蔬菜、水果及其制品
32、中总抗坏血酸的测定。（2）硫脲可防止Vc被氧化，且可帮助脎的形成，最终溶液中硫脲的浓度应一致，否则影响色度。（3）加入H2SO4(91)溶液后试管从冰水中取出，溶液颜色会继续变深，所以必须准确加入H2SO4后30min内比色(糖存在造成显色不稳定, 颜色会逐渐加深)。,(4)活性炭对抗坏血酸的氧化作用，是基于其表面吸附的氧进行界面反应，加入量过低，氧化不充分，测定结果偏低，加入量过高，对抗坏血酸有吸附作用，使结果也偏低。活性炭须充分酸化，才能有较强的氧化能力，且具有除色素的双重作用。1mol/LHCl,100g于750ml，煮沸1-2h，沸水洗涤至无Fe2+，烘干。,(5) 2，4-二硝基苯肼
33、和氧化型Vc藕联形成脎在脱水氧化环境下才稳定。(6)溶液中其他的酮和酮衍生物和2，4-二硝基苯肼也形成脎，故须作空白试验（指没有Vc参与下形成脎的量）。(7)硫脲可防止抗坏血酸继续氧化，同时促进脎的形成。最后溶液中硫脲的浓度要一致，否则影响测定结果。,(8)测定波长一般在495540nm，样品杂质多时在540nm较合适，但灵敏度较最大吸收波长(520nm)下的灵敏度降低30。(9)加9:1硫酸溶液时，为防止溶液中的糖炭化而变黑色，需边滴加边摇试管。,二、维生素B1、 B2 测定,VB1又叫硫胺素，VB1是一种重要的维持人体代谢平衡的物质,缺乏时可能引起脚气病、多发性神经炎等疾病。VB1存在于糙
34、米、酵母、谷类、肝、肉类、豆类及其它动植物组织中，动物组织不如植物含量丰富。测定维生素B1的方法有重量法、滴定法、荧光法、电位法及示波电位滴定法等。世界各国都用荧光法测定。,（一）VB1的性质, VB1在中性、碱性下不稳定，易分解； VB1在酸性条件下稳定，即使加热酸性也稳定； VB1为白色结晶，微溶于C2H5OH，不溶于乙醚或CHCl3，易溶于水。,（二）VB2（核黄素）的性质,维生素B2在中性水里溶解极少，呈黄绿色的荧光，在强酸性和强碱性溶液中则充分溶解。橙黄色针状结晶，熔点为282的，耐热，对空气、氧气稳定。,测定维生素B2的方法有光黄素荧光法、核黄素荧光法、高效液相色谱法。光黄素荧光法
35、灵敏度和精密度都较高，适用于测定农产品中的维生素B2。高效液相色谱法测定维生素具有简便、快速，可同时进行多种水溶性维生素测定等优点，是近年发展较快的测定方法。,（三）维生素B1和B2的测定（液相色谱法）,1、方法原理：样品在稀盐酸溶液中经消化，用淀粉酶和木瓜酶分解样液中的淀粉和蛋白质后，即得到维生素B2的测定样液。此溶液在碱性铁氰化钾溶液中氧化后用异丁醇提取所得即维生素B1测定样液。然后用YWG-Cl8柱,乙腈磷酸盐缓冲溶液作流动相，以荧光检测器进行液相色谱法测定，求出样品中维生素B1和维生素B2的含量。,3、操作步骤,(1)样品处理。固体样品粉碎过20目筛，果蔬、肉类及水产品经捣碎备用。 称
36、取试样1.00g(维生素B1和B2含量不低于0.5g)于50ml棕色容量瓶中，加入0.1 molL-1盐酸溶液35ml，在超声波浴中超声3min或转动摇匀，在高压灭菌锅内121保持2030min或置于沸水浴中加热30min，然后轻摇数次，取出，冷却至40以下，分别加混合酶液各2.5mL，摇匀，置于37下过夜或4243加热4h，冷却，用水定容。样液经每分钟3000转速度离心过滤，取约10ml，滤液备用。然后取滤液直接进行维生素B2测定。,取上述滤液5ml于60ml分液漏斗中，沿分液漏斗壁加碱性铁氰化钾溶液3ml (边摇边加)，继续振摇10s，立即加入异丁醇8ml，并猛烈振摇45s静置分层后弃去水
37、层。有机相通过无水硫酸钠小柱，其收集液为维生素B1待测液。,(2)标准溶液制备。准确吸取2mgL-1维生素Bl和维生素B2混合工作液0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00ml，于50ml棕色容量瓶中，再加入与样品等量的0.1mol/L盐酸，以下操作同样品处理，得到维生素B2标准系列水溶液和维生素B1标准系列异丁醇溶液。,(3)样品测定。4、注释（1）维生素B2测定用消化后的滤液直接进样，处理后的标准和样品都有杂质峰，但能分离维生素B2，不影响测定。（2）由于维生素B1被碱性铁氰化钾氧化并不是定量产生硫胺素，但在恒定条件下是一个恒量。用异丁醇萃取的维生素B1也是如此。因此本法采取等
38、体积进样。（3）样品处理是能否获得满意结果的关键。,（4）液相色谱仪有： a.荧光分光光度检测器及记录仪； b.色谱柱（5）VB1和VB2测定时所用的流动相不同。VB1：流动相A，以磷酸盐缓冲液80份（0.025mol/L磷酸缓冲液，pH7.4）和乙腈20份相混而成；VB2：流动相B，以磷酸盐缓冲液82份和乙腈18份混合而成。,（6）碱性铁氰化钾溶液。吸取150g/L氢氧化钠溶液97mL加入10g/L铁氰化钾3mL混合而成。混合酶溶液（淀粉酶和木瓜酶各3g，用2mol/L醋酸钠稀释至100mL）（7）测时仪器条件（参考） VB1：激发波长435nm，狭缝为10nm，发射波长为375nm，狭缝为12.5nm，灵敏度10。 VB2：激发波长440nm，发射波长为565nm,狭缝为12.5nm，灵敏度3,其他同VB1。,
