1、1胎盘间充质干细胞的分离，原代与继代培养及鉴定刘亭 2016.7.21目录前言 .21 分离制备 PMSC 组织的选取 .32 脐带，胎盘 MSC 的分离与纯化 .52.1 胎盘组织的获取，存储与清洗 .52-2 脐带，胎盘 MSC 的分离及纯化方法 .63 原代培养和继代培养 .103-1 培养基 .103-2 培养密度 .113-3 培养条件 .113-4 换液 .113-5 传代培养 .123-6 细胞形态与生长速度 .123-7 MSC 的冻存与复苏： .124 细胞表面抗原检测 .135 生长曲线 .136 细胞周期 .137 分化潜能 .13参考文献 .13附件 1 不同实验室从脐
2、带血，脐带和胎盘等各组织中分离 MSC 的方法 .15脐带血 .15脐带 .15羊膜 .17绒毛膜 .18蜕膜层 .18胎盘 .19整体灌注法 .20附件 2 背景知识 .20附件 3 PMSC 实验所需试剂 .212前言干细胞（Stem cell，SC）是一种能够自我更新且未分化并可分化成两个或两个以上其它品系的细胞。在一定的条件下，干细胞能够分化成为多种成熟细胞类型。按照来源和分化潜能不同，干细胞可分为胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESC）和成体干细胞（Adult stem cell，ASC）两类。 胚胎干细胞来源于早期的胚泡和胚胎内层的细胞群，并且具有向 3 个胚层
3、细胞分化的能力。但是胚胎干细胞应用时产生的免疫排斥、体内实验中引发肿瘤生成以及所涉及的伦理问题等影响并制约了临床应用。成体干细胞形成于原肠胚形成后的胎儿和成体组织，早期研究认为，成体干细胞主要分化为其来源组织的细胞类型。然而，近几年来的很多研究表明，成体干细胞具有能够分化成为除来源以外的其他胚层组织的能力。间充质干细胞（M esenchymal stem cell, MSC）又称为基质干细胞，是属于成体干细胞的一种，最早从骨髓中分离而来。MSC 是由早期中胚层发育而来的非造血成体干细胞，该细胞在体外可以贴壁生长，并呈现梭状。胞质丰富，细胞核呈圆形，1-3 个核仁。在适当的条件下可以大量扩增，并
4、转化为间充质祖细胞，进而分化成包括三个胚层的各种组织细胞，如脂肪、骨、软骨、内皮细胞、成纤维细胞等。MSC 具有低的免疫原性、能向肿瘤迁移、具有免疫调节和造血支持等功能，而且易于外源基因导入表达，是基因治疗中重要的载体细胞。此外，一些研究学者还发现，MSC 具有类似免疫抑制剂作用，可抑制 T 淋巴细胞在混合淋巴细胞中的免疫反应，并同时抑制 T 细胞的异基因增殖反应。所以， MSC 在治疗组织缺损、器官退行性疾病、肿瘤及免疫疾病具有相当广泛的应用前景。近年来MSC 已逐步成为干细胞研究的热点（张慧娟等，2014） 。 目前所报道的间充质干细胞主要来源于骨髓，采用密度梯度离心法获得。虽然分离方法简
5、便，但供者取骨髓需要经历一个比较痛苦的手术，并在取材过程中及取材后会有很高的感染机会；由于人体骨髓中间充质干细胞的含量极其稀少，每 105-106 个单个核细胞中大约只有 1 个；而且随着年龄的增加，骨髓中间充质干细胞的数量、增殖和分化能力均显著下降，使其在研究和应用尤其是3临床应用中受到限制。其他组织中，如动员的外周血、乳牙、脐带、脐血也存在间充质干细胞，然而，从这些组织中获得的细胞数量较为有限。以上因素，都限制了间充质干细胞在组织工程和临床中的运用。目前胎盘或脐带属于临床废弃物，容易获得，并且无污染，取材研究和应用基本无伦理学争议，研究表明胎盘或脐带含有丰富的 MSC。有研究表明PMSC
6、比骨髓间充质干细胞更容易分离培养，细胞活性更好，还可诱导分化成脂肪，成骨等多种细胞。并且这些胎盘源的间充质干细胞（placenta-derived mesenchymal stem cells，PMSCs）具有极低的免疫原性，大多数患者对于胎盘或脐带间充质干细胞具有天然的免疫耐受，因此，人胎盘间充质干细胞在研究相关疾病的动物模型中，即便是人-动物模型间的异种间移植，由于存在天然的免疫耐受，对实验研究的结果影响甚小，这对于很多疾病研究的模型建立具有很好的作用。目前 MSC 主要临床应用于抑制移植物抗宿主反应。动物模型研究结果表明 PMSC 对子宫内膜损伤（刘芳，2013） ，大鼠肝组织损伤（宫黎
7、明等，2011） ，APP+转基因鼠阿尔茨海默病（郭亚男等，2009）均有疗效，也可以用于构建组织工程皮肤（徐彪等，2013） 。所以，综合充分利用胎盘和脐带作为间充质干细胞新来源，优化分离纯化以及传代培养条件，加快细胞繁殖速度，降低培养成本以高效率获取大量的 PMSC 对于的各种疾病实验研究及医院各个科室的临床应用，都具有重要意义。1 分离制备 PMSC 组织的选取胎盘起源于胚胎发育期胚外中胚层，人足月娩出的胎盘由羊膜层、绒毛膜层和蜕膜层组成。从脐带血（于海微等，2009；管英华等，2011） ，脐带（徐燕等，2009；韩之波等，2012；管英华等，2011；李艳琪等，2014；赵琳等，20
8、16） ，整个胎盘（陆琰等，2009；沙文琼等，2010；刘洋等，2015；赖平等，2016） ，胎盘的羊膜层（宫黎明等，2011；徐彪等，2013；张慧娟等，2014；丛姗等，2015） ，绒毛膜层（洪艳等，2014；韩之波等，2012）和蜕膜层（韩之波等，2013）分离培养 MSC 均有报道。目前大多数研究者取胎盘小叶（包括绒4毛层和绒毛滋养层）进行分离（洪艳等，2014） 。胎盘的细胞成分较复杂，既有滋养细胞，也有间质细胞、血管内皮细胞和 Hofbauer 细胞（沙文琼等，2010） 。由胎盘组织分离制备 MSC 时不可避免会有其它细胞的干扰（苗宗宁等， 2009） ，其中以数量最多的血
9、细胞干扰为主。分离 MSC 选取组织时需要考虑哪个部位的组织可能含有最多的 MSC，并且尽可能降低其它种类细胞的干扰，以获得纯度高，活力强的 MSC。对于人脐带血来源的 MSC（human umbilical cord blood MSC, hUCB-MSC）的存在及能否稳定传代扩增，曾有一定争议，后来的实验结果证实脐带血中存在 MSC，并表明脐带血来源 MSC 与骨髓来源 MSC 具有相同的生物学特性及功能特征（于海微等，2009） 。但是脐带血中也存在多能成体干/祖细胞，分离间充质干细胞的过程以丢失造血干细胞为代价，而且个体差异大（徐燕等，2009） 。脐带包括一条静脉和两条动脉，周围是W
10、hartons Jelly，外层由羊膜来源的上皮包裹，从发育角度来说，脐带是干细胞形成及所经通路（管英华等，2011） 。不同研究机构均从人脐带组织中分离到MSC（human umbilical cord MSC, hUC-MSC） 。已有研究表明人脐带的结缔组织是间充质干细胞丰富的组织来源（徐燕等，2009） ，故制备hUC-MSC 一般剥离脐带动静脉和外层上皮。管英华等（2011）比较了脐血和脐带两种来源的MSC原代培养过程，结果表明脐血中细胞成分复杂，原代培养多见成纤维样和大圆形破骨样两种形态的贴壁细胞，随着换液和传代破骨样细胞逐渐减少和消失，剩下形态较为单一的呈漩涡样的细胞集落; 脐带
11、来源培养的贴壁细胞不会随换液丢失，且细胞形态以成纤维样细胞为主，种类单一。hUC-MSCs 比hUCB-MSCs原代培养的时间短，培养成功率明显增高。羊膜是胎膜最内层，胎盘包裹胎儿面的一层薄而半透明的膜，由胚胎羊膜囊壁发育而成，在胎盘面与绒毛膜相贴，由人羊膜间充质细胞和人羊膜上皮细胞组成，其表面没有神经、血管、肌肉和淋巴等组织。人羊膜间充质细胞来源于原条期的胚胎中胚层，而人羊膜上皮细胞来源于胚胎外胚层。越来越多的研究已证实，人羊膜间充质细胞和人羊膜上皮细胞都具有干细胞的特征。其中人胎盘羊膜来源的间充质干细胞（human amnion-derived mesenchymal cells, hAD
12、-5MSCs）不但表达成体干细胞特性中的间充质干细胞特性也表达部分胚胎干细胞特性，相关研究表明人羊膜间充质干细胞表达胚胎干细胞全能型标志转录因子基因OCT4、SOX2和NANOG（张惠娟等，2014）以及SSEA-3、SSEA-4、Oct-4等胚性标志（宫黎明等，2011） ，近年来发现hAD-MSCs在体外诱导培养条件下，可分化成来自3个胚层的所有细胞（宫黎明等，2011） 。有研究比较人羊膜间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的增殖能力，发现培养人羊膜间充质干细胞的细胞数量在各时间点均明显高于骨髓间充质干细胞（徐彪等，2013） 。洪艳等（2014）分别从绒毛膜和绒毛滋养层分离并培养 MSC，发
13、现在分离过程中，从绒毛膜和绒毛滋养层得到的细胞量都很多，绒毛滋养层的细胞量甚至会超越绒毛膜的细胞量。但是在接种后培养时，由于绒毛滋养层血细胞较多，血细胞难以处理，影响间充质干细胞的贴壁，无法贴壁就无法继续生长，由此导致后期细胞生长慢，收获细胞少。韩之波等（2013）的研究表明来自母体的底蜕膜组织也可以分离制备MSC。苗宗宁等（2009）将胎盘组织分为 3 组，分别是中央带组即脐带附着处，边缘带组即距脐带附着点最远处和中间带组即两者之间中点处。分别全层连续切片，以抗 CD166、抗 CD44、抗 CD29 分别做免疫荧光和免疫组织化学染色，显微镜下观察阳性细胞表达及分布分布区域，结果表明中间层的
14、阳性细胞数量与表达水平强于绒毛板层和底板层；同为中间层，中央带较中间带及边缘带表达更强。由此推测，在接近血管丰富的脐带附着部的胎盘中间层取材易于获得较丰富的 PMSCs。2 脐带，胎盘 MSC 的分离与纯化2.1 胎盘组织的获取，存储与清洗母血检测 HBV、HCV、HIV、CMV、EBV、梅毒均为阴性。产妇无传染性疾病，胎儿无先天性疾病。临床足月正常剖宫产后胎盘，大小及质量在正常范围内，胎盘脐带附着点均在胎盘中央稍偏位。经与产妇及其家属签署知情同意书，实验方案经并经医院伦理委员会批准。在产房无菌条件下获取脐带，胎6盘。文献报道中取组织后有如下处理方法：立即浸入胎盘储存袋（加拿大 LABPLAS
15、 公司的无菌采样袋，含 99%低糖DMEM，1%双抗即青链霉素的组织保护液） ，在 48 h 内转移至实验室。脐带静置于冰箱 12h， 观察保存脐带的 PBS 液， 若无浑浊说明无感染。脐带采集后在 6 h 内进行处理，切除双侧带夹痕及淤血的部分。无菌采集健康足月剖宫产羊膜，冰盒中 2 h 内运达实验室进入试验流程。无菌采集健康足月剖宫产胎盘，并立即进入分离提取程序。文献报道中组织块的用量及获得：胎盘组织约 50 g35 个胎盘小叶剪取胎儿侧的绒毛膜层组织 10 mL眼科手术剪将组织剪碎（细碎小块；1mm 3 大小；呈肉糜状，以能用吸管吸取为标准；约 3mm；5 mm 3 大小的碎块）组织绞碎
16、分离机（近似肉糜）文献中的组织浸泡液/清洗液：# 生理盐水# D-Hanks 平衡液# 磷酸缓冲液（PBS）# 杜氏磷酸缓冲液（D-PBS）# 含肝素的 PBS# 含有双抗生素的 PBS (0.1%的青链霉素，1%的青链霉素, 100 U/mL 青霉素, 100 g/mL 链霉素)# 含有青霉素和链霉素的无血清 DMEM /F12 培养基2-2 脐带，胎盘 MSC 的分离及纯化方法已报道脐带，胎盘 MSC 的分离方法有组织块贴壁法，酶消化法以及整体灌注法。组织贴壁培养法得到的细胞纯度较高，对细胞伤害小，操作相对简单，7将组织块剪碎、贴壁后加培养基培养即可，但原代培养所需周期较长、获得细胞数量相
17、对有限。李艳琪等（2014）在首次组织块贴壁培养获得 MSC 后，将组织块转移到新的培瓶中继续培养，两三天后仍可见到贴壁细胞，第 5 天可形成明显的细胞克隆。这种改进的组织块二次贴壁方法可在较短时间内获得大量原代细胞。 酶消化法可直接将消化得到原代细胞，但是获得的细胞纯度略低、状态不均一，由于消化时间不易掌握，消化时间过短不能得到足量细胞，消化时间过长会对细胞造成伤害，损伤细胞膜成分，导致无法贴壁生长，影响细胞的成活率和增殖能力，甚至导致细胞死亡，给后续培养带来困难（李艳琪等，2014） ；对于某些组织如脐带 Whartons 胶经酶消化后的胶体黏稠，不易离心。徐燕等2009 比较，植块法培养
18、 610 d 可见成纤维样细胞从植块边缘爬出，在原代细胞克隆数、细胞产率、传代时间及扩增倍数上明显好于胶原酶消化法（1 g/L 胶原酶3.05.0 mL， 置于含双抗的 PBS 中，37 孵育 0.5 h）比较存在差异；而胶原酶与胰酶联合消化法（1 g/L 胶原酶于 37 孵育 16 h，以 PBS 洗涤后加入 25 g/L 胰酶于 37 孵育 0.5 h）接种后未见明显贴壁细胞。常用的酶包括胰蛋白酶，胶原蛋白酶，和。胰蛋白酶消化能力强，型胶原酶消化能力相对较弱，但对细胞膜损害较小。很多研究者对酶的浓度，消化时间，消化方式，多种消化酶联合消化做了大量探索。寻求既能充分的分离细胞，又能避免细胞的
19、损伤的方法（赖平等，2016）组织经酶消化后需要用筛网/多层纱布过滤（100 目， 200 目，300 目，100 m 的滤器 ） ，除去未被消化的大组织块。滤出的细胞成分复杂，常含有大量的血细胞。现阶段用于分离纯化方法间充质干细胞的方法主要有以下几种：一般离心、密度梯度离心法、贴壁筛选法、红细胞裂解液法、淋巴细胞分离液( Ficoll) 、羟乙基淀粉沉淀、流式细胞仪分选法或磁珠分选法。因为间充质干细胞没有特异的表面标志，应用流式细胞仪分选法或磁珠分选法会损失大量细胞，且成本高。每种方法各有优缺点，使用红细胞裂解液对于间充质干细胞的损伤大，使用淋巴细胞分离液进行分离的可重复性较差，技术不稳定（
20、洪艳等，2014） 。文献中报道的消化酶的浓度，消化时间，次数及组合消化：8机械剥离胎盘羊膜组织，PBS 反复冲洗，将羊膜组织剪成细碎小块，0.25%胰酶 37 消化 10 min，过 100 目筛网过滤获得细胞液。经胰酶消化后的组织块，继续经 0.1% 型胶原酶 37消化 15 min。含体积分数为 10%胎牛血清的 L-DMEM 终止反应后，过 100 目筛网获得细胞液。两次收集的细胞液 1 000 r/min离心 10 min，弃上清液（徐彪等，2013） 。将胎盘组织碎片置于 200 mL 无菌离心管中，联合应用 0.25%胰蛋白酶和0.1% 型胶原酶 消化胎盘组织碎片。37 摇床消化
21、 30 min，去除组织留取消化液，经 1 500 r/min 离心 5 min，收集离心获得的细胞沉淀。将离心后收集到的细胞重悬于含体积分数为 10%胎牛血清的 -MEM 培养基（刘洋等，2015） 。剪碎羊膜，加入 0.5 g/L 胰蛋白酶-0.02% EDTA-2Na 消化液，37，200 r/min 旋转 消化 10 min，弃上清，再加入消化液， 37 旋转消化 30 min，弃上清，按同样的程序再重复消化 2 次。经胰酶消化后剩余的组织用 D-PBS 液冲洗，加入 0.75 g/L 型胶原酶-0.075 g/L DNase I 消化液， 37 、200 r/min 旋转消化 2.0
22、3.0 h，直至组织完全消化，经 300 目 不锈钢网过滤， 收集细胞滤液，1 500 r/min，离心 10 min，弃上清，细胞沉淀悬浮于 LG-DMEM 培养基（宫黎明等，2011） 。张慧娟等（2014）无菌条件下取正常足月剖腹产胎儿的羊膜剪成碎片，分别通过 7 种消化方法，发现用 0.05 g/L 的胰蛋白酶连续消化 2 次每次消化 30 min，然后用 1 g/L 的胶原酶消化 60 min 是最合适的人羊膜间充质干细胞体外分离培养条件。0.05 g/L 胰蛋白酶消化 10 min 后，再加 0.75 g/L 胶原酶消化 60 min0.75 g/L 胶原酶直接消化 120 min
23、0.05 g/L 胰蛋白酶与 0.75 g/L 胶原酶同时消化 60 min0.05 g/L 的胰酶消化 30 min 后，再加 0.75 g/L 胶原酶消化 30 min0.05 g/L 的胰蛋白酶连续两次消化 30 min 后，再加入 0.75 g/L 的型胶原酶消化 60 min0.05 g/L 的胰酶连续 2 次消化 40 min 后，再加 0.75 g/L 胶原酶消化 60 min0.05 g/L 的胰酶连续 2 次消化 30 min 后，再加 1 g/L 的型胶原酶消化 60 9min取前处理的样品在 37 下，用 0.05 g/L 的胰蛋白酶连续 2 次消化 30 min，用含体
24、积分数 5%的胎牛血清 DMEM 终止消化，轻柔吹打混匀后 200 目细胞筛过滤，筛中组织经 PBS 冲洗后装入培养皿中，然后加入 1 g/L 的型胶原酶，在 37 下消化 60 min，之后用含体积分数 5%的胎牛血清 DMEM 终止消化，轻柔吹打混匀后 200 目细胞筛过滤，滤液在 1 500 r/min 的离心机中离心 5 min，去上清液，换 DMEM/F12 培养基混悬细胞并接种于培养皿中（张慧娟等，2014） 。用眼科手术剪将羊膜剪碎约 1 mm1 mm 组织块，加入等体积的 0.05% trypsin-EDTA， 37 水浴震荡消化 30 min 后加入含血清的培养液， 离心去上
25、清， 如此反复消化两次， 再用 PBS 洗 23 次， 尽可能去除上皮细胞。用细胞筛过滤后剩余的羊膜组织加入不同浓度型胶原酶(0.75、1.00 和 2.00 mg/mL)，37 水浴震荡消化 60 min， 加入含血清的培养液终止消化， 混匀后用 200 目细胞筛过滤， 再将滤液 1 500 r/min 离心 5 min 收集细胞（丛珊等， 2015） 。按体积比约 16 加入型胶原酶( 0.1% ) ， 置于 37 恒温水浴箱中消化 30 min， 间隔 5 min 适当混匀组织与消化液。之后纱布过滤，上淋巴细胞分离液（赖平等，2016） 。使用 pH 7.4、含 25 mmol/LHEP
26、ES 的 D-Hanks 作为消化缓冲液，加入终浓度为 2.5 g/L 胰酶和 300 U/mL DNase组成消化液，冲洗后的胎盘组织分阶段消化，每个阶段在恒温气浴摇床中 37 、180 r/min 消化 20 min（沙文琼等，2010） 。用手术剪分别将绒毛膜层组织块剪成约 5 mm3 大小的碎块型胶原酶 10 mL （酶消化终浓度 0.1%） ，置于摇床内 37 、 250 r/min 振荡，约 90 min 后终止消化（洪艳等，2014） 。文献中报道的纯化方法：将细胞悬液缓慢加至已配好的淋巴细胞分离液中。1 500 r min -1， 4离心 20 min，离心后可见“ 白膜层”
27、，小心吸取该区域细胞，并加入 4 倍于该体积的 PBS 稀释， 1000 rmin-1，常温下离心 5 min。重复一次，弃上清（赖平等，2016）10Percoll 梯度密度分离 ： 在 50 mL 离心管中逐层铺入 7 个密度的 Percoll 分离液，每个密度 5 mL。再缓缓加入 5 mL 细胞悬液，使用水平离心机室温下 1 200 g 离心 20 min。 小心弃除离心管 20 mL 刻度以上的液体，收集 12.520.0 mL 刻度的细胞层(滋养细胞)和 12.57.5 mL 刻度(胎盘间充质干细胞 )的液体，分别放入不同离心管里，用 D-Hanks 液稀释 5 倍后，室温下 1
28、000 g 离心 15 min（沙文琼等，2010） 。陆琰等（2009）比较了四种胎盘组织分离纯化从 MSC 的方法：胶原酶+ 羟乙基淀粉沉淀组、胶原酶+ 羟乙基淀粉沉淀组、胶原酶+ 淋巴细胞分层液分离组、胶原酶+ 氯化铵裂解红细胞组。与胶原酶+ 羟乙基淀粉沉淀组比较，其余 3 组获取的细胞数均明显减少（t =2.928.16，P 0.05） 。在其他条件相同的情况下，胶原酶+ 羟乙基淀粉沉淀组培养成功率为 100%，其余 3 组分别为 80%，80% ，20% 。剪碎的胎盘组织与 1 g/L 胶原酶中， 37 消化 45 min。然后过细胞筛网，收集各组细胞悬液，分别于室温以 1 000
29、r/min 离心 5 min，弃上清。用 PBS 重悬细胞，加入 60 g/L 羟乙基淀粉（体积比为 4:1）充分混匀，室温静置 45 min，小心吸取上清，1 000 r/min 离心 5 min，弃上清， PBS 洗涤 2 次。以完全培养基重悬，制成单细胞悬液，锥虫蓝染色计数活细胞数。按 1.5109 L-1 密度接种于 T-25 塑料培养瓶中（陆琰等， 2009） 。3 原代培养和继代培养3-1 培养基从文献报道可以看出，需要 10%胎牛血清，低糖的 DMEM/F12 完全培养基，100 U/mL 青霉素+100 g/mL 链霉素，此外可选的有 5 g/L 碱性成纤维细胞生长因子，10 g/L 表皮生长因子，10 g/L 血小板衍生生长因子。文献中报道的培养基：# 10%胎牛血清的 L-DMEM 完全培养基# 5 g/L 碱性成纤维细胞生长因子和 10 g/L 表皮生长因子的 L-DMEM 完全培养基
