1、项目六,接种、分离纯化与培养,学习目标,了解微生物的遗传和变异熟悉微生物保藏的原理和方法掌握微生物接种、分离与培养的方法,微生物的遗传和变异,亲代与子代相似,遗传：,变异：,亲代与子代、子代间不同个体不完全相同,微生物遗传和变异的物质基础：,染色体,质粒,微生物变异的类型：,表型变异,遗传型变异,环境发生变化 DNA发生变化 暂时 长久 可逆 不可逆 不可遗传 可遗传,微生物变异的原因：,突变,基因突变：,染色体畸形：,DNA链上的一对或少数几对碱基发生置换、插入或丢失引起的，是DNA小损失。,大段DNA的缺失、重复、倒位、异位和染色体数目的改变，是DNA大的损失,突变特性：可遗传性、可逆性、
2、稀少性、独立性、不对应性、自发性、诱发性,微生物变异的原因：,基因重组：两个不同微生物个体的基因通过DNA分子的转化、转导、溶源转变、接合、原生质融合等方式，将一个个体的基因转移到另外一个个体的细胞内，使两个不同细胞基因重新组合产生出新的DNA分子的过程,菌种的选育,育种方法,自然育种,诱变育种,杂交育种,代谢控制育种,基因工程,菌种的衰退、复壮和保藏：,1.菌种的衰退,菌落和细胞形态的改变,生长缓慢、产孢子越来越少,代谢产物生产能力或对寄生能力的下降,衰退的原因,（1）基因突变 菌种退化的主要原因是有关基因的负突变。当控制产量的基因发生负突变，就会引起产量下降；当控制孢子生成的基因发生负突变
3、，则使菌种产孢子的性能下降等。一般而言，菌种的退化是一个从量变到质变的逐步演变过程。开始时，在群体中只有个别细胞发生负突变，这时如不及时发现并采用有效措施，就会造成群体中负突变个体的比例逐渐增高，最后发展成为优势群体，从而使整个群体表现出严重的退化现象。因此，突变在数量上的表现依赖于传代，即菌株处于一定条件下，群体多次繁殖，可使退化细胞在数量上逐渐占优势，于是退化性状的表现就更加明显，逐渐成为一株退化了的菌体。,（2）分离现象 通过遗传育种获得的多核（或是单核）菌种，由于其DNA双链中仅一条单链发生突变，随着传代，其生产性状也将发生退化。这种退化是由于诱变获得的高产菌株本身不纯，高产突变只发生
4、在一个核和一条DNA单链上，随着细胞分裂，核发生分离，因而突变基因与未突变基因发生分离，于是就出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株。,（3）环境条件 环境条件是影响菌种退化的一个重要原因。如培养条件对菌种退化的影响，可用糖化酶产生菌泡盛曲霉来说明。泡盛曲霉经诱变得到的突变株，在3种不同培养基上连续传代10次，发现不同培养基和传代次数对淀粉葡萄糖苷酶的产量有不同影响。环境温度也是影响菌种退化的重要因素，例如，温度高，基因突变率也高；温度低，则突变率也低，因此菌种保藏的重要措施就是低温。,防止衰退的方法,控制传代的次数,创造良好的培养条件,合理的育种,（1）合理的育种 选育菌种时，应尽可能使用孢
5、子或单核菌株，避免使用多核细胞；合理选择诱变剂的种类和剂量，以减少分离回复现象的发生；同时，在诱变处理后进行充分的后培养及分离纯化，以保证所获得的保藏菌种的纯度。这些可有效地防止菌种的退化。,（2）选择适合菌种生长的培养条件和外界环境 菌种培养基的培养条件应适宜，才能使菌种生长健壮，减少退化的发生。营养不足和过于丰富对菌种生长均不利。栖土曲霉3.942在培养时，发现培养温度从2830提高到3334，可防止它产孢子能力的退化。 此外，由于微生物生长过程积累的有害代谢产物，也会引起菌种退化，故不应使用陈旧的培养物作为种子培养。,（3）控制传代次数 由于微生物存在着自发突变，而突变都是在繁殖过程中发
6、生而表现出来的，所以应尽量避免不必要的移种和传代，并将必要的传代降低到最低限度，以减少发生自发突变的几率。菌种传代次数越多，产生突变的几率就越高，因而菌种发生退化的机会就越多。对于生产菌种，要尽可能利用它们的有效保藏期，可以采取一次接种足够数量的原种进行保藏，在整个保藏期内使用同一批原种。,（4）采用有效的菌种保藏方法 用于工业生产的一些微生物菌种，其主要性状都属于数量性状，而这类性状恰好是最容易退化的。因此，在实验室或生产上，选用合适的菌种保藏方法也可以有效防止菌种的退化。 （5）对菌种可能遭受病毒的感染应保持足够的警惕 对有疑问的菌种要及时检验，确定已感染病毒，尤其是病毒粒子含量大，菌丝体
7、及子实体性状已受到严重影响的菌种，应及时淘汰。,退化菌种的复壮 菌种退化是指群体中退化细胞在数量上占一定优势后，所表现出群体性能变劣的现象。因此，在已经退化的群体中，仍有一定数量尚未退化的个体。 狭义的复壮是指在菌种已经发生退化的情况下，通过纯种分离和筛选，从已经退化的群体中筛选出尚未退化的个体，以达到恢复菌种的原有典型性状的措施。而广义的复壮是在菌种的典型特征或生产性状未退化前，就经常而有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。由此可见，狭义的复壮是一种消极的措施，而广义的复壮才是一种积极的措施。具体的菌种的复壮措施如下：,复壮方法,纯种分离,粗放型：菌落纯,
8、精细型：细胞纯,通过寄主体进行复壮,淘汰已衰退的个体,1纯种分离法 纯种分离法是指通过纯种分离和性能测定，从已经退化的菌种群体中把仍保持原有典型优良性状的个体分离出来。在进行纯种分离前，可将待分离的退化菌种先接触一些恶劣环境，如药物、低温、高温等，往往可以起到淘汰生活力弱、留下强壮菌株的作用，因而能提高纯种分离的效果。,2通过宿主进行复壮 对于一些寄生型微生物，特别是一些病原菌，长期在实验室人工培养会发生致病力降低的退化。可将退化菌株接种到相应宿主体内以提高菌株的活力。 3淘汰已退化的个体 有人发现，若对细黄链霉菌“5406”农用抗生素的分生孢子采用-10-30的低温处理57d，使其死亡率达到
9、80%左右。结果会在抗低温的存活个体中留下未退化的个体，从而达到了复壮的效果。,菌种保藏,原理：根据不同菌种的生理、生化特点，创造条件使菌体的代谢活动处于休眠状态方法：首先要挑选优良纯种、休眠体，其次创造良好的环境条件（干燥、低温、缺氧、缺乏营养、添加保护剂、酸度中和剂）,菌种保藏的方法很多，一般有下面几种：A 斜面冰箱保藏法（酵母） 斜面保藏是一种短期、过渡的保藏方法，用新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满后，放在4冰箱保存。一般保存期为三个月到六个月。B 石蜡油封存法（酵母） 向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，用量要高出斜面一厘米，然后保存在冰箱中。此法可通用
10、于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等微生物的保存。保存期约一年左右。,三、菌种保藏的方法,C 沙土管保藏法（细菌，霉菌，防线菌 ） 这是国内常采用的一种方法。适合于产孢子或芽孢的微生物。它的制备方法是： 首先，将沙与土洗净烘干过筛后，按沙与土的比例为l2l混合均匀，分装于小试管中，装料高度约为1厘米左右，121C间歇灭菌三次，灭菌试验合格后烘干备用。一般沙用80目过筛，土用30100目过筛。其次，将斜面孢子制成孢子悬浮液接入沙土管中或将斜面孢子刮下直接与沙土混合，于干燥器中用真空泵抽干，放在冰箱内保存。一般保存期为1年左右。,D真空冷冻干燥保藏法（细菌，防线菌 ）,真空冷冻干燥保藏法是目
11、前常用的较理想的一种方法。其基本原理是在较低的温度下（15），快速将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。在这样的环境中，微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异。,因此，菌种可以保存很长时间，一般5年左右。这种保藏方法虽然需要一定的设备，要求亦比较严格，但由于该方法保藏效果好，对各种微生物都适用。所以，国内外都已较普遍地应用。,这种方法的基本操作过程是先将微生物制成悬浮液，再与保护剂混合，然后放在特制的安瓶管内，用低温酒精或干冰，使其迅速冻结，在低温下用真空泵抽干，最后将安瓿管真空熔封，并低温保藏。,保护剂一般采用脱脂牛奶或血清。保护剂的作用可能是在冷冻干燥的脱水过程中代替结
12、合水而稳定细胞成分（细胞膜）的构型，防此细胞膜因为冻结而破坏。保护剂还可以起支持作用，使微生物疏松地固定在上面。,E 液氮超低温保藏法（细菌，真菌） 液氮超低温保臧法足近几年才发展起来的，此法国外已较普遍采用，是适用范围最广的微生物保藏法。尤其是一些不产孢子的菌丝体，用其它保藏方法不理想，可用液氮保藏法。其保存期最长。a 原理 用液氮能长期保存菌种。这是因为液氮的温度可达一196，远远低于其新陈代谢作用停止的温度（一130），所以此时菌种的代谢活动已停止，化学作用亦随之消失。,b 操作方法及步骤（1）安瓿管要求 由于液氮保存于超低温状态，所使用的安瓿管需能承受大的温差而不致于破裂，一般用95料
13、或GCl7的玻璃管，安瓿管选好后印上标记，加棉塞后灭菌，烘干后备用。（2）菌种准备及分装 因为液氮法菌种要经受超低温的冷冻过程。所以也需要保护剂，常用的保护剂为10甘油。用保护剂制备好菌液后，加入准备好的安瓶管中，一般安瓿管的装量为0.21mL。,（3）冻结 液氮法的关键是先把微生物从常温过渡到低温。这样在细胞接触低温前，使细胞内自由水通过膜渗出而不使其遇冷形成冰晶而伤害细胞。 美国 ATCC采用先将菌液降温到0，再以每分钟降低1的速度，一直降低到38，然后才把装有菌液的安瓿管放入液氮罐的气相中。由于液氮要蒸发，这样温度就会上升，冰晶状态发生变化，从而导致菌种死亡。所以要常常注意液氮的残存量，
14、定期补加。（4）重新培养 当要使用或检查所保存的菌种时，可将安瓿管从冰箱中取出，室温或3540水浴中迅速解冻，当升温至0时即可打开安瓿管，将菌种移到适宜的培养基斜面上培养。 我国国内目前已有部分单位采用液氮法保存菌种。,斜面培养基接种法,原理：主要用于接种纯菌，使其增殖后用于鉴定或保存菌种，可以挑取平板培养基上的纯培养物或挑取斜面、肉汤中的纯培养物按无菌操作的要求接种到斜面培养基上，是进行菌种扩大培养、菌种保藏等任务的最常用的方法。,操作步骤,物品清点与摆放,超净工作台的消毒,手消毒,接种,琼脂平板划线分离法,基本原理A 平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化B 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落是由一个细胞繁殖而成的集合体，通过在平板上划线可得到单个菌落，因此，可通过挑取但菌落而获得一种纯培养物,操作步骤,融化培养基,倒平板,做分区标记,分区划线操作,恒温培养,挑取菌落,清理,涂布分离法,基本原理涂布分离法是指取少许梯度稀释菌悬液，置于已凝固的无菌平板培养基表面，然后用无菌涂布器把军也均匀地涂布在整个平板表面，禁培养或，在平板培养基表面会形成多个独立分布的单菌落，然后挑取典型的代表移至斜面，经培养后保存适合好氧菌或有气生菌丝的放线菌的分离与计数,操作步骤,倒平板,菌液稀释,涂布平板,平板培养,挑取单菌落,滴加菌液,
