1、第十二章 DNA复制与修复,1. 掌握遗传信息传递的中心法则。 2. 掌握DNA复制的一般规律：DNA的半保留复制、 DNA的半不连续复制的概念。 3. 了解三种大肠杆菌DNA聚合酶的催化特性及其功 用；了解原核生物DNA的复制过程。 4. 了解使DNA损伤的因素；DNA损伤的修复机制： 错配修复、碱基切除修复、核苷酸切除修复、直接修 复、重组修复及倾向差错的修复的过程及过程所需要 的酶类；了解DNA损伤修复的意义。,目的要求,1964-1970 发现劳氏肉瘤病毒的遗传信息传递方式：逆转录,1953年，Watson和Crick提出中心法则：遗传信息的单向流动。,中心法则：,RNA的复制存在于R
2、NA病毒,DNA是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过DNA的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息自DNA转录给RNA,然后翻译成特异的蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。,第十二章 DNA复制与修复,复制：以亲代DNA或RNA为模板，根据碱基配对的原则，在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。,几个基本概念：,逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。,翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的氨基酸顺序的过程。,
3、转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则合成RNA，即将DNA所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。,第十二章 DNA复制与修复,中心法则图示,一、DNA的半保留复制,2.半保留复制的实验证据:,1.定义：,1958年Meselson和Stahl用同位素15N标记大肠杆菌DNA,首先证明了DNA的半保留复制。,以亲代DNA双链为模板以碱基互补方式合成子代DNA，这样新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫半保留复制。,第十二章 DNA复制与修复,DNA复制的可能方式,全保留与全新复制,分散复制,半保留复制,DNA半保留复制图示：
4、,半保留复制的证明：,Meselson 和Stahl将同位素15N标记的15NH4Cl加入大肠杆菌的培养基中培养12代，使大肠杆菌的DNA都带上15N的标记，然后将该大肠杆菌转入14N的普通培养基中培养后，分离子一代、子二代、子三代、子四代DNA，进行氯化铯密度梯度离心，实验证明了DNA的半保留复制。,第十二章 DNA复制与修复,15N-DNA的密度大于14N-DNA的密度,亲代DNA（15N15N）,子一代DNA（15N14N）,子二代DNA (15N14N，14N14N 1:1),子三代DNA (15N14N，14N14N 1:3),子四代DNA (15N14N，14N14N 1:7 ),
5、亲代DNA与子二代DNA的混合物,亲代DNA与子四代DNA的混合物,复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图,DNA的半保留复制的生物学意义：,DNA在代谢上的稳定性并非指DNA是一种惰性物质。,DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，是保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代必要措施。,第十二章 DNA复制与修复,双向复制,单向复制,二、DNA复制的起点与方向,复制中的DNA,复制原点,复制叉,第十二章 DNA复制与修复,DNA复制的主要方式,大肠杆菌双链环状DNA的复制（一个复制起点，双向复制）,不同位置D-环式复制方式（线粒体双链环状DNA：两条链的复制起点不同位置，且复制不同步）,真核细胞线
6、状染色体DNA的复制方式（多个复制起点，双向复制）,单向滚环式复制（噬菌体X174DNA单链环状）,三、DNA复制的半不连续性,前导链,滞后链,冈崎片段,前导链：以3 5 方向的亲代链为模板连续合成的子代链。,滞后链：以5 3方向的亲代链为模板的子代链先逆复制叉移动方向合成冈崎片段，再连接成滞后链。,半不连续复制的发现,同位素实验，用含3H的dT标记用T4噬菌体感染的大肠杆菌 短时间内分离的DNA均为DNA小片段一段时间后检测到 DNA大片段。当用DNA连接酶的缺失的变异株时，检测到大量DNA片段的积累。证明DNA复制中有小片段合成。 测定DNA小片段，远远大于合成DNA的一半。似乎两条链都是
7、不连续合成的，后发现是由于U替代dT渗入DNA中，而被尿嘧啶-N-糖基酶切除所致。 在缺少尿嘧啶-N-糖基酶的突变植株中，DNA的U不再被切除，则检测到一半3H标记出现在小片段（冈崎片段）中。,1968日本学者冈崎：,四、与DNA复制有关的酶和蛋白质,原料：四种脱氧核苷三磷酸 （dATP、dGTP dCTP dTTP)需要模板：以DNA为模板链，合成子代DNA，模板可以是双链，也可以是单链DNA。合成产物与模板互补。 需要引物：一小段RNA(或DNA）为引物，在大肠杆 菌中，DNA的合成需要一段RNA链作为引物，引物含3 -OH. 合成方向：5 3 ,(一) DNA聚合酶：1956年Kornb
8、erg等在大肠杆菌中首先发现DNA聚合酶，其后发现该酶在许多生物中广泛存在。该酶的催化性质如下：,第十二章 DNA复制与修复,（二）大肠杆菌DNA聚合酶,（1）5 3 聚合酶功能（但持续合成DNA的能力差）； （2）3 5外切酶活性（对双链无作用，在正常聚合条件下，此活性不能作用于生长链，只作用于生长中不配对的单链，校对功能。）；（3）还具有5 3外切酶活性（双链有效）；,第十二章 DNA复制与修复,1、DNA聚合酶:1956年Kornberg首先从大肠杆菌中分离。该酶为单体酶,含一个锌原子。为多功能酶，具有:,该酶缺失时大肠杆菌仍具有DNA合成酶活性，只是对DNA损伤的修复能力下降，容易导致
9、变异和死亡。推测该酶主要是对DNA损伤的修复，以及在DNA复制时RNA引物切除及其缺口的填补。,DNA聚合酶催化的反应：,DNA聚合酶的功能,Arthur Kornberg 1918,Stanford University Stanford, CA, USA,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1959,for their discovery of the mechanisms in the biological synthesis of ribonucleic acid and deoxyribonucleic acid,2、DNA聚合酶：,多
10、亚基酶，聚合作用，聚合活力比DNA聚合酶高；持续合成DNA的能力差。该酶缺失时大肠杆菌仍具有DNA合成能力，推测该酶仍然不是真正的DNA聚合酶。该酶具有3 5外切酶活性。其功能可能在修复紫外光引起的DNA损伤中起作用。,第十二章 DNA复制与修复,3、DNA聚合酶,多亚基酶，含十种亚基:（），其中（）称为核心酶，2称为夹子，（2）组成复合物，其主要功能是帮助亚基夹住DNA，故称为夹子装配器，该酶DNA合成的持续能力强，主要与该结构有关。另外，该酶合成速度大，活性高，缺失时大肠杆菌因DNA复制抑制而致死。因此认为该酶DNA的真正复制酶。,第十二章 DNA复制与修复,DNA聚合酶全酶的亚基组成,D
11、NA聚合酶的异二聚体,前导链的合成,滞后链的合成,DNA聚合酶的-钳子俯视图,DNA双螺旋,大肠杆菌三种聚合酶比较,大肠杆菌三种DNA聚合酶比较,(三）DNA连接酶：连接DNA双链中的单链切口,作用特点：,大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶要求NAD+提供能量；在高等生物和噬菌体中，则要求ATP提供能量。T4噬菌体的DNA连接酶不仅能连接双链DNA上的粘性切口，而且能连接无粘性末端的平头双链DNA。,DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用。,第十二章 DNA复制与修复,DNA连接酶作用机理,(四)与DNA合成有关的其它蛋白因子(大肠杆菌中),1、拓扑异构酶,拓扑异构酶：催化D
12、NA的拓扑连环数发生变化的酶，在DNA重组修复和其它转变方面起重要作用。 除连环数不同外其它性质均相同的DNA分子称为拓扑异构体，引起拓扑异构体反应的酶称为拓扑异构酶。,第十二章 DNA复制与修复,拓扑异构酶：使DNA一条链发生断裂和再连接。作用是松解负超螺旋，反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同转录有关。,拓扑异构酶：使DNA两条链发生断裂和再连接。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量，同复制有关。,两类拓扑异构酶作用特点:,第十二章 DNA复制与修复,二者共同控制DNA的拓扑结构。,2、解螺旋酶 （解链酶）,通过水解ATP将DNA两条链打开。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有
13、解螺旋酶I、II、III。每解开一对碱基需要水解2个ATP分子。,稳定DNA解开的单链，防止复性和保护单链部分不被核酸酶水解。,3、单链结合蛋白：,第十二章 DNA复制与修复,引发体可以沿模板链5 3方向移动,具有识别合成起始位点的功能，移动到一定位置上即可引发RNA引物的合成。移动和引发均需要ATP提供能量， n蛋白具有ATP酶的活力。引发体的移动与复制叉移动的方向相同，与冈崎片段的合成方向相反。,3、引物合成酶与引发前体,引物合成酶：催化引物RNA的生成,第十二章 DNA复制与修复,引发前体:它由多种蛋白质dnaA、dnaB、dnaC、n、n、n和i组成。引发前体再与引发酶结合组装成引发体
14、。,（五）、参与DNA复制的酶与蛋白因子总览图,五、 DNA的复制过程：（以大肠杆菌为例）,复制的终止：,复制的起始1、起始复合物的形成：称为引发2、RNA引物的合成,链的延伸：,第十二章 DNA复制与修复,复制原点oriC和原点的识别：,从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子（基因组独立进行复制的单位）。,DNA的复制有特定的起始位点，叫做复制原点。常用ori C(或o）表示。大肠杆菌的复制原点ori C由245个bp构成，含两组保守的重复序列：三个13bp的序列（富含A、T的序列）和四个9bp的序列；许多生物的复制原点也都是富含A、T的区段。,复制原点由DnaA蛋白识别， 在原点由D
15、naB蛋白（解螺旋酶）将双螺旋解开成单链状态，分别作为模板，合成其互补链(DNA双链的解开还需DNA拓扑异构酶 、 SSB),在原点处形成一个眼状结构，叫复制眼。,（一）复制起始,1、拓扑异构酶解开超螺旋。2、Dna A蛋白识别并在ATP存在下结合于四个9bp的重复序列。3、在类组蛋白（HU、ATP参与下, Dan A蛋白变性13个bp的重复序列,形成开链复合物。4 、Dna B借助于水解ATP产生的能量在Dna C的帮助下沿5 3 方向移动，解开DNA双链，形成前引发复合物。5、单链结合蛋白结合于单链。6、引物合成酶（Dna G蛋白）开始合成RNA引物。,(二) 链的延长（冈崎片段的合成）,
16、真核生物的冈崎片段为：100-200bp 原核生物的冈崎片段为：1000-2000bp,DNA链的延伸,在DNA聚合酶的催化下，以四种5 -脱氧核苷三磷酸为底物，在RNA引物的3端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出焦磷酸。DNA链的延伸同时进行前导链和滞后链的合成。两条链方向相反。,冈崎片段引物的切除、缺口的填补和切口的连接:,前导链和滞后链的合成（DNA聚合酶的异二聚体催化）,(三) 复制的终止,顺时针终止陷阱,逆时针终止陷阱,Ter:终止陷阱，引起复制终止的特定区域，20bp的序列，终止利用物质Tus可识别并结合，从而导致DNA复制的终止。,大肠杆菌DNA复制的终止,(四) DNA复
17、制的精确性（高保真复制）,1、碱基的配对规律：摸板链与新生链之间的碱基配对保证碱基配错几率约为1/1041/105。2、DNA聚合酶的35外切酶活性的校对功能，使碱基的错配几率又降低1001000倍。3、DNA的损伤修复系统。,第十二章 DNA复制与修复,DNA复制必须具有高度精确性，在大肠杆菌的细胞DNA复制中其错误率约为1/1091/1010，即每1091010个核苷酸才出现一个错误，也就是大肠杆菌染色体DNA复制100010000次才出现一个核苷酸的错误。这么高的精确性的保证主要与下列因素有关：,六、复制起始的时序控制,七、真核生物DNA复制的特点,4、真核生物染色体在全部复制完之前起点
18、不再重新开始复制；而在快速生长的原核生物染色体DNA复制中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。,第十二章 DNA复制与修复,1、真核生物染色体有多个复制起点，称为自主复制序列（ARS）或复制基因(replicator);多复制眼，呈双向复制，多复制子。,2、冈崎片段长约200bp。,3、真核生物DNA复制速度比原核慢，速度为10003000bp/min(仅为原核生物的1/201/50）。,真核DNA复制特点,7、RPA：真核生物的单链结合蛋白；RNaseH1和MF-1切除RNA引物，DNA聚合酶填补缺口。,第十二章 DNA复制与修复,5、真核生物有多种DNA聚合
19、酶,DNA聚合酶（）是真正的复制酶，在PCNA存在下有持续的合成能力。PCNA称为增殖细胞核抗原，相当于大肠杆菌DNA聚合酶的-夹子，RFC蛋白相当于夹子装配器。,6、真核生物线性染色体两端有端粒结构，它是由许多成串的重短复序列组成，端粒功能是稳定染色体末段结构，防止染色体间的末端连接，并可补偿滞后链5-末段在消除RNA引物后造成的空缺，使染色体保持一定长度。端粒酶是含一段RNA的逆转录酶.,真核细胞内有五种DNA聚合酶,真核细胞DNA复制示意图,八、DNA损伤的修复,DNA突变： DNA的核苷酸顺序永久性的改变称为DNA的突变。其主要形式有： 1.点突变：DNA分子中一个碱基对替代另一个碱基
20、对称为点的突变。 2.插入作用：DNA分子中插入一个或几个碱基称为插入作用。 3.缺失作用： DNA分子中缺失一个或多个碱基对称为缺失作用。,DNA在复制时产生错配，病毒基因整合，某些物化因子如紫外光、电离辐射和化学诱变等，都可能使DNA的结构及功能发生改变。从而引起生物突变，甚至导致死亡。,DNA的损伤与DNA突变：,DNA突变可能导致肿瘤的发生:,着色性干皮病：对嘧啶二聚体和大的DNA损伤修复酶的缺失而产生的一种皮肤癌。,沉默突变：突变影响非必需的DNA或突变对一个基因的功能的影响可忽略，称为沉默突变。,回复突变：一些突变可以克服第一次突变造成的影响，这类突变称为回复突变。,动物细胞的突变
21、与癌的发生有强烈的相关性。,通常生物体DNA的损伤有一系列的修复机制，如：错配修复、碱基的切除修复、核苷酸的切割修复、直接修复、重组修复等。,DNA损伤的修复机制:,1、参与错配修复的酶与蛋白质Dam甲基化酶 ; MutH、MutL、MutS蛋白 ; 解螺旋酶 ; DNA聚合酶 ;外切酶、 、 ； RecJ核酸酶DNA连接酶 ； SSB,（一）错配修复,第十二章 DNA复制与修复,MutS识别并结合与碱基错配处,MutH-Mut二聚体结合后沿两个方向移动，形成DNA环，直至遭遇半甲基化的CTAG。,MutH在CTAG的5-端切开一个切口，核酸外切酶、沿3 5方向切除含配错碱基的新链,DNA聚合
22、酶补缺，DNA连接酶连接切口。,高度耗能的错配修复,(二) 碱基的切除修复,（1）DNA糖基化酶切除损伤的碱基产生无碱基酸,（2）无碱基核酸内切酶无碱基酸处切开产生切口。,（3）DNA聚合酶将无碱基酸切除并填补缺口。,（4）DNA连接酶连接切口。,（三）核苷酸的切除修复,DNA解螺旋酶,核苷酸切除修复（2）,光解酶,uvrB、uvrA蛋白结合,uvrB产生3-端切口,uvrC产生5-端切口,DNA聚合酶或,DNA连接酶,uvrD切除,（四）直接修复（1）,（四）直接修复,直接修复（2）,O6-methylguanine-DNAmethyltransferase,Cys-S,CH3,A tran
23、scriptionactivator ofIits own gene,O6 methylguanine on DNA isdirectly repaired by removingthe methyl group by a Cys,（五）重组修复,（发生在复制后）：复制时，跳过损伤部位，新链产生缺口由母链弥补，原损伤部位并没有切除,但在后代逐渐稀释。,（六）SOS反应和诱导修复（易错修复）,SOS反应：细胞DNA受到严重损伤或DNA复制系统受到抑制的紧急状态下，为求生存而出现的 应急反应。,SOS反应包括:,避免差错的修复能力增强,诱导产生无校正功能的DNA聚合酶合成,抑制细胞分裂,SOS反应是生物在不利环境中求得生存的一种基本功能。对原核生物它产生高变异，对高等动物则是致癌的。,第十二章 DNA复制与修复,生物化学,DNA复制与修复,（Replication and Repair of DNA),完,
