1、1,麝香保心丸：治疗性血管新生和系统生物学研究Therapeutic Angiogenesis and the Systems Biologic Research of SXBX Pill,2,冠心病的治疗，要解决血氧供需平衡，不是减少心肌耗氧，就是增加冠脉供血血管新生背景与概念血管新生的研究方法促进治疗性血管新生的方法麝香保心丸促血管新生研究,提 要,3,治疗性血管新生研究背景,Folkman在1970年代早期发现血管新生：肿瘤生长:血管生长因子与血管新生相关1983年, Kumar 等发现：心肌梗塞后有“血管生长因子” 1980年代中期，确定并纯化了多种与血管新生有关的多肽1994年 Je
2、ff Isners 实验室倡导将血管生成用于心血管研究中。Ellis Ungers 实验室发现应用促血管生成的蛋白质可以改善冠脉侧支。,Judah Folkman （1933-2008）美国国家科学院院士，于70年代提出了肿瘤新生血管学说，该理论后被心血管领域应用于促血管新生研究,4,侧支血管形成的种类,微血管生长（Angiogenesis）血管发生（Vasculogenesis）动脉生成（Arteriogenesis） 三者的机理是不同的,5,血管新生(angiogenesis),相当于废墟上重建 在缺血区域现有血管基础上通过芽生(sprouting)、分枝方式形成成熟的血管，由初级网状血管
3、结构到复杂网状血管结构的过程。 血管内皮细胞基底膜降解、细胞外基质消化吸收。 内皮细胞向血管生长刺激物方向移行和增殖。 移行的血管内皮细胞伸展，彼此相连形成血管芽孢。 血管内皮细胞增殖使中空的管腔延长。,6,血管发生（Vasculogenesis）,相当于原材料新建血管增生来源于中胚层前体的内皮细胞原位分化、增殖形成初级毛细血管丛。血管重构初级毛细血管形成互相连接、分支众多、成熟的血管结构。,7,动脉生成（Arteriogenesis）,相当于休闲动脉的动员原有的侧支血管正常心脏冠脉间存在的交通吻合血管，直径20至200m ,呈薄壁样管状结构，通常状态下呈关闭状态。开放不仅仅是一个被动过程，开
4、放后会出现一系列细胞生长因子分泌、DNA合成和细胞增殖 等血管主动生长过程。,8,治疗性血管新生（Therapeutic Angiogenesis ）,手术搭桥（冠脉旁路血管移植术）药物搭桥（药物促进的治疗性血管新生）,通过药物、基因治疗或其他手段促进冠状动脉的血管新生，以达到改善心肌缺血症状和患者预后的目的。,9,治疗性血管新生的意义,增加供需失衡中的供给量,10,血管新生的研究方法和进展,11,筛选模型鸡胚绒毛尿囊膜实验,鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验 目前血管新生药物初步研究主要采用CAM 模型。CAM 作为一项研究体内血管效应的技术，实验材料易得、操作简便、实验周期短、结果易于观察，尤其
5、适用于大批量血管效应药物的初步筛选。,12,动物急性心肌缺血模型,兔、鼠选择性冠状动脉结扎、栓塞造成动物缺血模型，给予干预后观察梗死周边区血管新生情况。,大鼠心梗模型的制备,13,慢性心肌缺血模型,3周后左冠造影,狭窄明显、前向血流缓慢,14,血管内皮细胞培养,血管内皮细胞培养：因为人脐静脉(HUV) 在某些方面具有与动脉生物学特征相似的优点，较之动物血管内皮更符合人体情况。增殖：MTT比色法迁移：Transwell小室体外成血管：体外血管生成试剂盒分泌：培养液内NO、VEGF,人脐静脉内皮细胞培养,15,血管生长因子/抑制因子,干预因素对组织生长因子/抑制因子的影响生长因子：VEGF、 bF
6、GF，TGF、促血管生成素-1（Ang-1）抑制因子：血管新生抑制素、内皮细胞抑制素、组织金属蛋白酶抑制剂、血栓反应素-1，2 (thrombospodin-1&2，TSP-1&2)、血小板因子-4(PF-4)等,缺血心肌中的VEGF染色颗粒,16,促进治疗性血管新生的方法,促血管生长因子的应用干细胞移植药物干预,17,外源性输注生长因子,目前，研究最广泛的血管生成生长因子家族为VEGF和FGF。给急性心肌梗死动物冠脉内注射bFGF，心肌梗死的面积显著缩小，缺血或梗塞心肌内毛细血管及小动脉数目增加。 VEGF是一种内皮细胞特异性有丝分裂原和活体血管新生诱导物。VEGF因其对内皮细胞作用的特异性
7、而广泛应用于实验性肢体及心肌缺血的研究。,18,导入生长因子基因,近来病毒介导的基因转染已作为一种血管形成生长因子释放的方法应用于慢性缺血动物模型。 VEGF基因，PDGF基因 将含VEGFcDNA的真核表达载体pVS121吸附在球囊上，并定位转移至梗塞冠状动脉近心端。转染VEGF基因后心肌血管密度明显增加，有效促进了血管新生。,19,临床试验结果：并不理想,首次：冠脉内和静脉内灌注VEGF165蛋白，在60天的运动耐量、心肌灌注、心绞痛症状或功能分级等方面，治疗组并未获得显著性益处。 FGF血管重建临床试验(FIRST)：一次冠脉内灌注FGF-2，患者功能状况和症状分级显著改善，但90天后运
8、动耐量和心肌灌注与安慰剂相比没有差异VEGF、FGF的一系列双盲、随机的临床研究并没有成功的提出绝对清晰的治疗效果证据，与获临床承认仍有很大的差距。,20,骨髓干祖细胞移植,成人EPC和造血干细胞发生于共同的干细胞，都来源于造血器官骨髓。 有希望促进血管新生并改善心功能，为缺血性心脏病提供了一种新的治疗选择。用PCR法对人工血管内侧再内皮化细胞的基因进行分析，证实移植的骨髓细胞能参与内皮的形成。,21,胞外基质的研究,在血管新生过程中，内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成不但与促进/拮抗血管生成因子有关，而且也受基质降解蛋白酶和细胞间基质的调节。胞外基质的重建可能产生促或抗血管生成效应。蛋白酶类重塑
9、胞外基质可以促进细胞迁移，这是血管新生的重要条件。 胞外基质分子和胞外基质重塑事件在血管新生调节中扮演了一个关键角色。,22,Miranda D. Grounds, et al. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry 2002,50(5): 589610,干细胞移植,23,Nature/Vol428/3 April 2004/664-8,145例HSC移植入正常或者损伤的成年小鼠心脏的实验研究，没有发现由干细胞转分化而来的心肌，并且干细胞移植组相对于假移植组心肌细胞数量没有明显的增加，为心肌修复的临床研究提出了质疑。 心脏功能上的改善可能是
10、由于移植对左心室重塑的影响或者是产生了新生血管，而不是心肌再生。过去两年来，开展了一些使用骨髓祖细胞进行心脏修复临床试验。在目前研究中，HSC不能转化形成新的心肌，动摇了这些试验的理论基础。,造血干细胞（HSC）治疗的不足,24,干细胞治疗心肌梗死患者的临床试验,Circulation. 2006;114:353-358.,25,Is stem cell therapy for cardiac repair ready for patients?,26,作为一项新生事物，干细胞移植可能是治疗缺血性心脏病令人激动的新选择。尤其是那些有大面积心肌梗死患者，因其预后不佳，更有可能从细胞移植治疗中获益
11、。但迄今为止，临床试验结果相互矛盾，仍然处于实验性治疗阶段。,27,促进血管新生 中医药如何？,中医药益气活血、祛瘀生新等许多治疗法则以及临床的有效性，也为中医药血管新生的研究提供了理论和临床依据。,28,血管新生研究的中医药理论基础,“活血生肌”、“袪瘀生新”,创伤愈合不良、溃疡不愈、心肌缺血侧枝代偿不足等。,戴瑞鸿，冠心病心肌缺血的治疗性血管生成与中医药中国中西医结合杂志. 2000,20(3).-163-164,29,麝香保心丸的血管新生研究,30,中西医结合治疗冠心病的特色,“血”“脉”两条途径，整体治疗，体现中医药特色,中西医结合治疗心脑血管疾病,31,32,起效时间： 麝香保心丸和
12、硝酸甘油相似，最快30秒，一般在35分钟之内心电图有效率： 麝香保心丸和硝酸甘油无显著性差异副反应： 麝香保心丸的副反应明显低于硝酸甘油。,麝香保心丸与硝酸酯类疗效对比,33,保护血管内皮，抑制动脉粥样硬化,麝香保心丸能提高内源性一氧化氮合酶(eNOS)基因的表达，增强血管一氧化氮合酶(NOS)活力，以及抗炎、减少脂质浸润等途径保护血管内皮临床可见长期治疗后血管内皮功能改善，动脉粥样硬化程度减轻 与缓释单硝酸异山梨酯（DRIM）比较,反应性充血肱动脉内径明显增加,麝香保心丸组颈动脉IMT显著变薄,34,麝香保心丸的促血管新生作用,对血管生长因子的影响鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）试验大鼠缺血动物模型
13、临床研究（心肌核素显像)对肿瘤及斑块血管新生的影响对骨髓干细胞的动员对生长因子受体的影响（正在进行）尸检回顾性分析（正在进行）,35,体外细胞学实验麝香保心丸促进培养的牛肾上腺微血管内皮细胞增殖和形成管腔结构,（ 生理盐水对照组细胞 ）,（麝香保心丸组细胞）,麝香保心丸促进血管新生作用的证据,汪珊珊，李勇等。麝香保心丸对鸡胚绒毛尿囊膜及培养的血管内皮细胞的促血管生成作用，中国中西医结合杂志2003,23(2),36,麝香保心丸的促血管新生作用的证据,体外组织学实验：麝香保心丸能促进鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成作用,（加有生理盐水的CAM）,（加有麝香保心丸的CAM）,汪珊珊，李勇等。麝香保心丸对鸡
14、胚绒毛尿囊膜及培养的血管内皮细胞的促血管生成作用，中国中西医结合杂志2003,23(2),37,增加心肌梗塞大鼠心肌VEGF含量（免疫组化染色）,资料来源:麝香保心丸对实验性心肌梗塞大鼠心脏的促血管生成作用中成药 2002；24（6）：446-449,（生理盐水组）,（麝香保心丸组）,促进缺血心肌血管生长因子表达,38,1、2. 小、大剂量麝香保心丸 3. 贝复济与肝素联用组 4. 模型组 5. 假手术组 6 .正常组 7 .卡托普利组,在体研究：大鼠心肌梗死模型梗死边缘区,1 2 3 4 5 6 7麝小 麝大 bFGF M F N K,39,麝香保心丸对内皮祖细胞的影响,A为LSCM激发绿色
15、为结合FITC-UEA-I的EPCs；B为LSCM激发红色的为摄取DiI-Ac-LDL的EPCs；C为LSCM激发呈现橙色为FITC-UEA-I和摄取DiI-Ac-LDL的EPCs（C为正在鉴定的分化祖细胞）,梁春、吴宗贵等，中国中西医结合杂志，June2009,Vol.29,No.6,40,麝香保心丸对分化祖细胞的影响,与对照组比较，麝香保心丸1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml组可以增加EPCs增殖、迁移、粘附、及体外血管形成能力。,41,中药促血管新生作用的可能机制,研究发现麝香保心丸培养的人脐静脉内皮细胞释放 VEGF 和 bFGF 增加，VEGF与bFGF 的 mRNA表达增高。
16、麝香保心丸使血管生长抑制因子的减少。麝香保心丸提高内皮祖细胞（EPCs）迁徙、粘附和血管形成能力。,42,双向调节 对斑块血管新生的抑制,在同一动物双模型（同时有心肌缺血和动脉粥样斑块）发现：麝香保心丸促进缺血心肌血管新生麝香保心丸抑制斑块血管新生,43,对斑块内新生血管的影响,对照组斑块 麝香保心丸组斑块 CD34 免疫组化染色 CD34 免疫组化染色 250倍,CD34抗原是跨膜细胞糖蛋白，主要表达于人或鼠的造血干细胞和血管内皮细胞中，有学者认为CD34为细胞间黏附及信号传导提供了条件，促使内皮细胞分裂 、新生的细胞在CD34的参与下向血管外迁移黏附，构建成新生血管的骨架。,44,斑块内M
17、MP-3阳性面积比较，能抑制基质降解,对照组斑块 麝香保心丸组斑块 MMP-3 免疫组化染色 MMP-3 免疫组化染色 放大250倍,斑块内新生血管情况,45,斑块内的血管新生,研究证实：具有促进治疗性血管新生作用的中成药麝香保心丸，能特异性地抑制斑块内的血管生长，改变斑块内的基质变化，抑制基质降解，从而有利于斑块的稳定。,中国中西医结合杂志 2008.05.28;,46,麝香保心丸对裸鼠人LoVo结肠癌的影响,麝香保心丸对肿瘤组织血管生成因子（VFGF、bFGF）的影响,组别 n 肝转移数 瘤重（g） 抑瘤率（）模型组 10 10 0.670.10 0小剂量组 10 10 0.590.08
18、11.4中剂量组 10 9 0.510.11* 23.6大剂量组 10 9 0.490.08* 27.1,麝香保心丸对肿瘤生长和转移的影响,药学实践杂志 2007 ， 25（5）：295,47,结 论,临床常用的冠心病治疗药物中，麝香保心丸等有明确的促血管新生作用。中药促血管新生的机理复杂，可能涉及血管生长因子及其受体，以及血管抑制因子等多方面。对同时伴有的心梗范围受限、心室重构的改善和心功能的改善，血管新生可能是参予机理之一。双向调节：抑制斑块内血管新生和基质降解，稳定斑块；降低肿瘤微血管密度，减少肿瘤生长和转移。,48,麝香保心丸的血管新生研究,2002年，发现麝香保心丸对心肌梗塞大鼠的促
19、血管新生2003年，发现麝香保心丸促进CAM血管新生及血管内皮细胞管腔结构形成2004年，麝香保心丸促进血管新生研究结果发表于美国life science杂志2006年，麝香保心丸促进血管新生系列研究荣获中西医结合学会科学技术奖2007年，发现麝香保心丸的双向血管新生调节2008年，发现麝香保心丸对内皮祖细胞的动员作用,49,治疗各种类型的心绞痛Meta分析（25项）,50,麝香保心丸治疗后增加心肌灌注,总有效率 70.6%,罗海明，戴瑞鸿等。麝香保心丸改善心肌缺血作用的核心脏影像学研究，中国中西医结合杂志1996,16(6):325-5,心肌影像学实验SPECT,51,10例病人（CAG或O
20、MI），麝香保心丸长期治疗后对心肌灌注/代谢的改善,服药前PET心肌扫描 6月时PET心肌扫描,PET评价麝香保心丸对冠心病心肌血流的影响,52,心肌影像学实验PET,10例受试者共取得180个心肌节段作静息负荷和麝香保心丸治疗前后自身对照分析,相对冠脉血流储备分数治疗前后无显著差异，但治疗后似有可提高相对储备分数的趋势。(P0.077 ),相对血流密度分数,相对血流密度分数,53,临床研究,表11强化治疗组与常规治疗组给药方案,每丸22.5mg，每日含服3次。两组在治疗期间均不得使用其他抗缺血中药。药物由试验药品由上海和黄药业提供，生产批号G040603G060603。,上海市科委基金：中药
21、现代化专项课题04DZ19856资助,54,治疗稳定性心绞痛减少危险事件主要临床事件：心梗、心绞痛住院或急诊、卒中、心衰、心血管原因住院或急诊,*,55,治疗稳定性心绞痛减少危险事件总临床事件：主要临床事件其他原因住院或急诊,*,56,长期服用治疗稳定性心绞痛,*,57,麝香保心丸合并用药情况,200名冠心病稳定性心绞痛患者：硝酸酯类药物在治疗6个月时明显减少。,58,麝香保心丸治疗性血管新生作用小结,麝香保心丸具有明确的促血管新生的作用，且临床应用能取得良好的收益 促进治疗性血管新生通过对机体自身的生长因子及受体调节，促进缺血心肌血管新生治疗性血管新生的双向调节机制麝香保心丸促进缺血心肌血管
22、新生的同时，通过保护内皮、抑制炎症、改善缺氧等因素，抑制斑块内血管新生对冠心病的远期预后有改善作用，合并应用化学药物安全,59,麝香保心丸的系统生物学研究,60,系统生物学破解中药黑匣,需要知道中药复方的物质组成；这些物质组成在药物中是否稳定可控；进入人体的代谢情况如何；进入人体的多种物质成分在机体中发挥什么样的生物效应。对疾病的转归有何影响,中药复方“理论上”要解决的问题,系统研究中药复方的药效物质基础、配伍规律、广泛的药理及其作用机理，为打破长久以来困扰中医药研究的“黑匣”问题提供了契机。,61,明确了28个药物入血成分,代谢组学,麝香保心丸调节心梗时炎症反应、能量代谢、心肌肥大的代谢过程
23、,麝香保心丸对心梗相关功能基因/差异基因的影响,基因组学,血管新生关键促进因子/抑制因子研究,蛋白组学,冠心病治疗相关受体调控研究,麝香保心丸增效减毒机理研究,测定了蟾酥等药物组分的体内代谢,麝香保心丸系统生物学研究,专项名称： “重大新药创制”科技重大专项 麝香保心丸现代科学研究与技术创新 申报专题编号： 2008ZX09202,62,分离并鉴定95个化合物,现代分离技术与LC-MS快速分离鉴定,鉴定入血成分30个,血清药物化学,化学物质组学研究,Chromatography：2010,11(4):417-430Biomedical Chromatography：2011, 7(3): 82
24、4-831,复方化学成分研究,体内化学成分研究,麝香保心丸化学物质组学研究,1- hydroxyl-cinobufagin,nicotinamide,adenine,63,麝香保心丸中的组效关系研究,体现了君臣佐使配伍，减毒增效，整合调节特点,64,麝香保心丸机制研究 -基因组学研究,进一步筛选得到34个共性差异基因。其中14个基因在麝香保心丸组和心肌缺血组中呈现表达量相反的结果。可见麝香保心丸对这14个基因的作用明显（逆向表达）。这些基因主要与心肌能量代谢相关。,65,麝香保心丸差异基因涉及的信号通路分析,麝香保心丸作用后的差异基因涉及能量代谢、整联蛋白、催化活性、氧化应激、肌动蛋白、激肽原
25、酶激活、胰岛素生长因子，而这些靶点多为心血管疾病中的重要分子机制。,66,1.Tpm1基因（原肌球蛋白家族，可以阻止心脏突发死亡）,重点差异基因Real-time PCR 分析,麝香保心丸组,阳性药组,模型组中，Tpm1基因表达明显增加，麝香保心丸干预后其表达恢复正常，使Tpm1对心肌收缩的调节恢复正常，保护心脏收缩功能；结合病理形态可知麝香保心丸对心脏的恢复及保护作用更强。,67,Fndc1和 Fn1基因 （纤维连接蛋白家族，与心脏组织纤维化呈正相关）,麝香保心丸干预后， Fndc1基因表达显著下调，纤维化减轻，推测麝香保心丸具有抑制缺血心肌纤维化的作用 。,麝香保心丸干预后Fn1基因表达上
26、调至正常水平麝香保心丸对心肌缺血后纤维化过程具有抑制或逆转的作用。,Fndc1结果,Fn1结果,68,血液代谢组学评价-心梗后治疗,术后5h,术后15d,3-15d动态变化,体内调控途径：a：减少类固醇生成，抑制心肌细胞的肥大，促进心肌功能的恢复 b：调控糖酵解过程，恢复能量代谢所需能量的正常供应 c：抑制花生四烯酸代谢通路，减轻心肌梗死后的炎症反应,麝香保心丸代谢组学评价,69,麝香保心丸组,模型组,正常组,从图中可以看出尽管麝香保心丸组没有回调至正常状态，但仍然和模型组有明显改变，并且向正常组偏移。可以看出麝香保心丸组对心肌梗死有预保护作用。,麝香保心丸代谢组学评价,血液代谢组学评价-心梗
27、预保护,麝香保心丸组,70,尿液代谢组学评价,术后15d,3-15d动态变化,麝香保心丸对心肌梗死大鼠体内异常代谢物的回调作用明显,Mol BioSyst：2011, 7(3): 824-831,麝香保心丸代谢组学评价,71,IF = 4.015,麝香保心丸主要通过调控能量代谢途径，抑制心肌肥大及氧化损伤来多途径治疗心肌梗死引起的危害，其中以恢复三羧酸循环相关能量代谢通路为主要手段。,72,麝香保心丸代谢组学总结,Aldosterone,Corticosterone,Cortisol,Epinephrine,Creatine,Uridine,Glutamate,Oxalosuccinic ac
28、id,LTA4,Deoxyinosine,Glycerate,Thymidine,Deoxycorticosterone,抑制心肌肥大,纠正能量代谢紊乱,减轻炎症反应,调控代谢物,作用效应,下调,上调,代谢组学得分图充分的反映了麝香保心丸的正向干预效果。在血液的15个标志物中5个（心肌肥大，炎症）可以被麝香保心丸逆转；在尿液的16个生物标志物中5个（能量代谢相关）可以被其逆转。从血液和尿液的3-15天动态代谢图谱中可以看出，麝香保心丸在心肌梗死的长期治疗中有着很好的调控作用，有时间依赖作用。SX通过改善心肌能量代谢，提高心肌能量利用程度，从而减少心肌细胞凋亡，延缓心肌梗死进展,73,麝香保心丸
29、系统生物学研究意义,揭示了麝香保心丸组方干预心肌缺血作用的药效物质群与作用机理； 证实其治疗冠心病、心绞痛是多个有效成分通过多环节、多靶点起作用； 为麝香保心丸临床疗效与安全性评价提供了重要基础；,74,谢 谢！,75,冠脉血流储备分数（一）,冠脉造影及血管内超声均被认为是诊断冠脉病的“金标准”，但仅是对病变狭窄程度进行影像学评价，不能评价对远端血流产生多大的影响，及是否会导致心肌的缺血，引起症状。一种新技术冠脉血流储备分数（FFR），为评价心肌缺血提供了一种良好方法。,76,冠脉血流储备分数（三）,FFR最有应用价值之处在于对中等度狭窄病变的评价，非侵入性检查无心肌缺血证据时决定是否行血管成型术，以及造影位置不清晰时确定病变的位置等。应用FFR指导介入治疗可以减少支架的置入，减低医疗费用。在2010年最新的欧洲心脏病学会（ESC）指南中，首次把FFR提升到最高的Ia级别推荐。,
