1、第六章微生物的遗传和变异,主要内容：,核酸的基本化学组成与结构微生物的遗传微生物的变异基因重组遗传工程技术,1868年，F. Miescher从细胞核中分离得到一种酸性物质，即现在被称为核酸的物质。,第一节 核酸的基本化学组成与结构,核酸,核苷酸,核苷,磷酸,碱基,戊糖,元素组成： C H O N P,核酸完全水解产生嘌呤和嘧啶等碱性物质、戊糖（核糖或脱氧核糖）和磷酸的混合物。核酸部分水解则产生核苷和核苷酸。每个核苷分子含一分子碱基和一分子戊糖，一分子核苷酸部分水解后除产生核苷外，还有一分子磷酸。核酸的各种水解产物可用层析或电泳等方法分离鉴定。,组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为 -D-2
2、-脱氧核糖；RNA所含的糖则为-D-核糖。,一、戊糖,二、碱基,1. 嘌呤（Purine）,2. 嘧啶（Pyrimidine）,核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。,三、核苷（nucleoside）,核苷 戊糖+碱基 糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键,假尿苷（）次黄苷（肌苷）I黄嘌呤核苷 X二氢尿嘧啶核苷 D取代核苷的表示方式7-甲基鸟苷 m5G,Adenosine Guanosine Cytidine Uridine,四、核苷酸（nucleotide） 核苷酸 核苷+磷酸 戊糖+碱基+磷酸,五、核苷酸衍生物,1. 继续磷酸化,2.环化磷
3、酸化,cAMP,cGMP,3. 肌苷酸及鸟苷酸(强力味精),4. 辅酶 NAD、NADP、FMN,IMP GMP,六、多聚核苷酸（核酸）,多聚核苷酸是通过一个核苷酸的C3-OH 与另一分子核苷酸的5-磷酸基形成3,5-磷酸二酯键相连而成的链状聚合物。,5-磷酸端（常用5-P表示）；3-羟基端（常用3-OH表示）多聚核苷酸链具有方向性，当表示一个多聚核苷酸链时，必须注明它的方向是53或是35。,多聚核苷酸的表示方式,DNA RNA,5PdAPdCPdGPdTOH 3 5PAPCPGPUOH 或5ACGTGCGT 3 5ACGUAUGU 3 ACGTGCGT ACGUAUGU,98核中（染色体中）
4、 真核 线粒体（mDNA） 核外 叶绿体（ctDNA）DNA 拟核 原核 核外：质粒（plasmid） 病毒：DNA病毒,核酸分为两大类： 脱氧核糖核酸 Deoxyribonucleic Acid （DNA） 核糖核酸 Ribonucleic Acid（RNA）,RNA主要存在于细胞质中,转运RNA ( tRNA) t-RNA约占细胞总RNA的1015，也称之为“受体RNA”。核糖体RNA （ rRNA） r-RNA约占细胞总RNA的80，是核糖体的核酸。 信使RNA （mRNA） m-RNA约占细胞总RNA的5左右，为单链结构，不同细胞的m-RNA的链长和分子量的差异很大。,第二节 微生物的
5、遗传,遗传和变异的物质基础DNA,40年代发现了生物的遗传物质是DNA 1928年Griffith经典的转化实验； 1941年Avery的转化补充实验； 1952年Hersey何Chase大肠杆菌T2噬菌体感染大肠杆菌试验； 证明DNA是生物的遗传物质基础。, DNA的结构与复制,50年代弄清了DNA的双螺旋结构,1953年Watson和Crick建立了DNA的双螺旋结构模型1957年诺贝尔生理学奖。, DNA的结构,（Francis Crick,1916-2004)（右）和沃森(James Watson,1928-),DNA双螺旋结构,DNA双螺旋结构的特点,DNA分子由两条DNA单链组成。
6、DNA的双螺旋结构是分子中两条DNA单链之间基团相互识别和作用的结果。双螺旋结构是DNA二级结构的最基本形式。,三股螺旋结构的DNA,DNA的存在形式,基因遗传因子 基因：是一切生物体内储存遗传信息的、有自我复制能力的遗传功能单位。它是DNA分子上一个具有特定碱基顺序、即核苷酸序列的片断。 基因按功能分三种： 结构基因 操纵基因 调节基因,60年该确定了遗传信息的传递方式,1961年J.Monod和F.Jacob提出了操纵子学说；,遗传信息的传递,1966年Nireberg破译了遗传密码，叙述了中心法则；,基因工程的诞生理论上的三大发现,DNA的复制,DNA的变性和复性DNA变性,DNA复性,
7、变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性。DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复。DNA复性的程度、速率与复性过程的条件有关。将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。但是将变性的DNA缓慢冷却时，可以复性。分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。此外，DNA的复性也与它本身的组成和结构有关。,DNA复性, RNA RNA一级结构的特点,tRNA一级结构tRNA分子具有以下特点：分子量25000左右，大约由7090个核苷酸组成，沉降系数为4S左右。分子中含有较多的修饰成分。3-末端都具有CpCpAOH的
8、结构。,mRNA一级结构,真核细胞mRNA的3-末端有一段长达200个核苷酸左右的聚腺苷酸(polyA)，称为 “尾结构” ，5 -末端有一个甲基化的鸟苷酸，称为” 帽结构“ 。,rRNA,动物细胞核糖体rRNA有四类：5SrRNA，5.8SrRNA，18SrRNA，28SRNA。许多rRNA的一级结构及由一级结构推导 出来的二级结构都已阐明，但是对许多rRNA的功能迄今仍不十分清楚。,tRNA的高级结构,1，tRNA的二级结构tRNA的二级结构都呈” 三叶草” 形状，在结构上具有某些共同之处，一般可将其分为五臂四环：包括氨基酸接受区、反密码区、二氢尿嘧啶区、TC区和可变区。除了氨基酸接受区外
9、，其余每个区均含有一个突环和一个臂。,2,tRNA的三级结构,在三叶草型二级结构的基础上，突环上未配对的碱基由于整个分子的扭曲而配成对，目前已知的tRNA的三级结构均为倒L型,转录,微生物生长与蛋白质合成,RNA与生物遗传信息的表达-蛋白质合成,首先，DNA通过转录作用，将其所携带的遗传信息（基因）传递给 mRNA, 在三种 RNA（mRNA、tRNA和rRNA）的共同作用下，完成蛋白质的合成。,转录过程,翻译过程,现在已经知道作为多肽合成起始信号的密码子有两个，即甲硫氨酸的密码子(AUG)和氨酸的密码子(GUG)(极少出现)。在大肠杆菌中, 起始密码子AUG 所编码的氨基酸并不是甲硫氨酸本身
10、, 而是甲酰甲硫氨酸。,第三节 微生物的变异,变异的实质基因突变,基因突变,上述DNA碱基顺序的改变，是DNA在复制过程中出现错误产生的。由于DNA是具有复制功能的分子，一旦DNA碱基顺序出错，它就会通过复制机制遗传下去。由于DNA碱基顺序的改变引起生物遗传性状显著变化的现象，称为基因“突变”。,突变的类型,自发突变 多因素低剂量的诱变效应 互变异构效应诱发突变 物理诱变 化学诱变 复合处理及其协同效应 定向培育和驯化,(1) DNA分子中碱基互变异构,DNA分子的碱基，存在酮式烯醇式或氨式亚胺式互变异构。不同的互变异构体形成氢键的方向和能力不同，有可能导致复制时出现错误。例如在正常情况下，A
11、（氨式结构）与T（酮式结构）配对；当A以亚胺式存在时（几率非常小），则与C配对。,(2) 物理因素,能够引起基因突变的物理因素主要包括：紫外线（UV）、高能射线和电离辐射等。,当DNA受到大剂量紫外线（波长260nm附近）照射时，可引起DNA链上相邻的两个嘧啶碱基共价聚合，形成二聚体，例如TT二聚体。,光聚合反应,胸腺嘧啶碱基在紫外光照射下，可以发生二聚加成反应： 在DNA分子中，如果两个胸腺嘧啶碱基相邻，在紫外光照射下，可能发生上述聚合反应，其结果是破坏了正常复制或转录。,X-射线以及放射性物质产生的辐射具有很高的能量，能直接引起DNA物理或化学性质的改变。另外，电离辐射将也能使DNA周围环
12、绕的其它分子（主要是水）产生具有很高活性的自由基，这些自由基能够进一步与DNA分子反应，导致DNA结构发生变化。,(3) 化学因素,化学因素是引起DNA结构发生变化的最常见因素，主要包括：烷基化试剂，亚硝酸盐以及碱基类似物等。烷基化试剂能够与DNA分子中的氨基或氧作用，生成烷基化DNA。除了碱基上有多个位置可被烷基化外，DNA链上磷酸二酯键中的氧也容易被烷基化，从而导致DNA链的断裂。,烷基化反应,由于含氧碱基存在酮式和烯醇式的互变异构，烯醇式中的羟基可以被烷基化转变为稳定的烯醇醚。鸟嘌呤核苷烷基化形成6-甲氧基鸟嘌呤核苷后，不再与C配对，而与T配对。这种情况将引起DNA的复制、转录及信息表达
13、出现错误。,环外氨基的反应,环外氨基在适当条件下，也可以发生化学反应。胞嘧啶核苷在亚硝酸作用下，可以形成重氮盐，再转变为尿嘧啶核苷。因此生物体内亚硝酸的存在有可能改变DNA的碱基组成。腺嘌呤核苷和鸟嘌呤核苷也能发生类似的反应，分别形成次黄嘌呤核苷（I）和黄嘌呤核苷（X）。这种变化，将影响或改变碱基形成氢键的能力和方向，导致DNA复制错误，是引起基因突变的重要原因之一。,碱基类似物是一类结构与核酸碱基相似的人工合成或天然化合物，由于它们的结构与核酸的碱基相似，当这些物质进入细胞后能够掺入到DNA链中，干扰DNA的正常复制和转录。常见的有碱基衍生物及稠环、稠杂环类化合物。例如5-溴尿嘧啶（5-BU
14、），它与胸腺嘧啶碱基的结构相似，能取代T与A配对。又如一种称为二恶英的含氯芳香杂三环化合物（2,3,7,8-四氯-二苯-二恶英，简称TCDD），是一种具有强烈致癌和致畸物质。它能够进入细胞并与DNA结合，导致DNA复制发生错误，从而可能诱发癌变。,2. DNA损伤修复,光复活切除修复重组修复SOS修复,光复活（photoreactivation）,可见光（最有效波长400nm）激活生物界广泛分布（高等哺乳动物除外）的光复活酶，该酶分解嘧啶二聚体。是一种高度专一的修复形式，只分解由于UV照射而形成的嘧啶二聚体。,切除修复（excision repair）,即在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损
15、伤的部分切除掉，并以完整的那一段为模板，合成出切去的部分，从而使DNA恢复正常。这是一种比较普遍的修复机制。细胞的修复功能对于保护遗传物质DNA不受破坏有重要意义。,重组修复（recombination repair）,又称复制后修复（postreplication repair）受损伤的DNA在进行复制时，跳过损伤部位，在子代DNA链与损伤相对应部位出现缺口。通过分子间重组，从完整的母链上将相应的碱基顺序片段移至子链的缺口处，然后再用合成的多核苷酸来补上母链的空缺，此过程即重复修复。并非完全校正。,SOS修复,指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能
16、维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，又称倾错性修复（Error-Prone Repair ）。,第三节 基因重组,杂交： 是通过双亲细胞的融合，使整套染色体的基因重组，或者是通过双亲细胞的沟通，使部分染色体基因重组。转化： 受体细胞直接吸收来自供体细胞得DNA片断，并把它整合到自己的基因组里，从而获得了供体细胞部分遗传性状的现象。,通过温和噬菌体的媒介作用，把供体细胞内特定的基因（DNA片断）携带至受体细胞中，使后者获得前者部分遗传性状的现象。,转导,第四节 遗传工程技术在环境工程中的应用,遗传工程技术在环境工程中的应用,质粒育种: 将两种或多种微生物通过细胞结合或融合技术
17、，使供体菌的质粒转移到受体内，使受体菌保留自身功能质粒，同时获得供体菌的功能质粒，即培育出具有两种功能质粒的新品种。 多功能超级细菌的构建； 工程菌的构建；,改变细胞内的关键酶或酶系统：随着工业发展，大量的合成有机化合物进入环境，其中很大部分难于生物降解或降解缓慢，只是在环境中的停留时间长达数年至数十年。基因工程为该改变细胞内的关键酶或酶系统提供了可能，从而可以：提高微生物的降解速率；拓宽底物的专一性范围；维持低浓度下的代谢活性；改善有机污染物降解过程中的生物催化稳定性；,设计复合代谢途径； 2，4，6-三硝基甲苯（TNT）； 假单胞菌可以利用TNT为唯一碳源，但不能利用甲苯； 将具有甲苯完整
18、降解途径的TOL质粒pWO-Km导入该微生物，可以扩展微生物的代谢能力，构建的新微生物可以是TNT完全降解。,拓宽氧化酶的专一性； 三氯乙烯(TCE)某些氧化酶可以进攻该分子，但氧化速率低；甲苯双氧化酶对TCE具有部分活性，但催化过程中易失活；而联苯双氧化酶不能氧化，而基因工程构建的杂和联苯双氧化酶体系可以氧化TCE，且其氧化速度为天然甲苯双合氧化酶的3倍；且稳定性更好，在环境污染物降解方面有大作为。,增强无机磷的去除： 活性污泥只能去除城市废水中20%-40%无机磷， 有些细菌能够以聚磷酸盐形式过量积累磷，通过对E.coli polyP激酶基因ppK和再生ATP乙酸激酶基因ackA进行扩增，
19、可以有效的提高E.coli对无机磷的去除能力2-3倍，4h将0.5mol/L的磷酸盐去除约90%。 此结果显示，通过基因工程改进酶的活性，在无机污染物如磷的处理方面也大有潜力。,基因工程技术,技术上的三大发明：工具酶 1970年Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离并纯化了限制性核酸内切酶Hind，使DNA分子的切割成为可能。 1967年世界上5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶，使DNA裂口的修复成为可能。, 载体 大多数DNA片断不具备自我复制的能力，为了使它们能够在宿主细胞中进行繁殖，必须将DNA片断接到一种特定的，具有自我复制能力的DNA分子上，这种DNA分子就是基因工程载体（v
20、ector）。 可作为基因载体的有： 病毒；噬菌体；质粒等不同小分子量的复制子。 最常用的是抗药性R因子质粒分子pBR322和pUC13。,逆转录酶 1970年Baltimore等人同时发现了逆转录酶，打破了中心法则，使真核基因的制备成为可能。 具备了以上的理论和技术基础，基因工程诞生的条件已经成熟。 1972年斯坦福大学的P.Berg等人在世界上第一次实现了DNA体外重组。 猿猴病毒SV40DNA+噬菌体DNA-重组DNA分子； 1973年斯坦福大学地S.Cohen成功地进行了另一个体外重组DNA实验并成功地实现了细菌间性状的转移。 大肠杆菌抗四环素质粒pSC101+抗新霉素质粒R6-3 -重组DNA分子-大肠杆菌（筛选出了抗四环素和抗新霉素的重组菌落 基因工程从此诞生了。,基因工程的内容,带有目的基因的DNA片断的获取；在体外将目的基因片断连接到载体分子上，形成重组分子；重组分子导入受体细胞；带有重组DNA分子的细胞扩增，获得大量的细胞繁殖群体;重组体的筛选；外源基因表达产物的分离与提纯；,PCR技术在环境工程中的应用,
