1、实验一 细菌的简单染色法和革兰氏染色法一、目的要求1. 学习微生物涂片、染色的基本技术，并掌握革兰氏染色的方法。2. 初步认识细菌的形态特征，掌握无菌操作技术。3. 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。二、基本原理1. 简单染色法：用单一染料进行细菌染色，操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观察。常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱碱性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下易于识别
2、。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。2. 革兰氏染色法革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是 1884 年由丹麦医生Gram 创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态特征而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏染色阴性细菌，用 G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫碘复合物被保留在细胞
3、内而不易着色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（ decolorising agent）和复染液 (counterstain) 。碱性染料的作用象在细菌的简单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫(crystal violet)。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和力或附着力，即以某种方式帮助
4、染料固定在细胞上，使不易脱落，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用 95的酒精(ethanol)。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成 G+和 G-两大类群，常用的复染液是番红。三、器材大肠杆菌(Escherichia coli)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，枯草芽孢杆菌( Bacillus subtilis)，藤黄微球菌(Micrococcus luteus)，蜡样芽孢杆菌( B. cereus)1220h 斜面培养物；革
5、兰氏染液，载玻片，显微镜等。四、操作步骤1. 涂片 取两块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接种环以无菌操作分别从培养 1416h 的枯草芽孢杆菌和培养 24h 的大肠杆菌的斜面上挑取少量菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。载玻片要洁净无油迹；滴蒸馏水和取菌不宜过多；涂片要均匀，不宜过厚。2. 干燥 室温自然干燥。3. 固定 固定时通过火焰 23 次即可。此过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。热固定温度不易过高，以载玻片背面不烫手为宜，否则会改变甚至破坏细胞形态。4. 染色（1）简单染色法： 染色 滴加染液于涂片上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)。吕氏碱性美
6、蓝染色 12min；石炭酸复红或草酸铵结晶紫染色约 1min。 水洗 倾去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。水洗时，不要直接冲洗液面，而应使水从载玻片的一段流下，水流不易过急过大，以免涂片薄膜脱落。 干燥 自然干燥或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。 镜检 涂片干燥后镜检。（2）革兰氏染色法： 初染 加草酸铵结晶紫一滴，约 12min，水洗。 媒染 滴加碘液冲去残水，并覆盖约 1min，水洗。 脱色 将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用 95酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现蓝色时为止，约 2030s，立即用水冲净酒精。 复染 用番红液染 12min，水洗。 镜检 干燥后，置油镜下观察
7、。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。(3) 混合涂片法：按上述方法，在同一玻片上，以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌或金黄色葡萄球菌混合涂片、染色、镜检进行比较。革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。实验二 细菌的芽孢和荚膜染色法一、实验目的1. 学习并掌握芽孢和荚膜染色法2. 初步了解芽孢和荚膜的形态。二、基本原理芽孢又叫内生孢子(endosopre)，是某些细
8、菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，因此，当先用弱碱性染料，如孔雀绿（malachite green）或碱性品红（basic fuchsin）在加热条件下进行染色时，此染料不仅可进入菌体，而且也可进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液（如番红液）或衬托溶液（如黑色素溶液）处理，则菌体和芽孢
9、易于区分。荚膜是包围在细菌细胞外面的一层粘液性物质，其主要成分是多糖类，不易染色，故常用衬托染色法，即将菌体和背景着色，而把不着色且透明的荚膜衬托出来。荚膜很薄，易变形，因此，制片时一般不用热固定。三、器材枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），腊样芽孢杆菌（B. cereus），球形芽孢杆菌( B. sphaericus)，生孢梭菌（Clostridium sporogenes）；圆褐固氮菌（Azotobacter chroococcum）或胶质芽孢杆菌(B. mucilaginosus )约 2d 无氮培养基琼脂斜面培养物；孔雀绿染液，番红水溶液，苯酚品红溶液，黑色素溶液。荚膜
10、染色液：绘图墨水，1甲基紫水溶液，1结晶紫水溶液，6葡萄糖水溶液，20硫酸铜水溶液，纯甲醇等。四、操作步骤（一）荚膜染色技术方法一：（1）将培养 24h 左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆菌，作涂片、干燥、固定。（2）滴加 35 滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。（3）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液。加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约 45min。这一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液染 10min。（4）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再退色为止。（5）用番红水溶液复染 1min，水洗。（6）待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。
11、方法二：（1）取两支洁净的小试管，分别加入 0.2mL 无菌水，再往一管中加入 23接种环的腊样芽孢杆菌的菌苔，另一管中加入 23 接种环的生孢梭菌的菌苔，两管中各自充分混合成浓厚的菌悬液。（2）在 菌 悬 液 中 分 别 加 入 0.2mL 苯 酚 品 红 溶 液 ， 充 分 混 合 后 ， 于 沸 水 浴 中 加 热35min。（3）用接种环分别取上述混合液 23 环于两载玻片上，涂薄，风干后，将载玻片稍倾斜于烧杯上，用 95乙醇冲洗至无红色液流出。（4）再用自来水冲洗，滤纸吸干。（5）取 12 接种环黑色素溶液于涂片处，立即展开涂薄，自然风干后，油镜观察，在淡紫色背景的衬托下，菌体为白色
12、，菌体内的芽孢为红色。（二）荚膜染色技术1. 湿墨水法（1）制 备 菌 和 墨 水 混 合 液 加 一 滴 水 于 洁 净 的 载 玻 片 上 ， 然 后 挑 取 少 量 菌 体 与其 混 合 均 匀 。（2）加盖玻片 将一洁净的盖玻片盖在混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，轻轻按压以吸去多余的混合液。（3）镜检 用低倍镜和高倍镜观察，若用相差显微镜观察，效果更好。背景灰色，菌体较暗，在菌体周围呈现明亮的透明圈即为荚膜。2. 干墨水法（1）在载玻片一端滴一滴 6葡萄糖水溶液，取少许培养了 72h 的圆褐固氮菌在水滴中制成菌悬液，充分混匀。（2）取一滴新配好的黑色素溶液（也可用绘图墨水）与菌悬液
13、混合，另取一块载玻片作为推片，将推片一端平整的边缘与菌悬液以 30角接触后，顺势将菌悬液推向前方，使其成匀薄的一层，风干。（3）用纯甲醇固定 1min。（4）加番红液数滴于涂片上，冲去残余的甲醇，并染 30s，以细水流适当冲洗，吸干后油镜检查，背景黑色，荚膜无色，细胞红色。3. Anthony 法（1）涂片 按常规取菌涂片。（2）固定 空气中自然干燥。不可加热干燥固定。（3）染色 用 1结晶紫水溶液染色 2min。（4）脱色 以 20硫酸铜水溶液冲洗，用吸水纸吸干残液。（5）镜检 干后用油镜观察菌体染成深紫色，菌体周围的荚膜呈淡紫色。实 验 三 鞭 毛 染 色 法 及 活 细 菌 运 动 性
14、的 观 察一 、 目 的 要 求1. 学 习 并 初 步 掌 握 鞭 毛 染 色 法 ， 观 察 细 菌 鞭 毛 的 形 态 特 征 。2. 学 习 用 压 滴 法 和 悬 滴 法 观 察 细 菌 的 运 动 性 。二 、 基 本 原 理鞭 毛 是 细 菌 的 运 动 “器 官 ”， 细 菌 是 否 具 有 鞭 毛 ， 以 及 鞭 毛 着 生 的 位 置 和 数 目 是 细菌 的 一 项 这 要 形 态 特 征 。 细 菌 的 鞭 毛 很 纤 细 ， 其 直 径 通 常 为0.01 0.02m， 所 以 ， 除 了 很 少数 能 形 成 鞭 毛 束 (由 许 多 根 鞭 毛 构 成 )的 细
15、菌 可 以 用 相 差 显 微 镜 直 接 观 察 到 鞭 毛 束 的 存 在 外 ，一 般 细 菌 的 鞭 毛 均 不 能 用 光 学 显 微 镜 直 接 观 察 到 ， 而 只 能 用 电 子 显 微 镜 观 察 。 要 用 普通 光 学 显 微 镜 观 察 细 菌 的 鞭 毛 ， 必 须 用 鞭 毛 染 色 法 。鞭 毛 染 色 的 基 本 原 理 ， 是 在 染 色 前 先 用 媒 染 剂 处 理 ， 使 它 沉 积 在 鞭 毛 上 ， 使 鞭 毛直 径 加 粗 ， 然 后 再 进 行 染 色 。 鞭 毛 染 色 方 法 很 多 ， 本 实 验 介 绍 硝 酸 银 染 色 法 和 改
16、良 的Leifson氏 染 色 法 ， 前 一 种 方 法 更 容 易 掌 握 ， 但 染 色 剂 配 制 后 保 存 期 较 短 。在 显 微 镜 下 观 察 细 菌 的 运 动 性 ， 也 可 以 初 步 判 断 细 菌 是 否 有 鞭 毛 。 细 菌 运 动 性 的观 察 可 用 压 滴 法 和 悬 滴 法 。 观 察 时 ， 要 适 当 减 弱 光 强 度 以 增 强 反 差 ， 若 光 线 太 强 ， 细菌 和 周 围 的 液 体 难 以 区 分 。三 、 器 材苏 云 金 芽 孢 杆 菌 (Bacillus thuringiengsis)， 假 单 胞 菌 (Pseudomonas
17、 sp.)， 金 黄 色 葡 萄 球 菌 ；硝 酸 银 鞭 毛 染 色 液 ， Leifson 氏 染 色 液 ， 0.01 美 蓝 水 溶 液 ； 载 玻 片 ， 盖 玻 片 ， 凹 载 玻 片 ，无 菌 水 ， 凡 士 林 ， 显 微 镜 等 。四 、 操 作 步 骤（ 一 ） 鞭 毛 染 色 技 术1. 硝 酸 银 染 色 法（ 1） 菌 种 的 准 备 要 求 用 活 跃 生 长 期 菌 种 作 鞭 毛 染 色 和 运 动 性 的 观 察 。 对 于 冰 箱 保存 的 菌 种 ， 通 常 要 连 续 移 种 12 次 ， 然 后 可 选 用 下 列 方 法 接 种 培 养 作 染 色
18、用 菌 种 ：a.取 新 配 制的 营 养 琼 脂 斜 面 (表 面 较 湿 润 、 基 部 有 冷 凝 水)接 种 ， 2832 培 养 1830h， 让 菌 种 扩 散 生 长 ，取 菌 落 边 缘 的 菌 苔 (不 要 取 菌 落 中 央 的 菌 苔 )作 染 色 观 察 的 菌 种 材 料 。良 好 的 培 养 物 ， 是 鞭 毛 染 色 成 功 的 基 本 条 件 ， 不 宜 用 已 形 成 芽 孢 或 衰 亡 期 培 养 物作 鞭 毛 染 色 的 菌 种 材 料 ， 因 为 老 龄 细 菌 鞭 毛 容 易 脱 落 。（ 2） 载 玻 片 的 准 备 将 载 玻 片 在 含 适 量
19、洗 衣 粉 的 水 中 煮 约20min， 取 出 用 清 水 充 分 洗 净 ，沥 干 后 置 95 乙 醇 中 ， 用 时 取 出 在 火 焰 上 烧 去 酒 精 及 可 能 残 留 的 油 迹 。玻 片 要 求 光 滑 、 洁 净 ， 尤 其 忌 用 带 油 迹 的 玻 片 （ 将 水 滴 在 玻 片 上 ， 无 油 迹 玻 片 水 能均 匀 散 开 ）（ 3） 菌 液 的 制 备 取 斜 面 或 平 板 菌 种 培 养 物 数 环 于 盛 有12mL 无 菌 水 的 试 管 中 ， 制 成轻 度 混 浊 的 菌 悬 液 用 于 制 片 。 也 可 用 培 养 物 直 接 制 片 ， 但
20、 效 果 往 往 不 如 先 制 备 菌 液 。挑 菌 时 ， 尽 可 能 不 带 培 养 基 。（ 4） 制 片 取 一 滴 菌 液 于 载 玻 片 上 的 一 端 ， 然 后 将 玻 片 倾 斜 ， 使 菌 液 缓 缓 流 向 另一 端 ， 用 吸 水 纸 吸 去 玻 片 下 端 多 余 菌 液 ， 室 温 （ 或37 ） 自 然 干 燥 。干 后 应 尽 快 染 色 ， 不 宜 放 置 时 间 过 长 。（ 5） 染 色 涂 片 干 燥 后 ， 滴 加 硝 酸 银 染 色A 液 覆 盖 3-5min， 用 蒸 馏 水 充 分 洗 去 A 液 。用 B 液 冲 去 残 水 后 ， 再 加
21、B 液 覆 盖 涂 片 染 色 约 数 秒 至 1min， 当 涂 面 出 现 明 显 褐 色 时 ， 立 即用 蒸 馏 水 冲 洗 。 若 加 B 液 后 显 色 较 慢 ， 可 用 微 火 加 热 ， 直 至 显 褐 色 时 立 即 水 洗 。 自 然 干 燥 。配 制 合 格 的 染 色 剂 （ 尤 其 是 B 液 ） 、 充 分 洗 去 A 液 再 加 B 液 、 掌 握 好 B 液 的 染 色 时 间 均是 鞭 毛 染 色 成 败 的 重 要 环 节 。（ 6） 镜 检 干 后 用 油 镜 观 察 。 观 察 时 ， 可 从 玻 片 的 一 端 逐 渐 移 至 另 一 端 ， 有 时
22、 只在 涂 片 的 一 定 部 位 观 察 到 鞭 毛 。菌 体 呈 深 褐 色 ， 鞭 毛 显 褐 色 、 通 常 呈 波 浪 形 。2. 改 良 的 Leifson 氏 染 色 法（ 1） 载 玻 片 的 准 备 、 菌 种 材 料 的 准 备 用 硝 酸 银 染 色 法 。（ 2） 制 片 用 记 号 笔 在 载 玻 片 反 面 将 玻 片 分 成3-4 个 等 分 区 ， 在 每 一 小 区 的 一 端 放 一小 滴 菌 液 。 将 玻 片 倾 斜 ， 让 菌 液 流 到 小 区 的 另 一 端 ， 用 滤 纸 吸 去 多 余 的 菌 液 。 室 温 或37 自然 干 燥 。（ 3）
23、染 色 加 Leifson 氏 染 色 液 覆 盖 第 一 区 的 涂 面 ， 隔 数min 后 ， 加 染 液 于 第 二 涂 面 ，如 此 继 续 染 第 三 、 四 区 。 间 隔 时 间 自 行 议 定 ， 其 目 的 是 为 了 确 定 最 佳 染 色 时 间 。 在 染色 过 程 中 仔 细 观 察 ， 当 整 个 玻 片 都 出 现 铁 锈 色 沉 淀 、 染 料 表 面 现 出 金 色 膜 时 ， 即 直 接用 水 轻 轻 冲 洗 （ 不 要 先 倾 去 染 料 再 冲 洗 ， 否 则 背 景 不 清 ） 。 染 色 时 间 大 约10min。 自 然 干 燥 。（ 4） 镜
24、检 干 后 用 油 镜 观 察 。菌 体 和 鞭 毛 均 呈 红 色 。（ 二 ） 运 动 性 观 察玻 片 的 准 备 、 菌 种 材 料 的 准 备 同 鞭 毛 染 色 法 。1. 压 滴 法（ 1） 制 片 在 洁 净 载 玻 片 上 加 一 滴 无 菌 水 ， 挑 取 一 环 菌 液 与 水 混 合 ， 再 加 一 环0.01 的美 蓝 水 溶 液 与 其 混 合 均 匀 。 用 镊 子 取 一 洁 净 的 盖 玻 片 ， 使 其 一 边 与 菌 液 边 缘 接 触 ， 然后 将 盖 玻 片 慢 慢 放 下 盖 在 菌 液 上 。 观 察 专 性 好 氧 菌 时 ， 可 在 放 盖 玻
25、 片 时 压 入 小 气 泡 ，以 防 止 细 菌 因 缺 氧 而 停 止 运 动 。（ 2） 镜 检 先 用 低 倍 镜 找 到 标 本 ， 再 用 高 倍 镜 观 察 。 也 可 用 油 镜 观 察 ， 用 油 镜 时 ，盖 玻 片 厚 度 不 能 超 过 0.17nm。 观 察 时 ， 要 用 略 暗 光 线 。有 鞭 毛 细 菌 可 作 直 线 、 波 浪 式 或 翻 滚 运 动 ， 两 个 细 菌 之 间 出 现 明 显 的 位 移 而 与 布 朗运 动 或 随 水 流 运 动 区 别 。2. 悬 滴 法（ 1） 涂 凡 士 林 取 洁 净 凹 载 玻 片 ， 在 其 四 周 涂 少
26、 许 凡 士 林 。（ 2） 加 菌 液 在 盖 玻 片 中 央 滴 一 小 滴 菌 液 。 为 便 于 观 察 时 寻 找 菌 液 位 置 ， 可 用 记号 笔 在 菌 液 周 围 画 上 记 号 。 菌 液 不 能 加 得 太 多 ， 为 了 便 于 观 察 ， 也 可 用 接 种 环 挑 取 一环 菌 液 于 盖 玻 片 中 央 。（ 3） 盖 凹 玻 片 将 凹 玻 片 得 凹 槽 对 准 盖 玻 片 中 心 得 菌 液 ， 并 轻 轻 盖 在 盖 玻 片 上 。轻 轻 按 压 使 盖 玻 片 与 凹 玻 片 粘 合 在 一 起 ， 把 液 滴 封 闭 在 小 室 中 。 翻 转 凹
27、玻 片 ， 使 菌 液滴 悬 在 盖 玻 片 下 并 位 于 凹 槽 中 央 。若 菌 液 加 得 过 多 ， 此 时 菌 液 就 会 流 到 凹 玻 片 上 面 影 响 观 察 。（ 4） 镜 检 先 用 低 倍 镜 找 到 标 本 ， 并 将 液 滴 移 至 视 野 中 央 ， 然 后 用 高 倍 镜 观 察 。若 用 油镜 观 察 ， 盖 玻 片 厚 度 不 能 超 过0.17nm， 并 要 十 分 细 心 ， 以 免 压 碎 盖 玻 片 、 损 伤 镜 头 。观 察 过 程 要 在 略 暗 的 光 线 下 进 行 。实验四 酵母菌的形态观察及死、活细胞的鉴别一、 实验要求1. 观 察
28、酵 母 菌 的 形 态 及 出 芽 生 殖 方 式 ， 学 习 区 分 酵 母 菌 死 、 活 细 胞 的 染 色 方法 。2. 掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。二、基本原理酵母菌是多形的、不运动的单细胞微生物，细胞核与细胞质已有明显的分化，其大小通常比常见细菌大几倍甚至几十倍。繁殖方式也比较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖，仅裂殖酵母属是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验通过用美蓝染色制成水浸片和水碘水浸片来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的，用它来对酵母的活细胞进行染色，由于细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具
29、有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色，而对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，用美蓝水浸片不仅可以观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞。但美蓝的浓度、作用时间等均有影响，应加注意。三、器材酿酒酵母(Saccharomyces cervisiae)或卡尔酵母（S. calsbergensis）；0.05%， 0.1%吕氏碱性美蓝染液，革兰氏染色用的碘液；显微镜，载玻片，盖玻片等。四、操作步骤1. 美蓝浸片观察（1）在载玻片中央滴加 1 滴 0.1吕氏碱性美蓝染液，液滴不可过多或过少，以免盖上盖玻
30、片时，溢出或留有气泡。然后按无菌操作法取在豆芽汁琼脂斜面上培养 48h 的酿酒酵母少许，放在吕氏碱性美蓝染液中，使菌体与染液均匀混合。（2）用 镊 子 夹 盖 玻 片 一 块 ， 小 心 地 盖 在 液 滴 上 。 盖 片 时 应 注 意 ， 不 能 将 盖 玻片 平 放 上 去 ， 应 先 将 盖 玻 片 地 一 边 与 液 滴 接 触 ， 然 后 将 整 个 盖 玻 片 慢 慢 放 下 ， 这样 可 以 避 免 产 生 气 泡 。（3）将制好地水浸片放置 3min 后镜检。先用低倍镜观察，然后换用高倍镜观察酿酒酵母的形态和出芽情况，同时可以根据是否染上颜色来区别死、活细胞。（4）染色 0.
31、5h 后，再观察一下死细胞数目是否增加。（5）用 0.05吕氏碱性美蓝染液重复上述的操作。2. 水碘浸片观察在载玻片中央滴一滴革兰氏染色用的碘液，然后再在其上加三滴水，取酿酒酵母少许，放在水碘液滴中，使菌体与溶液混匀，盖上盖玻片后镜检。实 验 五 细 菌 、 放 线 菌 、 酵 母 及 其 它 真 菌 菌 落 的 比 较 及 微 观形 态 观 察一、目的要求1. 观察细菌、放线菌、酵母、青霉和平菇菌丝等代表种类的菌落形态特征。2. 观 察 细 菌 、 放 线 菌 、 酵 母 、 青 霉 和 平 菇 菌 丝 等 代 表 种 类 的 菌 体 的 微 观 特征 。3. 学习描述菌落特征的方法。二、基
32、本原理菌 落 形 态 是 指 某 种 微 生 物 在 一 定 的 培 养 基 上 由 单 个 菌 体 形 成 的 群 体 形 态 。 细菌 、 放 线 菌 、 酵 母 、 霉 菌 和 食 用 菌 ， 每 一 种 微 生 物 在 一 定 的 培 养 条 件 下 形 成 的 菌落 各 具 有 某 些 相 对 的 特 征 ， 利 用 观 察 这 些 特 征 ， 来 区 分 各 大 类 微 生 物 及 初 步 识 别 、鉴 定 微 生 物 ， 方 法 简 便 快 速 ， 在 科 研 和 生 产 中 常 被 应 用 。微 观 特 征 是 鉴 定 微 生 物 种 类 的 主 要 依 据 ， 通 过 显 微
33、 观 察 可 以 了 解 四 大 类 微 生 物的 主 要 特 征 。三、器材圆褐固氮菌或大肠杆菌，枯草芽胞杆菌，灰色链霉菌，酿酒酵母，青霉或其它霉菌，平菇或其它食用菌菌丝体。载玻片，盖玻片，无菌水滴瓶，酒精灯，接种环、接种钩、显微镜等。四、操作步骤1. 菌落形态观察观察比较圆褐固氮菌或大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、灰色链霉菌、酿酒酵母、青霉或其它霉菌、平菇或其它食用菌菌丝体在平板培养基上形成的菌落特征，按照下列菌落描述的方法记录结果。（1）大小：大、中、小。或用十字交叉法测量菌落直径。（2）形态：圆形、不规则形。（3）干湿：干燥、湿润、粘稠。（4）高度：扁平、隆起、凹下。（5）透明度：透明、半透明
34、、不透明。（6）颜 色 ： 白 色 、 乳 白 色 、 黄 色 、 金 黄 色 、 绿 色 、 红 色 、 褐 色 等 。 中 间 与 边缘 有 无 区 别 。（7）边缘：整齐、不整齐。2. 菌落微观形态观察（1）取细菌固定玻片，用油镜观察细菌的形态。（2）取放线菌固定玻片，用低倍镜和高倍镜观察放线菌的形态。（3）取酵母菌固定玻片，用低倍镜和高倍镜观察放线菌的形态。（4）取 青 霉 或 黑 曲 霉 固 定 玻 片 ， 用 低 倍 镜 和 高 倍 镜 观 察 其 菌 丝 和 分 生 孢 子梗 的 形 态 。（5）挑取少量平菇或其它食用菌的菌丝体，用低倍镜和高倍镜观察其形态，观察有无锁状联合。边观
35、察，边用铅笔绘图。左眼观察视野，右眼观察图纸。实验六 细菌和放线菌培养基的制备培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究目的不同，所以培养基种类很多。培养基可以为微生物生长、繁殖提供充足的水分、碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子等，不同微生物对 pH 要求不同，酵母和霉菌一般的培养基一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基一般是偏碱性的，所以配制培养基时需要调整 pH 值。根据培养基的成分不同，培养基可以分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基；根据培养基的物理状态可以
36、分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基；根据培养基的用途可以分为基础培养基、加富培养基、鉴别培养基和选择培养基。本实验主要学习制备培养细菌和放线菌的 2 种培养基。一、牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌用）（一）目的要求1. 明确培养基的配制原理。2. 掌握配制培养基的一般方法和步骤。（二）基本原理牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普遍的细菌基础培养基，由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，培养基中的牛肉膏主要为微生物生长提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而 NaCl 提供无机盐，琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下（1.5%2%）下 96时溶化，在
37、 45时凝固，通常不被微生物分解利用。由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其 pH 调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：牛肉膏 3.0g蛋白胨 10.0gNaCl 5.0g琼脂 20g水 1000mLpH 7.47.6（三）器材1、溶液或试剂：牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，1mol/LNaOH，1mol/LHCl 。2、仪器或其它用具：试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装装置，天平，药匙，高压蒸汽灭菌锅，pH 试纸（pH5.59.0），棉花，报纸或牛皮纸，记号笔，线绳或尼龙绳，纱布等。（四）操作步骤1. 称量 按照培养基配方比例依次称取牛
38、肉膏、蛋白胨、NaCl 放入烧杯中。注意牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或培养皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯；蛋白胨易吸潮，在称取时动作要迅速；严防药品混杂，一把药匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净插干，再称取另一种药品。瓶盖也不要盖错。2. 溶化 在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然好在石棉网上加热使其溶解，或在磁力搅拌器上加热溶解。将药品完全溶解后，补充水到所需总体积，将称好的琼脂加入后，再加热溶化。加热时要用玻棒不断搅拌，防止糊锅或溢出。最后补足所损失的水分。如果是制备三角瓶盛固体培养基时，可以先将一定量的液体培养基装入三角瓶，再按比例加入琼脂，不必加热溶化，而是加热和溶
39、化同步进行，节省时间。3. 调 pH 先用精密试纸测量培养基的原始 pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入 1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用 pH 试纸测其 pH，直至 pH达到 7.6。反之，用 1mol/LHCl 进行调节。对于有些要求 pH 较精确的微生物或实验，其 pH 的调节可以用酸度计进行。4. 过滤 趁热用 4 层纱布过滤，以利某些实验结果的观察。一般没有特殊要求的情况下，这一步可以省去（本实验不需过滤）。5. 分装 按实验要求，可将配制的培养基装入三角瓶或试管内。分装试管时，分装量为试管总长的 1/51/4，灭菌后制成斜面。分装三角瓶的量以不超过三角瓶容积的一半为宜
40、。注意分装速度要迅速，防止培养基凝固；不要将培养基溅到管（瓶）口，以免沾污棉塞而引起污染。6. 加棉塞 培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料塞及试管帽等）。棉塞要求松紧适度，既能阻止外界微生物进入而引起污染，又能够保证有良好的通气性能。正确地棉塞要求形状、大小、松紧与试管口（或三角瓶口）完全适合，过紧则妨碍空气流通，操作也不便；过松则达不到滤菌的目的。加塞时，大头朝外，试管内塞入 2/3，试管外留 1/3。手提棉塞，试管不下落为不松，拔掉棉塞时不发出较大声响为不紧。棉塞制作过程如图 2.1 所示。三角瓶封口可以用棉塞，也可以用 8 层纱布重叠而成。7. 包扎 加塞后，取 7 支同样规格的试管，棉塞顶端用双层报纸或 1 层牛皮纸覆盖，再用线绳或尼龙绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期等。三角瓶加塞后直接覆盖双层报纸或 1 层牛皮纸，用同样的方法扎好。图 2.1 棉塞的制作过程示意图
