1、实验二 细菌的简单染色和革兰染色一、实验目的1、学习无菌操作技术，掌握细菌涂片的制作方法。2、掌握细菌简单染色法和革兰染色法的原理及操作步骤，识别细菌的革兰染色结果。3、巩固显微镜油镜的使用方法。二、实验原理细菌生长于酸性、中性和碱性溶液时常带负电荷，所以通常采用带正电荷的碱性染料（如美蓝、甲紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。当细菌分解糖类产酸时，细菌所带正电荷增加易被带负电荷的酸性染料（如伊红、酸性复红或刚果红）着色。简单染色法就是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法。革兰氏染色法（Gram Staining）由丹麦病理学家 Christian Gram 于 1884 年创立，是细菌学中
2、很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别分类为革兰氏阳性菌（G +）和革兰氏阴性菌（G -）这两种类型。革兰氏染色法之所以能够将细菌区分为革兰氏阳性菌（G +）和革兰氏阴性菌（G -）两大类，是因为这两类菌的细胞壁结构和成分不同。一般认为革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色，再经蕃红复染就染成了红色；革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色。虽然如此，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也
3、有物理结构不同的结果，因为酵母菌细胞壁的成份完全和细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。三、实验器材1、菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌、酵母菌、待鉴定的未知菌 S1 和 S3。2、仪器及其他用品：显微镜、酒精灯、打火机、接种环、载玻片、盖玻片、擦镜纸、擦镜液、吸水纸、镜油、无菌牙签。3、简单染液：草酸铵甲紫染液、番红染液。4、革兰染液：草酸铵甲紫染液、革氏碘液、95%乙醇溶液、番红染液四、实验步骤（一）简单染色1、载玻片的处理：从乙醇溶液中取出洗干净的载玻片，用吸水纸擦干，将要涂菌的部位在酒精灯火焰上烤一下，去除油脂，冷却待用。2、涂片: 左手持菌液试管，右手持接种环在火焰上灼烧待冷却后，
4、用接种环从试管枯草芽孢杆菌培养液中取一环菌，于载玻片中央涂成薄层（事先在背面做好标记圆圈）即可，或先滴一小滴无菌水于载玻片中央，用接种环从斜面上挑出少许，与载玻片上的水滴混合均匀，涂成一薄层。注意在拔或塞试管塞时，应将试管口在火焰处略加烧灼，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。3、干燥：涂片后室温下自然干燥。4、固定：手持载玻片一端使标本面朝上，在酒精灯的火焰外侧快速来回移动 23次，要求玻片温度不超过 60，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。固定的目的是杀死微生物，固定其细胞结构，保证菌体能牢固地粘附在载玻片上，以免水洗时被水冲掉。5、染色：在固定好的涂片标记处滴加 1 滴草酸铵
5、甲紫染液，染色 1min。6、水洗：缓慢冲洗染液，吸干。7、实验搭档改用大肠杆菌培养液和番红染液，同时操作以上步骤。8、镜检：观察两个标本，区分辨别染成的紫色和红色。（二）革兰染色1、制片：分别取大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌、酵母菌、未知菌 S1 和 S3的菌液制成涂片，干燥，固定。2、初染：滴加 1 滴草酸铵甲紫染液，染色 1min，水洗，吸干。3、媒染：再加 1 滴碘液覆盖涂片 1min，水洗。4、脱色：用吸水纸吸去玻片上的残留水，用滴管滴加 95%的乙醇脱色，轻轻摇动玻片直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。5、复染：滴加蕃红染液复染 3min，水洗。6、镜检：吸干水后，盖上盖玻片观察标
6、本，观察时注意细菌形态、大小、排列和颜色。（三）选做实验在干净的载波片上滴加半滴水，用无菌牙签取一点牙垢，涂抹在水滴上，制成涂片后，进行革兰氏染色后观察。五、实验结果与讨论1、革兰染色照片结果（见下一页）（1）枯草杆菌图 1 枯草杆菌革兰氏染色结果，10100如上图所示，枯草杆菌染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌（G +） 。注：图中红色箭头所指的特殊结构芽孢。（2）酵母菌图 2 酵母菌革兰氏染色结果,10100如上图所示，酵母菌染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌（G +） 。注：图中红色箭头所示为出芽现象。（3）金黄色葡萄球菌图 3 金黄色葡萄球菌革兰氏染色结果,10100如上图所示，金黄色葡萄球菌
7、染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌（G +） 。注：从图中可以清晰地观察到葡萄球状的细菌形态。（4）大肠杆菌图 4 大肠杆菌革兰氏染色结果,10100如上图所示，大肠杆菌染色结果为红色，是革兰氏阴性菌（ G） 。（5）未知菌液 S1图 5 未知菌液 S1 涂片革兰氏染色结果,10100如上图所示，菌液中有两种主要的细菌。注：红色箭头所示的未知菌的染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌（G +） ，由细菌形态推测为一种杆菌；蓝色箭头所示的未知菌的染色结果为红色，是革兰氏阴性菌（G ） ，由细菌形态推测为一种球菌。（6）未知菌液 S3图 6 未知菌液 S3 涂片革兰氏染色结果,10100如上图所示，菌液中只有
8、一种主要的细菌。注：红色箭头所示的未知菌的染色结果为红色，是革兰氏阴性菌（G ） ，由细菌形态推测为一种球菌或葡萄球菌。（7）牙垢图 6 牙垢涂片中微生物染色结果，10 100牙垢中含有多种细菌，多数染色为紫色，是革兰氏阳性菌（G +） ，如红色箭头所示为革兰氏阳性杆菌。2、革兰染色观察结果列表菌种 鉴定结果 细菌颜色 细菌形状（形状和聚集状态）枯草芽孢杆菌 G+（阳性） 紫色 杆状菌，较分散，偶有成链状酵母菌 G+（阳性） 紫色 球状菌，双球状或团状聚集金黄色葡萄球菌 G+（阳性） 紫色 球状菌，葡萄球状聚集大肠杆菌 G-（阴性） 红色 球杆状菌，分散排列S1 未知菌种 1 G+（阳性） 紫
9、色 链杆状菌，较分散S1 未知菌种 2 G-（阴性） 红色 球状菌，分散排列S3 未知菌种 G-（阴性） 红色 球状菌，密集排列，有葡萄球状聚 集3、思考题（1）分析影响某一微生物革兰染色结果的因素。答：菌龄：染色所用的细菌最好是出于对数生长期的细菌。因为此时细菌生长旺盛，个体数目较多，便于观察。若菌龄过大，细菌大量死亡或部分菌自然溶解，造成细胞壁通透，阳性菌出现假阴性，使得染色结果受到干扰，不准确。载玻片清洁：载玻片应清洁无油脂，可以在酒精等火燃上烤一下以去除油脂。涂片厚度：涂片厚度太薄，会使细菌过于稀少，但也不宜太厚，因为过厚会使菌体堆积，影响观察，同时染色时可能会残留结晶紫染料，易出现假
10、阳性。干燥温度：最好让细菌涂片自然干燥。如果在火焰上略加灼烧令其干燥，温度不能超过 60 度，若温度太高则菌体变形。热固定温度：将已干燥的涂片在火焰上通过 3-4 次，温度不超过 60 度，以手背接触不烫为宜。温度低则菌体固定不牢，水洗时易被冲去；温度高菌体发生变形。染色：初染色时间应控制在 30s1min 为宜。如果染色时间过短, 不利于初染液结晶紫与细胞结合,造成阳性菌呈阴性结果。而染色时间过长, 不易脱色，易使阴性菌呈假阳性。乙醇脱色：脱色时间最好在 1020s，以恰好洗脱液物色为准，如果时间过长, 革兰阳性菌也有可能被脱色, 结果呈假阴性。而若脱色时间不足, 革兰阴性菌细胞壁的部分类脂
11、质未被乙醇溶解,使结晶紫-碘的复合物不能被洗脱出来,结果呈假阳性。（2）思考一下，我们平常使用的甲紫药水杀菌机理。答：龙胆紫为碱性阳离子染料,其阳离子能与细菌蛋白质的羧基结合，从而影响其代谢，对革兰氏阳性菌有选择性抑制作用，因而产生杀菌作用。一般医用的紫药水是龙胆紫的 12水溶液或酒精溶液，是常用的外用药。对革兰氏阳性菌、绿脓杆菌、及真菌（如念珠菌以及皮肤癣菌等）有较强杀菌作用，对革兰氏阴性菌和抗酸菌作用不显著。对组织无刺激性。六、实验小结这堂课学习了革兰氏染色方法，由于陈老师对细节讲解得很到位，实验过程十分顺利。这堂课我还和周围的同学进行了讨论交流，彼此交换了经验，使得实验更加流畅、实验原理更加明了。最后还要感谢陈老师、麻老师和各位助教的耐心细心的讲解和指导。七、参考文献陈金春、陈国强主编， 微生物学实验指导 ，清华大学出版社，2005 年 8 月
