1、第一章 前言 1.1 酪蛋白糖巨肽(CGMP)的研究背景 1.1.1 CGMP 的生物来源 酪蛋白糖巨肽（Casein Glycomacropeptide 简称CGMP） ，是Delfour等1于 1965年发现的一种含有唾液酸的糖肽，是乳中- 酪蛋白(- CN，惟一含有糖成 分的CN)上的一个多肽片段。- 酪蛋白是酪蛋白的一种，它是酪蛋白中唯一一 种含有糖成分的酪蛋白，在牛脱脂乳中含量约占总酪蛋白的13%，在人乳中占 总酪蛋白的30%。氨基酸组成分析表明，- 酪蛋白含有169个氨基酸残基，两 个胱氨酸残基( 两个，SH基)，通常含有一个磷酸基，富含脯氨酸、丙氨酸、谷 胺酰胺、谷氨酸等，分子量
2、约为1.910 41。-酪蛋白中有半乳糖 (Gal)、N一乙 酰氨基半乳糖(GalNAc) 、 N一乙酰神经氨酸(NeuNAe)(唾液酸)三种糖。酪蛋白糖 巨肽就是水解- 酪蛋白产生的2,3。干酪加工时凝乳酶水解酪蛋白（主要是- CN） 的苯丙氨酸 - 蛋氨酸键，生成不溶性的副- CN(肽链的1105 部分)和 可溶性的多肽( 肽链的106169部分)两部分，此多肽含有较多的碳水化合物， 称之为“糖巨肽 ”，酪蛋白来源的糖巨肽称为 “酪蛋白糖巨肽”。-酪蛋白来源的 CGMP的氨基酸序列已清楚 ,它是由从-酪蛋白的 N 末端 106 位氨基酸(Met) 开始至169 位 C 末端(Val) 结束
3、的 64 个残基构成的。牛的 CGMP有A 和B 2 种遗传变异型 ,其不同在于该多肽链的136 位和 148 位的氨基酸不同 ,A 型的 136 位和 148 位残基氨基酸分别为 Thr 和 Asp ,而 B 型为 Ile 和Ala 。此外 , 该多肽的 131、 133、 135、 136 和 142 位的苏氨酸残基为配糖体化的部位 ,149 位的丝氨酸为磷酸化的部位2,3。在凝乳酶凝集乳酪制造过程产生的乳清 中含有大量的 CGMP ,有研究4 指出 ,甜乳清中其含量约为 1.21.5g/ L ,估计 相当于总乳清蛋白含量的 20 %25 %左右。 1.1.2 CGMP 的生物学活性 1.
4、1.2.1 .结合霍乱毒素和大肠杆菌毒素 霍乱毒素由一个亚单位 A 和五个亚单位 B 组成，其中 B 亚基与细胞表面的 寡糖受体结合以后，A 亚基就会激活细胞中的腺苷酸环化酶，最后导致细胞死 亡5。有研究显示此寡糖受体是一个 GM1 寡糖，其结构为：Gal 13GalNAc14 (NeuAc23)Gal1 4Glc11Cer (Glc =glucose ,Cer =ceramide)6，7。此结构的寡糖受体与糖巨肽的寡糖结构类似，因此 CGMP 可 以作为毒素中和剂抑制霍乱毒素与受体的结合，保护细胞免受毒素的侵染。 1.1.2.2.抑制细菌和病毒黏附 CGMP 与宿主细胞上的受体蛋白具有相似性
5、， 优先与细菌和病毒结合，从 而抑制细菌和病毒的繁殖8 。多项研究结果表明 CGMP 能够有效阻止龋齿、病 原菌 Streptococcus mutans，S. sanguis ，S. sobrinus 在口腔表面的黏附9，10， 并且能够调节牙齿菌斑的微生物，有助于控制牙齿菌斑上酸类物质的形成，减 少牙齿上羟基磷灰石分解。根据此原理，CGMP 已经成功地申请专利应用到口 腔保健上11 。 1.1.2.3.抑制胃液分泌 Stan12等研究发现 CGMP 能够抑制狗的胃液分泌，减慢胃肠的蠕动。狗 被注射了 1015mg 的 CGMP 后，它分泌的胃液酸性减弱，并且胃和十二指肠 的的蠕动减慢了。被
6、注射 CGMP 的老鼠也有同样的反应。进一步研究表明，胃 蛋白酶消化 CGMP 产生了两个可以用 Sephadex 分离的片段， Stan 解释说是 因为 CGMP 进入血液从而抑制了胃液的分泌。Aleinik13等人相继也发现 CGMP 抑制胃液的分泌高达 50%，血清中的促胃泌激素也被抑制约 8%。抑制 胃液分泌能够降低动物胃蛋白的水解作用，这样可以保护乳中的免疫球蛋白、 乳铁蛋白及溶菌酶等蛋白质原封不动地穿过胃，有益于婴儿以及免疫力低下的 人增强免疫力。 1.1.2.4.促进双歧杆菌增殖 Gyorgy14首先发现 CGMP 是人初乳和常乳中双歧杆菌的生长促进因子。 近年来的很多研究也证实
7、了这个结论15。双歧杆菌是肠道中的益生菌，它可 以抑制大肠杆菌等有害菌的生长，起到预防胃肠道疾病的作用。近年来添加双 歧杆菌的多种微生态制剂已经投放市场，有效地缓解乳糖不耐症，预防和治疗 肠炎等疾病。 1.1.2.5. 调节免疫系统 CGMP 能够抑制引起脾细胞增殖的促细胞分裂素的产生。从而抑制脾脏淋巴 细胞（参与炎症反应）的增殖，抑制过敏反应16。 Otani17等通过实验表明 这种抑制活性主要 CGMP 中的唾液酸其主要作用，如果把唾液酸消化掉，则它 就不具有这样的活性。CMP 可与小鼠单核或巨噬细胞通过多价配位体 (例如糖 链及其他阴离子基团如磷酸丝氨酸残基)结合, 诱导产生白细胞介素-
8、 1(IL- 1)受 体拮抗剂,从而抑制脂多糖介导的脾淋巴细胞增殖18。 1.1.2.6.其它生物活性 CGMP 具有独特的氨基酸组成，特别是几乎不含有芳香族氨基酸，因此可作 为苯丙酮尿症患者膳食中首选的成分19；CGMP 含有较多的支链氨基酸(如 Val 和 Ile) ，可用于多种肝病的治疗20；最近一些研究表明，由 CGMP 再降 解所得的一些小肽有抑制血小板凝集及降低血压效果21；CGMP 能够有效促 进锌的吸收22 ；CGMP 的糖链中含有较多的氨基葡萄糖，对炎症性肠疾患者 有较好的疗效作用；有研究证实在幼年恒河猴的乳汁中加入 CGMP 可以促进 Ca、P 、Fe 的吸收23；CGMP
9、 含有大量的唾液酸，动物体内试验表明外源唾 液酸的摄入能够显著增加脑中神经节苷脂的数量，提高学习能力24；在新生 动物中还能显著地抑制 IgG 的产生，有助于下调机体对抗原产生的免疫应答， 有效预防过敏反应的发生25。 1.2 肠道微生态及研究进展 1.2.1 肠道微生物的形成以及分布 人体体表以及体内存在着大量的微生物，包括细菌、古细菌、真菌、寄生 虫和病毒等。这些微生物占人体总重量的 1%-2%，因此从某种意义上说一个完 整、健康的成年人是诸多物种组成的复合体。其中肠道是世界上生物密度最高 的地方，每克大肠最多有 1 万亿个微生物26。其中许多微生物对人体健康起 到了重要作用，他们可以协助
10、机体的消化、吸收，对外来的病原微生物产生免 疫应答等27 ，而同时还有一些微生物则可能导致人体疾病：结肠炎、类风湿 性关节炎等。肠道微生物与宿主之间是一种互惠共生的关系,对维持人类健康和 正常菌落稳定的巨大贡献28。这些细菌中有一部分是潜在的致病菌，当肠道 环境处于生理或功能性障碍时，他们能引起一系列的感染和腐败反应。 1.2.1.1 肠道正常菌群的形成 新生婴儿从无菌的环境中出生以后很快就会适应新的环境，并成为大量微 生物的宿主，这些微生物都将参与人体内正常微生物菌群的构建。胎儿的出生 方式（自然生产和剖腹生产），婴儿喂养方式（母乳喂养和非母乳喂养）甚至 婴儿出生的环境（发达国家和发展中国家
11、，甚至出生的医院）等都会影响婴儿 体内正常菌群的构建。母体产道中的微生物在婴儿早期的粪样中不会富集，只 在刚出生后的前几天内会有，所以说自然生产的婴儿肠道微生物的构建受母体 产道的影响不大29 。 肠道内优先侵入的菌群可以调节寄主肠道上皮细胞内的基因表达，因此可 以为它们创造一个合适的生长环境，同时阻止其它细菌的生长。因此说，个体 肠道内原始微生物的定植与个体肠道内固定微生物的组成和分布是有很大关系 的。 1.2.1.2 肠道微生物的分布 胃肠道上段(胃及小肠) 微生物含量较少，仅有少量黏附在上皮的细菌以及其 它一些过路菌。胃内酸度高，环境中pH较低且含大量消化酶，不适合细菌生长， 所以胃内细
12、菌数量很少，总菌数O10 3个, 主要为革兰氏阳性好氧菌 , 如链球菌、 葡萄球菌和乳酸杆菌, 其中乳酸杆菌的数量约为10 3CFU/ml。在回肠末端, 细菌 数逐渐增加10 5 10 8 CFU/ml, 主要含乳酸杆菌( 10 2 10 5 CFU/ml) 、大肠杆菌、 类杆菌和梭状芽孢杆菌等。至结肠, 细菌数明显增加, 浓度为10 9 10 12CFU/ml, 主要为厌氧菌: 双歧杆菌( 10 8 10 11 CFU/ml) 、类杆菌、乳酸杆菌( 10 4 10 9 CFU/ml) 占绝对优势为优势菌群, 而有潜在致病性的梭状芽孢杆菌和葡萄球菌 仅占少量30 。 近年来，将分子生物学的方法
13、应用到肠道微生物检测发现：一些兼性厌氧 菌包括大肠杆菌、肠球菌（enterococci）和乳酸杆菌，在人体的盲肠中达到非常 高的密度和代谢活性，因为盲肠内容物中总细菌 rRNA 的 50%都与这些菌种的 一致，而粪便样品中这些菌种 rRNA 的数量仅达到 7% 。由此可见，这些菌种 在盲肠中起到了非常重要的作用31。 1.2.2 肠道微生物的生理功能 随着分子生物学技术的发展和应用，人们日益突破传统技术和方法的局限, 深刻地揭示宿主与肠道微生物之间互惠共生的分子机制: 人体肠道向肠道微生 物提供优越的栖息和繁殖环境, 其中包括天然的厌氧条件 , 丰富的营养物质, 以 及适宜的温度和 pH 等;
14、 肠道微生物及其代谢产物影响到人体的营养物质加工、 能量平衡、免疫功能、胃肠道发育和成熟以及其他多种重要的生理活动。一般 情况下，肠道菌群与人体外部环境保持着一个平衡状态，对人体的健康起着重 要作用，但是这种平衡在某些情况下可能被打破，造成人体肠道菌群失调，从 而引起多种疾病，如：炎性肠病（IBD）、结肠癌、类风湿性关节炎、遗传过 敏性皮炎、哮喘等29,31,32。 最新的研究发现，肠道内细菌构成的比例，甚至可能是决定是否患肥胖症的 重要因素。美国华盛顿大学教授杰弗里戈登等通过动物实验以及对 12 名减肥 成功人士进行的研究，他们发现，在众多的肠道细菌群落中，有两种细菌的比 例关系和肥胖的发生
15、密切相关：在肥胖的人和老鼠的肠道内，一种名为“类杆菌” 的细菌所占的比例比较低，而另一种名为“厚壁菌” 的细菌含量较高。 1.2.2.1 保护功能：屏障作用 体内正常微生物在肠粘膜上形成一层菌膜以抵御外来微生物的定植，因此 对防止组织受到病原菌侵染方面起到很重要的作用。这种抵御作用还表现在限 制过路菌（opportunisic bacterial）的生长。 体外试验发现：细菌之间能够通过争夺肠道上皮细胞上的黏附位点而在粘膜 上定植，非致病菌的黏附和定植可以阻止随后进入的致病性大肠菌群在肠粘膜 上皮细胞的黏附和定植33。另一方面细菌通过竞争肠道内可利用的营养物质 资源和资源来供自身的生长和繁殖，
16、例如：肠道内的Bacteroides thetaiotaomicron. (多形拟杆菌)就是通过这种发式来发挥它的占位作用的。另外，这些肠道内的 正常菌群还能够通过产生抗菌的细菌素来抑制竞争菌的生长，这种合成细菌素 的能力广泛地分布在胃肠道的微生物群系中，但同时寄主能够控制这种细菌素 的产生，因为这些物质中大多数是可以被蛋白酶降解的蛋白质复合体，因此， 这些细菌素的作用可以被寄主通过位置效应来限制的，避免微生物在机体内产 生过多的毒素。 1.2.2.2 代谢营养功能 结肠内微生物的主要代谢功能是对未消化吸收的食物残留和由上皮细胞产 生的内生黏液进行发酵。微生物区系基因的多样性为机体提供了多种酶
17、系和生 化反应途径，这个复杂的代谢体为寄主代谢能量进行物质吸收，扩大了宿主可 利用原料的范围和提高了能量利用效率，同时为微生物自身提供生长和繁殖所 需要的能量和营养。研究发现常规饲养和无菌动物在饲喂相同食物条件下, 尽 管常规饲养动物消耗饲料少, 但积蓄的体脂却比无菌动物多 40%这些成年无菌 动物在饲喂常规饲养动物结肠内容物之后, 其体脂很快恢复到了常规饲养动物 的体脂水平, 并且发现饲喂结肠内容物无菌动物体脂增加方式源自于脂肪细胞 的肥大, 而不是脂肪细胞的过度分裂增生33,34。 肠道内微生物对未消化的碳水化合物（主要有抗性淀粉，纤维素，半纤维 素，胶质和树胶） 、蛋白质（主要有胶原质，
18、胰腺酶，脱落的上皮细胞和被溶解 的细菌）和肽进行代谢，其代谢的终点是短链脂肪酸34。所有的这些短链脂 肪酸都对寄主生理方面有重要的功能。丁酸盐基本都是被结肠上皮细胞消耗的， 同时它还是结肠细胞主要的能量资源。醋酸盐和丙酸盐可能对葡萄糖代谢也发 挥着作用。 微生物在维生素 k 的合成，钙离子、镁离子、铁离子的吸收过程中也起到 了重要作用。碳水化合物的发酵和短链脂肪酸，尤其是醋酸盐、丙酸盐和丁酸 盐的产生都促进了盲肠中铁离子的吸收。 1.2.2.3 肠道微生物与寄主免疫之间的关系 肠道不仅是吸收、消化和营养物质交换的重要场所，也是人体最大的免疫 器官。人的肠黏膜面积巨大，约2倍于皮肤的表面，每时每
19、刻黏膜都要接触大量 抗原，担负着重要的免疫功能。越来越多的证据表明肠黏膜免疫功能与寄居在 肠道中为数众多的肠道菌群(intestinal flora)有密切关系31。肠道粘膜是免疫系 统和外部环境接触的主要界面，因此，肠相关淋巴组织包括人体内最多的免疫 活性细胞也是不足为奇的。细菌与寄主在肠粘膜表面的交流好像在免疫系统的 进化方面起着重要的作用。在无菌环境下饲养的动物其肠粘膜上含有的淋巴细 胞密度较低，同时其血液中的免疫球蛋白浓度也较低。肠道内微生物定植会影 响肠系淋巴组织的组成。已有研究表明早年体内肠系淋巴组织和肠道内微生物 之间的相互作用看起来对复杂的粘膜和系统免疫调节的发展进化起着关键的
20、作 用。此外还有研究显示：无菌老鼠在肠道发育期血管的生成受阻, 肠腺发育不 完全; 无菌老鼠口服卵清蛋白不能产生T辅助细胞介导的免疫应答, 但接种常规 饲养动物断奶前肠内容物之后, 这些老鼠则能够产生免疫应答35。 因此, 肠 道微生物在肠道发育和成熟过程中发挥重要的作用, 是肠道建立起正常的免疫 功能所必需的。 宿主针对微生物产生的免疫应答依赖于先天免疫和获得性免疫，例如分泌 免疫球蛋白。先天免疫应答中不仅白血球细胞（例如中性粒细胞和巨噬细胞） 能吞噬杀死病原菌，而且肠粘膜上皮细胞也能通过合成多种炎症因子和给肠粘 膜的潜在细胞传递信号来调借宿主产生的免疫应答。先天免疫系统通过有限的 受体可以
21、从共生细菌中分辨潜在的病原菌。哺乳动物细胞表达一系列的toll-like 受体，用以识别细菌的保守型亚基（高等真核生物力没有发现）35，同时产 生不同类型的细胞因子应答，这被以信号的形式传递到潜在组织进行免疫应答。 1.3 微生物生态学研究方法 近年来, 人们逐渐认识到胃肠道正常菌群与人类及动物的健康有密切关系, 如乳酸菌、 产丁酸菌能促进肠道健康等, 因而关于人类及动物胃肠道微生态的 研究日益为人们所重视。 1.3.1 依赖培养的传统方法 自1881年科赫首创用固体培养基分离细菌至今，世界各国科学家采用培养 方法对多种环境中的微生物群落进行了大量的分析研究，取得了许多重要的成 果。 正是微生
22、物的纯培养技术为人类揭开了微生物界的神秘面纱，向人类展示了微 生物的基本面目，为微生物领域乃至整个生物学领域的蓬勃发展奠定了基础。 虽然在过去近半个世纪里传统培养技术取得了重大进展, 如厌氧培养技术的发 明, 动物模型的建立以及无菌动物的应用等，但是环境中可培养的微生物只是 占到很小的比例，如：海洋中可培养的微生物只占总数的0.01-0.1%4，湖水中 可培养的微生物占总数的0.1-1%5 ，活性污泥中叫培养的微生物占总数的1-15% 6，7，土壤中传统培养技术仅能分离1%-10% 的微生物 8。随着科学技术的不 断发展以及人们对微生物世界研究的不断深入，传统培养方法的不足逐渐暴露 了出来。其
23、主要原因有：很多细菌的生长需要的未知性, 各种细菌对培养基不 同的选择性, 体外培养过程对微生物的应激性, 严格厌氧技术的困难性, 微生物 之间以及与宿主细胞间相互作用的复杂性等。Furrie将传统培养微生物方法的优 缺点总结如表1-1所示36。 表 1-1 传统培养微生物方法的优缺点 优点 缺点 廉价 费时费力 应用范围广 样品要求立即处理 可以达到细菌数目定量 严格厌氧菌要求专业的技术和设备 由专业的微生物学家操作，可以得到 复杂的生态学的表征 一旦培养的细菌分离出来后，需要很 多技术进行鉴定 可以进行生理学研究 选择性培养基的选择会影响试验结果 可以进行生化研究 只能检测到可培养的微生物
24、 1.3.2 分子生物学技术 近年来随着分子生物学、基因组学和生物信息学等新兴学科的发展及其向 微生物学领域的渗透，逐渐形成了一个新的交叉学科分支微生物分子生态 学(Molecular Microbial Ecology) 。用微生物分子生态学的方法来研究微生物生态 系统已成为近年来研究的热点。微生物生态学主要以微生物基因组DNA的序列 信息为依据，通过分析样品中DNA分子的种类和数量来反映微生物之间以及微 生物与其周围环境条件相互作用关系的科学9。这种研究方法不仅避免了分离 培养方法的不足，而且能够大规模并行提取、处理和展示混合微生态系统基因 组的组成信息，分析速度快、提供的信息量大，因而特
25、别适合于对复杂微生物 生态系统的区系结构进行连续动态分析，在与微生物利用相关的领域具有广泛 的应用前景10 。 目前大多数微生物分子生态学技术都是依赖于 16S rRNA 基因序列的高度 保守性，其核苷酸位点的变化具有种的特异性。16S rRNA 基因序列可用于评价 生物的遗传多态性（geneticdiversity ）和系统发生关系（phylogenetic relationship） ，在细菌分类学中可作为一个科学可靠的指标。Leblond 等37 对 4 种 5 株双歧杆菌的 16SrRNA 序列进行了测定，并同 GenBank/EMBL 中 的其他双歧杆菌 16SrRNA 序列比较构建
26、了发生树，表明 16SrRNA 序列也可 以区别不同种的双歧杆菌。 1.3.2.1 荧光原位杂交技术（Fluorescent in situ hybridization 简称 FISH） 荧光原位杂交技术是将带有荧光标记的寡核苷酸探针直接与固定在载玻片 上的细胞进行杂交, 固定过程中要使短的探针渗透到细胞内的核酸, 用荧光显微 镜即可观察到带有杂交荧光标记探针的细胞。1988年, Giovannoni 等11首次将 荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH)引入细菌学研究中, 使用放射性标记rRNA 寡核苷酸探针检测微生物。与放射性探针相
27、比，荧光探 针具有更安全、分辨率更高等特点，因此在近十几年来得到了广泛的应用和发 展。荧光原位杂交方法不仅能够鉴定自然生态系统中的不同菌群, 了解菌群结 构特点，并且确定它们的定殖位点对细菌进行准确的定量研究。FISH 技术的 目标分子通常是16S rRNA, 因为它在微生物体内具有较高的拷贝数 , 分布广泛、 功能稳定, 而且在系统发育上具有适当的保守性。因此根据待测微生物16S rRNA片段中的保守序列，设计相应的寡核苷酸探针就可以实现对靶微生物的检 测。在短短的十几年中, 由于FISH 技术的灵敏性和快捷性使其成为微生物系统 发育学、微生物生态学、微生物诊断学和环境微生物学等方面研究的有
28、力工具。 近年来，国外很多研究人员已经将荧光原位杂交技术成功地应用于研究复 杂的肠道微生物系统中12-14。PETRA S38等根据 16SrRNA的可变区 V2、V4、V8设计了特异性探针成功地对粪便样品中的双歧杆菌进行了定量分 析。近几年来人们已经证实将荧光原位杂交技术与流式细胞仪结合起来是一项 很有用的技术。Erwin G39等成功地应用荧光原位杂交与流式细胞仪相结合的 技术对人体粪便中不可培养的瘤胃球菌属进行了定量分析，结果证明这种方法 能够成功地应用于分析肠道中复杂的微生态环境。 1.3.2.2 DGGE/TGGE 技术 DGGE/TGGE 电泳技术能够分离长度相同但序列有异的核酸分
29、子混合物。 其主要原理是核酸分子的形状随温度或变性梯度的变化而变化。分子的形状主 要是由其一级结构（即序列组成）决定的，碱基之间的氢键是维持二级结构的 主要作用力，这种作用力对温度或化学变性剂敏感，当温度或化学变性剂升高 到一定值，就会破坏氢键，使 DNA 双链部分打开。大小相同而序列有差异的 核酸分子，在同一温度下或同一变性剂梯度下的解链的程度不同，从而直接影 响核酸分子的形状，造成其电泳迁移率的不同。PCR - DGGE 技术可以用来分 析为生物多样性，监测为生物群落动态性等。具有可靠、快速、易操作等特点， 能克服传统微生物研究方法的不足，重现微生物多样性，提供微生物在时间和 空间上的动态
30、变化。R. Bibiloni40等应用 PCR-DGGE 技术对结肠炎小鼠的大 肠微生物区系进行了分析，证实了 PCR-DGGE 可以有效地检测肠道中微生物组 成的变化。但是这种技术也存在一些缺陷，如：通常显示微生物群落中的优势 种群，只能对菌体数量大于总菌量 1 %的菌群进行分析41；利用 DGGE 分离 的 PCR 产物，一般要求 DNA 长度在 500bp 以下，否则 DGGE 的分辨率会下 降等42。这些不足可以通过其他生物学技术来弥补，因此，PCR - DGGE 技术 与其他生物技术相结合，将能更实际地反映微生物群落的结构、功能和动态变 化，提供微生物的空间分布、群落演替、原位生理等
31、信息，促进人们对微生物 生态的认识，为微生物资源的开发利用提供理性指导。 1.3.2.3 荧光定量 PCR 技术 荧光定量 PCR 技术是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号 累积实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方 法。目前技术作为一个极有效的实验方法已被广泛地应用于微生物生态学研究 中。Sabine43等人运用此技术研究了生活在当地的健康老年志愿者、医院的老 年病人和医院接受了抗生素治疗的老年病人的粪便，他们提取了粪便中的 DNA,设 计种和种特异性的 16SrRNA 靶基因的引物，通过实时 PCR 技术进行肠道菌群 定量分析。A Fite4
32、4等应用荧光定量 PCR 技术对肠道中的脱硫弧菌进行定量分 析，并且阐明了此技术能够对人体肠道等复杂的微生态环境进行准确地分析。 1.3.2.4 16S rRNA 基因的限制性片段长度多态性(RFLP) 利用以 16S rRNA 基因内通常的保守区为靶的引物，用聚合酶链式反应技 术扩增 16S rRNA 基因，用特定的限制性内切酶切割扩增物，再将产生的长短、 种类、数目不同的限制性片段，用琼脂糖凝胶电泳分开它们，从而生成一特征 性的限制性片段长度多态性。由某一限制性内切酶产生的片段大小和数目在不 同个体中即表现出差异。对每一个 DNA/ 限制性内切酶组合来说,所产生的片段 都是特异性的45 。
33、RFLP 作为检测细菌种内或种间水平的方法，近年来被应用 于细菌，尤其是双歧杆菌的分类及鉴定中。 1.3.2.5 ERIC-PCR 技术（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-PCR） ERIC是主要存在于肠道细菌基因间的重复序列，该序列具有不完整的反向 重复性，二级结构可以形成稳定的茎环结构，散布在整个基因组中，定位于基 因组内可转录的非编码区域或者与转录有关的区域。该序列长约 124127 bp，并且在其中心存在高度保守长约 40 bp的核心序列ERIC-PCR技术是利用 ERIC核心的高度保守序列设计引物进行PCR ，因此通过该技
34、术扩增基因组 DNA，构建DNA指纹图谱，建立快速检测的分子分型平台，能广泛用于微生物 分类鉴定、环境微生物动态分析等方面的研究46。ERIC-PCR最早由Versalovic 等人用于对细菌的基因组 DNA 进行指纹图谱分析15，此后该技术就被广泛 用于细菌分类和菌种鉴别上。ERIC-PCR 实际上是一种长引物的随机扩增技术 (Long Primer RAPD, LP-RAPD)技术。这种长引物随机 PCR 技术与普通的RAPD技术相比，引物长 度一般都大于16个碱基，而普通的RAPD引物为8-10 个碱基，退火温度（48- 52）也高于RAPD 技术（低于 40） ，因此ERIC-PCR技
35、术具有图谱稳定、重 复性高以及产生的图谱多态性丰富等特点16-20。1999年，DiGiovanni 等21 首次将ERIC-PCR技术用于混合菌群的分析中。国内潘莉22等运用ERIC-PCR 指纹图谱技术对腹泻儿童肠道菌群结构特征做了深入的研究，结果发现腹泻儿 童得菌群结构多样性降低。鲁海峰47等采用ERIC-PCR和 Southern杂交方法分 析大熊猫肠道菌群结构，结果显示大熊猫不同个体之间肠道微生物群落结构比 较相似，不同个体在不同时期表现出很高的稳定性，但是当个体出现健康问题 时肠道菌群结构有一定的波动。这为监测大熊猫肠道微生物区系结构变化提供 了可能。大量的研究表明以ERIC-PC
36、R指纹图谱技术为基础的一系列分子生物学 方法是研究复杂环境微生物群落的组成、结构与功能关系的一种有效方法。 1.3.2.6 基因芯片（DNA microarray）技术 该技术是采用光导原位合成或微量点样等方法, 将大量 DNA 探针如基因、 PCR 产物、 人工合成的寡核苷酸等有序地固定在载体表面, 形成储存有大量 信息的高密度 DNA 微阵列。 该微阵列与标记的核酸样品杂交后 , 能快速、 准确、 大规模地获取样品核酸序列信息。最初该技术是用来检测生长细胞中某 些基因的表达, 随后发现该技术也适合各种生态系统中菌群研究。靳连群 48等 应用基因芯片对涉及 9 个菌属的 143 株肠道致病菌
37、在相同的条件下进行了杂 交检测，得到菌属(科) 特异性的杂交图谱，从而达到对细菌进行检测鉴定的目 的。 1.4 选题依据 众所周知，肠道是世界上生物密度最高、分布最复杂的场所，每克大肠最 多含有 1 万亿个微生物26，其中许多微生物对人体健康起到了重要作用，它 们不仅可以协助机体对营养物质的消化、吸收，而且可以对外来的病原微生物 产生免疫应答等作用以保护胃肠道环境的健康27,49。如何实现对人与动物胃 肠道内微生物菌群的平衡以及相关的基础理论问题的研究是当今科学界关注的 热点问题。刘威28 等在 2006 年的综述中指出肠道微生物与宿主之间是一种互 惠共生的关系，并且推测人肠道内的微生物一定会
38、通过宿主-微生物和微生物- 微生物之间的关系网显著地影响人类生物学特征。像生理学家描述人体普通器 官一样，有学者50 建议用 “微生物器官”(microbial organ)来描述肠道微生物菌群： 他由不同种类但彼此又相互联系，并与宿主细胞之间不断地进行信息交流的细 胞构成；他消耗、存储和重新分布能量；他生理性地调控重要化学物质转化； 他通过自我复制来维持和修复自身。 通常，人们简单地用偏利共栖 (commensalism), 而不是互惠共生(mutualism)来描述宿主和肠道微生物之间共生 关系, 这反映出人类在这方面认识不足, 尚未意识到宿主与肠道微生物之间的密 切关系, 以及肠道微生物
39、对维持人类健康和正常菌落稳定的巨大贡献50-52 。 到目前为止，人们已经认识到只要胃肠道内微生物菌群处于健康的平衡状态， 人类机体的健康就能够得到保障。而一旦这些肠道内的微生物平衡遭到破坏就 可能导致人体发生疾病，甚至危及生命29,31。 近年来国外学者大量研究和报道了 CGMP 的相关生理功能（如：双歧杆菌 增殖因子、抑制胃酸分泌、抑制病原体包括病毒和细菌等粘附至细胞、调节免 疫系统应答等），其生物学功能已经等到了科学家和相关企业的关注，将在生 物医药、功能食品以及专用食品的研究开发中为人类健康做出贡献。但是国内 外有关 CGMP 对肠粘膜内各类微生物区系的变化以及对肠道中微生物菌群的调
40、理作用方面的研究报道却很少。因此我们需要对其调理肠道微生物的具体功能 和机制作进一步的探讨。 1.5 课题研究的意义 肠道菌群与人体外部环境保持着一个平衡状态，对人体的健康起着重要作 用，但是这种平衡在某些情况下被打破，形成肠道菌群失调，从而引起多种疾 病，如：炎性肠病（IBD）、结肠癌、类风湿性关节炎、遗传过敏性皮炎、哮 喘等。近年来，随着科技的进步人们逐渐认识到肠道微生物对人类健康的重要 性。研究肠道中的基本微生态规律对纠正菌群失调、增强体质、提高健康水平、 发展相应的微生态制剂具有重要的理论价值和实践意义。近年来许多研究报道 显示CGMP有多种特殊的生物学活性，尤其是CGMP能够促进肠道
41、内双歧杆菌、乳 酸杆菌的增殖，但国内外关于CGMP对小鼠肠道菌群影响的体内试验研究报道 却很少。 综上所述，酪蛋白糖巨肽在抗菌、调节肠道免疫、促进肠道益生菌的增殖 等多方面都具有独特的生物学功能，作为功能性食品方面又很好的潜力。该研 究对乳中功能性成分在维持其微生态平衡，探讨肠道中微生物菌群与人类健康 的关系以及调理肠道中微生物菌群的平衡等方面将提供一定的理论依据，并为 其在功能性食品、医药或其它领域的应用方面奠定坚实的理论基础。 1.6 课题研究内容 本课题主要研究以下几项内容： 1.荧光原位杂交技术试验条件的优化 2.运用荧光原位杂交的方法检测灌胃CGMP前后小鼠肠道菌群的变化； 3.ER
42、IC-PCR图谱技术试验条件的优化 4.运用ERIC-PCR指纹图谱技术检测灌胃CGMP前后小鼠肠道菌群群落结构的变 化。 第二章 材料与方法 2.1 荧光原位杂交技术（FISH）分析 CGMP 对小鼠肠道菌群的影响 2.1.1 实验原料 CGMP 购自新西兰 Tatua Dairy Co-operative 公司 2.1.2 主要化学试剂 倒置荧光显微镜（Nikon，日本） ；杂交缓冲液（0.9MNacl，20mMTris- Hcl，pH=7.2 ，0.1%SDS ， 30%（V/V）的甲酰胺，10%（w/v）的硫酸葡聚糖） ； 漂洗缓冲液（0.9MNacl， 20mMTris-Hcl，pH
43、=7.2 ） ； PBS（ 130mMNacl，3mMNaH 2PO4.2H2O，7mMNa 2HPO4.12H2O，pH=7.2） ；荧 光探针（其中 EUB 338 探针 3末端标记 FITC 荧光染料， Enter1432、Bif164、ENF 191、Lacb722 探针 3末端标记 ROX 荧光染料， Invitrogen，美国） ；多聚赖氨酸防脱玻片、RNase-free 盖玻片(博士德生物工程 有限公司) 表2-1 16S rRNA探针序列 Table 2-1 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes Probe OPD-code Prob
44、e sequence（5to3） Target organism Reference EUB 338 S-D-Bact-0338-a-A-18 GCTGCCTCCCGTAGGAGT All Bacteria 23 Enter1432 S-G-Enter-1432-a-A-15 GTTTTGCAACCCACT Enterobacteriaceae 24 Bif164 S-G-Bif-0164-b-A-18 CATCCGGYATTACCACCC Bifidobacterium 25 Lacb722 S-G-Lacto-722-a-A-25 YCACCGCTACACATGRAGTTCCACT Lac
45、tobacillus group 26 ENF 191 S-G-ENF-191-a-A-13 GAAAGCGCCTTTCACTCTTATGC Enterococcus faecalis 27 注：R=G/A, Y=T/C, M=A/C, K= G/T, S= G/C, W= A/T, H=A/C/T, B=G/T/C, V=G/C/A, D=G/A/T, N=G/A/T/C. 2.1.3 试验动物及分组： 实验动物：2530g 健康的 BALB/c 雄性小鼠，购自中国人民解放军军事 医学科学实验动物中心，合格证号为：0038134。将实验动物适应饲养一周后随 机分成 2 组。其中对照组每天早上
46、灌胃 0.2ml 生理盐水，CGMP 组每天早上灌胃 0.2ml 浓度为 0.5mg/ml 的 CGMP，灌胃周期为 2 周。 表 2-2 实验动物的分组设置 组别 试验项目 对照组 生理盐水 0.2ml/d 剂量组 0.5mg/ml 的 CGMP0.2ml/d 2.1.4 试验仪器： 表 2-3 实验仪器设备清单 仪器名称与型号 生产厂家 三洋全自动灭菌锅 日本三洋公司 DS-5MC 倒置荧光显微镜 日本尼康公司 新飞 BCD-2080 冰箱 新飞电器有限公司 高速冷冻离心机 美国 Sigma 公司 微滤装置 Pall-Gelman Laboratory 超净工作台 苏州净化设备有限公司 核
47、酸电泳仪 北京六一 PCR 仪 pH 酸度计 雷磁 SHP-205B 生化培养箱 天津天宇实验仪器有限公司 国华 250 生化培养箱 深圳天南海北公司 MGC-250 光照培养箱 上海一恒科技有限公司 微型漩涡混合仪 上海沪西分析仪器厂有限公司 JA4103 电子天平 上海精天电子仪器有限公司 HH-S11-2 电热恒温水浴锅 北京长安科学仪器厂 微量进样器 芬兰 Biohit 公司 Olympus CX31 可拍照显微镜 日本 OLYMPUS 公司 2.1.5 试验方法 2.1.5.1 FISH 试验杂交条件的优化 本试验以 EUB338 探针为例针对杂交温度、探针浓度以及溶菌酶的浓度设 计
48、了 3 因素 3 水平正交试验以及拟水平法正交试验设计以求得杂交的最佳条件。 表 2-4 因素 水平 1 2 3 杂交温度 A() 46 48 50 探针浓度 B( ng/ul ) 5 10 20 溶菌酶浓度 C( mg/ ml ) 10 30 50 表 2-5 拟水平法正交试验设计 因素 水平 1 2 3 杂交温度 A() 48 50 48 探针浓度 B( ng/ul ) 20 25 30 溶菌酶浓度 C( mg/ ml ) 1 5 10 2.1.5.2 FISH 技术分析 CGMP 对小鼠肠道菌群的影响28 （1）粪便样品采集及前处理： 分别在试验的第 0、4、7、10、15 天采集两组小鼠新鲜粪便置于密封的无 菌厌氧带袋，存于冰盒中，并尽可能早地进行处理。将无菌采集的粪便样品 0.3g 置于 5mL 离心管(RNase-free)中，然后加入于 2.7mL PBS（0.22um 大小的 膜过滤）中，充分震荡混匀。然后将上述粪便样品 4下 700g 离心 2min 以除 去粪便中的残渣部分。 （2） 固定： 取 1ml 上述离心上清液置于 3ml 新鲜配置的 4%的 PFA 液（多聚甲醛溶于 PBS， 0.22um 的膜过滤处理） ，4固定约 16h（如果不及时进行杂交的话-20 保存在 5
