1、文件类型：技术标准 生效日期：2015.10.22 文件编码：TS-VP-4201-00 页数：1/21佛山市华普生药业 有限公司 人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案 人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案 起草 部门：QC 组 签名： 日期： 部门：QC 组 签名： 日期： 审核 部门：质量部 签名： 日期： 批准 质量负责人 签名： 日期： 质量部 颁发 本文件根据需要应分发于以下部门： 01 质量部 下表用于记录修订/变更主要内容及历史。 文件编号 修订原因 修订日期 TS-VP-4201-00 按 GMP（2010 年修订版）要求新制定 2015.10.22 文件类型：
2、技术标准 生效日期：2015.10.22 文件编码：TS-VP-4201-00 页数：2/21佛山市华普生药业 有限公司 人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案 目 录 1. 概述 2. 验证目的和范围 3. 组织及职责 4. 验证进度计划表 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认 7.验证项目和验证方法 7.1 试验菌株 7.2 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备 7.3 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证-常规倾注平皿法 7.4 需氧菌总数检查方法验证离心沉淀-薄膜过滤法 7.5 控制菌检查方法验证离心
3、沉淀-薄膜过滤法 8.偏差与漏项控制 9.验证报告会审 文件类型：技术标准 生效日期：2015.10.22 文件编码：TS-VP-4201-00 页数：3/21佛山市华普生药业 有限公司 人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案 1. 概述 我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊，产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母 菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。参照中国药典2015 版四部附录 1105：微生物计 数法，以及 1106：控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。通过 验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用。 人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛
4、黄以及常用辅料成分，文献资料介绍甲硝唑 对细菌有抑菌特性，对霉菌和酵母菌无抑菌活性。甲硝唑在水中微溶，可以通过离心沉淀-薄膜过 滤法去除其对微生物生长的影响。本验证方案通过试验菌株的回收率测试，首先确认常规倾注平 皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用，则进一步验证可去除供试品 抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。 本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根 据验证结果判断是否符合验证标准。 2. 验证目的和范围 验证该产品的微生物限度检查方法的适用性，对其有效性进行评价，保证检验结果的可靠性。 本验证方案采用
5、 3 批按 GMP 要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊，进行微生物限度检查方法的验 证。 3.组织及职责 3.1 验证方案和验证报告的起草、审核、批准 验证方案由质量部 QC 组负责起草，由质量部审核，最终由质量负责人批准。验证方案实施完 成后，由 QC 组负责汇总微生物限度检查法验证的结果、撰写报告，由质量部审核，最终由质量负 责人批准报告。 3.2 验证方案的培训 验证方案在经质量负责人批准后， ，由 QC 组组长对本次验证实施的相关人员组织培训工作， 并将该次的培训记录归档。 3.3 验证方案实施过程中的变更和偏差 验证方案实施过程中如有变更和偏差，质量负责人应当组织进行评估并采取相应的控
6、制措施。 3.4 验证工作小组成员表 姓名 部门及职务 职 责 黄汉新 质量负责人/质量受权人 负责验证方案及报告的批准 胡建新 质量部 QA 组长 审核验证方案、审核验证报告并协调工作 曾凤敏 质量部 QC 组长 负责验证方案审核、实施、汇总报告及培训工 作 文件类型：技术标准 生效日期：2015.10.22 文件编码：TS-VP-4201-00 页数：4/21佛山市华普生药业 有限公司 人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案 刘红华 质量部 QC 负责验证方案起草、具体实施、报告工作 4. 验证进度计划表 本次微生物限度检查方法验证的计划安排时间是 2015 年 12 月至 2016
7、 年 1 月。 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 5.1.主要检验仪器设备确认表 序 号 仪器设备名称 型 号 编号 校准单位 校准日期 有效期至 1 电子天平 2 生化培养箱 3 生化培养箱 4 生化培养箱 5 立式压力蒸汽灭 菌锅 6 生物洁净安全柜 检查人/日期： 复核人/日期： 5.2.验证所需文件的确认表 文件名称 文件编码 是否有效版本 文件保存处 人工牛黄甲硝唑胶囊内控质量标准 是 否 质量部 人工牛黄甲硝唑胶囊检验操作规程 是 否 质量部 取样操作规程 是 否 质量部 微生物限度检查操作规程 是 否 质量部 微生物实验室清洁消毒操作规程 是 否 质量部 培养基的管理制
8、度 是 否 质量部 检定菌的保存、传代、使用、销毁 规程 是 否 质量部 LDZX-30FBS 立式压力压蒸汽灭菌器 操作规程 是 否 质量部 SPX-150B 生化培养箱操作规程 是 否 质量部 BHC-1300IIA/B3 生物洁净安全柜操 是 否 质量部 文件类型：技术标准 生效日期：2015.10.22 文件编码：TS-VP-4201-00 页数：5/21佛山市华普生药业 有限公司 人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案 作规程 JJ200 电子天平操作规程 是 否 质量部 检查人/日期： 复核人/日期： 6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认 6.1.试验菌种检查表 序
9、 号 菌 种 名 称 代 码 冻 干 菌 种批 号 来 源 1 金黄色葡萄球菌 CMCC（B）26003 中 国 食 品 药 品 检 定 研 究 院 2 铜绿假单胞菌 CMCC（B）10104 中 国 食 品 药 品 检 定 研 究 院 3 枯草芽孢杆菌 CMCC（B）63501 中 国 食 品 药 品 检 定 研 究 院 4 白色念珠菌 CMCC（F）98001 中 国 食 品 药 品 检 定 研 究 院 5 黑曲霉 CMCC（F）98003 中 国 食 品 药 品 检 定 研 究 院 6 大肠埃希菌 CMCC（B）44102 中 国 食 品 药 品 检 定 研 究 院 7 乙型副伤寒沙门菌
10、 CMCC（B）50094 中 国 食 品 药 品 检 定 研 究 院 检查人/日期： 复核人/日期： 6.2 试验所需的培养基检查 序号 名称 生产厂家 是否通过培养基适用性试验 批号 01 胰酪大豆胨液体培养基 北京三药科技开发公司 是 否 02 胰酪大豆胨琼脂培养基 北京三药科技开发公司 是 否 03 沙氏葡萄糖液体培养基 北京三药科技开发公司 是 否 04 沙氏葡萄糖琼脂培养基 北京三药科技开发公司 是 否 05 麦康凯液体培养基 北京三药科技开发公司 是 否 06 麦康凯琼脂培养基 北京三药科技开发公司 是 否 07 RV 沙门菌增菌液体培养基 北京三药科技开发公司 是 否 文件类型
11、：技术标准 生效日期：2015.10.22 文件编码：TS-VP-4201-00 页数：6/21佛山市华普生药业 有限公司 人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案 08 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基 北京三药科技开发公司 是 否 09 三糖铁琼脂培养基 北京三药科技开发公司 是 否 检查人/日期： 复核人/日期： 文件类型：技术标准 生效日期：2015.10.22 文件编码：TS-VP-4201-00 页数：7/21佛山市华普生药业 有限公司 人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案 6.3. 检验样品确认表 序号 品名 生产厂家 批号 规格 是否按 GMP要求生产 1 人工牛黄甲
12、硝唑 胶囊 佛山市华普生药业有限公司 甲硝唑 0.2g 人工牛黄 5mg 是 否 2 人工牛黄甲硝唑 胶囊 佛山市华普生药业有限公司 甲硝唑 0.2g 人工牛黄 5mg 是 否 3 人工牛黄甲硝唑 胶囊 佛山市华普生药业有限公司 甲硝唑 0.2g 人工牛黄 5mg 是 否 检查人/日期： 复核人/日期： 7.验证项目和验证方法 7.1 试验菌株 人工牛黄甲硝唑胶囊需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证所用的菌株为金黄色 葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉；控制菌检查方法验证所用的菌 株为大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌。试验菌株的传代次数不得超过 5 代，并采用适宜的菌
13、种保 藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。 7.2 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备 分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至 10ml 胰酪大豆胨液 体培养基中，3035培养 1824 小时，取此培养液 1ml 加 0.9无菌氯化钠溶液 9ml，采用 10 倍递增稀释法，稀释至 10-510 -7,制成 50100cfu/ml 的菌悬液备用。 接种白色念珠菌的新鲜培养物至 10ml 沙氏葡萄糖液体培养基中，2025培养 23 天，取 此培养液 1ml 加 0.9无菌氯化钠溶液 9ml，采用 10 倍递增稀释法，稀释至 10-510 -7，
14、制成 50100cfu/ml 的菌悬液备用。 接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面上，2025培养 57 天，直到获得丰富的 孢子。加入 35ml 含有 0.05%聚山梨酯 80 的 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸至无菌试 管中，取 1ml 加含有 0.05%聚山梨酯 80 的 0.9%无菌氯化钠溶液 9ml，采用 10 倍递增稀释法， 稀释至 10-510 -7，制成 50100cfu/m 的孢子悬液备用。 菌液制备后若在室温下放置，应在 2 小时内使用；若保存在 28，可在 24 小时内使用。 黑曲霉孢子悬液可保存在 28 ,在验证过的贮存期内使用。 验证时，对各试验菌的回收
15、率逐一进行验证。 7.3. 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证-常规倾注平皿法 7.3.1.供试液的制备 取供试品 10g，加 0.9%无菌氯化钠溶液至 100ml，振摇，制成 1：10 的供试液。 文件类型：技术标准 生效日期：2015.10.22 文件编码：TS-VP-4201-00 页数：8/21佛山市华普生药业 有限公司 人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案 7.3.2.试验组 取 1：10 的供试液 1ml 和 7.2 项下制备的 50100cfu 的试验菌，分别注入平皿中，立即倾注 不超过 45的胰酪大豆胨琼脂培养基 20ml 混匀，每株试验菌株平行制备 2 个平
16、皿。置 3035 培养箱中培养 3 天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养 5 天（白色念珠 菌、黑曲霉），点计菌落数。 另取 1：10 的供试液 1ml 和 7.2 项下制备的 50100cfu 的白色念珠菌、黑曲霉，分别注入平 皿中，立即倾注不超过 45的沙氏葡萄糖琼脂培养基 20ml 混匀，每株试验菌株平行制备 2 个平皿。 置 2025培养箱中培养 5 天，点计菌落数。 7.3.3.供试品对照组 取 1：10 的供试液 1ml 注入平皿中，立即倾注不超过 45的胰酪大豆胨琼脂培养基 20ml 混匀， 平行制备 2 个平皿。置 3035培养箱中培养 5 天，点计菌落数。
17、 另取 1：10 的供试液 1ml 注入平皿中，立即倾注不超过 45的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基 20ml 混匀，平行制备 2 个平皿。置 2025培养箱中培养 5 天，点计菌落数。 7.3.4.菌液对照组 取 0.9%无菌氯化钠溶液 1ml 和 7.2 项下制备的 50100cfu 的试验菌，分别注入平皿中，立即 倾注不超过 45的胰酪大豆胨琼脂培养基 20ml 混匀，每株试验菌株平行制备 2 个平皿。置 3035培养箱中培养 3 天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养 5 天 （白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。 另取 0.9%无菌氯化钠溶液 1ml 和 7.2 项下制备
18、的 50100cfu 的白色念珠菌、黑曲霉，分别注 入平皿中，立即倾注不超过 45的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基 20ml 混匀，每株试验菌株平行制 备 2 个平皿。置 2025培养箱中培养 5 天，点计菌落数。 7.3.5. 常规倾注平皿法方法验证的接受标准 试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值(即试验菌的回收率) 应在 0 .52 范围内。 7.3.6. 常规倾注平皿法方法验证的结果 7.3.6.1. 常规倾注平皿法测定需氧菌总数方法验证结果 试验次数 1： 人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：金
19、黄色葡萄球菌、铜绿假单 胞菌、枯草芽孢杆菌 3 天，白色念珠菌、黑曲霉 5 天 试验组 供试品对照组 菌液对照组 试验菌株 菌种 代数 1 2 均值 1 2 均值 1 2 均值 试验菌的回 收率 金黄色葡萄球菌 文件类型：技术标准 生效日期：2015.10.22 文件编码：TS-VP-4201-00 页数：9/21佛山市华普生药业 有限公司 人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 试验人/日期： 复核人/日期： 试验次数 2： 人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：金黄色葡
20、萄球菌、铜绿假单 胞菌、枯草芽孢杆菌 3 天，白色念珠菌、黑曲霉 5 天 试验组 供试品对照组 菌液对照组 试验菌株 菌种 代数 1 2 均值 1 2 均值 1 2 均值 试验菌的回 收率 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 试验人/日期： 复核人/日期： 试验次数 3： 人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单 胞菌、枯草芽孢杆菌 3 天，白色念珠菌、黑曲霉 5 天 试验组 供试品对照组 菌液对照组 试验菌株 菌种 代数 1 2 均值 1 2 均值 1 2 均值 试验菌的回
21、收率 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 试验人/日期： 复核人/日期： 7.3.6.2. 常规倾注平皿法测定霉菌与酵母菌总数方法验证结果 文件类型：技术标准 生效日期：2015.10.22 文件编码：TS-VP-4201-00 页数：10/21佛山市华普生药业 有限公司 人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案 试验次数 1： 人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：5 天 试验组 供试品对照组 菌液对照组 试验菌株 菌种 代数 1 2 均值 1 2 均值 1 2 均值 试验菌的回 收率 白色念
22、珠菌 黑曲霉 试验人/日期： 复核人/日期： 试验次数 2： 人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：5 天 试验组 供试品对照组 菌液对照组 试验菌株 菌种 代数 1 2 均值 1 2 均值 1 2 均值 试验菌的回 收率 白色念珠菌 黑曲霉 试验人/日期： 复核人/日期： 试验次数 3： 人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：5 天 试验组 供试品对照组 菌液对照组 试验菌株 菌种 代数 1 2 均值 1 2 均值 1 2 均值 试验菌的回 收率 白色念珠菌
23、 黑曲霉 试验人/日期： 复核人/日期： 7.3.7. 常规倾注平皿法测定需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数方法验证小结 按照验证方案的要求进行试验，若各试验菌株的回收率在 0.52 范围内，则可确认常规倾注 平皿法适用于本品的需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数检查。如常规倾注平皿法适用于霉菌与酵母 菌总数检查，但不适用于需氧菌总数检查，则下面进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀- 薄膜过滤法是否适用于本品的需氧菌总数检查。 7.4. 需氧菌总数检查离心沉淀-薄膜过滤法 7.4.1.供试液的制备 文件类型：技术标准 生效日期：2015.10.22 文件编码：TS-VP-4201-00 页数：11/21
24、佛山市华普生药业 有限公司 人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案 取供试品 10g，加 0.9%无菌氯化钠溶液至 100ml，振摇，制成 1：10 的供试液贮备液。取 1:10 的供试液贮备液 50ml，经 500 转/分钟离心 3 分钟，取上清液得供试液。 7.4.2.试验组 取供试液 1 ml，加至 100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜（孔径 0.45m 混合纤维素膜）后，以 0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜 2 次（100ml/次） ，然后在第 3 次冲洗液 （100ml0.9%无菌氯化钠溶液）中加入 7.2 项下制备的 50100cfu 的试验菌，过滤。每株
25、试验菌 株平行制备 2 张滤膜。取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上，3035倒置培养 3 天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养 5 天（白色念珠菌、黑曲霉）， 点计菌落数。 7.4.3.供试品对照组 取供试液 1 ml，加至 100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜（孔径 0.45m 混合纤维素膜）后，以 0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜 3 次（100ml/次） ，平行制备 2 张滤膜。取出 滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上，3035倒置培养 5 天，点计菌落数。 7.4.4.菌液对照组 取 0.9%无菌氯化钠溶液 300 ml，20
26、0ml 通过薄膜（孔径 0.45m 混合纤维素膜）后，在余下 的 100ml0.9%无菌氯化钠溶液中加入 7.2 项下制备的 50100cfu 的试验菌，过滤。每株试验菌株 平行制备 2 张滤膜。取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上，3035倒置培养 3 天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养 5 天（白色念珠菌、黑曲霉）， 点计菌落数。 7.4.5.稀释剂对照组 依照 7.2 项下菌液制备方法，以 0.9%无菌氯化钠为稀释液，将各菌液稀释至含菌 50100cfu/ml，然后以 500 转/分钟离心 3 分钟，取上层菌液作下面的试验。 取上层菌液 1 ml，加至 1
27、00 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜（孔径 0.45m 混合纤维素膜）后，以 0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜 3 次（100ml/次） ，每株试验菌株平 行制备 2 张滤膜。取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上，3035倒置培养 3 天 （金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养 5 天（白色念珠菌、黑曲霉），点 计菌落数。 7.4.6. 离心沉淀-薄膜过滤法测定需氧菌总数方法验证的接受标准 试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值(即试验菌的回收率) 应在 0 .52 范围内，同时稀释剂对照组与菌液对照组菌落数的比值应也在 0
28、.52 范围内。 7.4.7.离心沉淀-薄膜过滤法测定需氧菌总数方法验证的结果 试验次数 1： 人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单 文件类型：技术标准 生效日期：2015.10.22 文件编码：TS-VP-4201-00 页数：12/21佛山市华普生药业 有限公司 人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案 胞菌、枯草芽孢杆菌 3 天，白色念珠菌、黑曲霉 5 天 试 验 组 供 试 品 对 照 组 菌 液 对 照 组 稀 释 剂 对 照 组 试 验 菌 株 菌 种 代 数 1 2 均 值 1 1
29、2 均 值 1 2 均 值 试 验 组 各 菌 株 回 收 率 稀 释 剂 对 照 组 各 菌 株 回 收 率 金 黄 色 葡 萄 球 菌 铜 绿 假 单 胞 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 白 色 念 珠 菌 黑 曲 霉 试验人/日期： 复核人/日期： 试验次数 2： 人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单 胞菌、枯草芽孢杆菌 3 天，白色念珠菌、黑曲霉 5 天 文件类型：技术标准 生效日期：2015.10.22 文件编码：TS-VP-4201-00 页数：13/21佛山市华普生药业 有限公司 人工牛黄甲
30、哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案 试 验 组 供 试 品 对 照 组 菌 液 对 照 组 稀 释 剂 对 照 组 试 验 菌 株 菌 种 代 数 1 2 均 值 1 1 2 均 值 1 2 均 值 试 验 组 各 菌 株 回 收 率 稀 释 剂 对 照 组 各 菌 株 回 收 率 金 黄 色 葡 萄 球 菌 铜 绿 假 单 胞 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 白 色 念 珠 菌 黑 曲 霉 试验人/日期： 复核人/日期： 试验次数 3： 人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单 胞菌、枯草芽孢杆菌 3 天，
31、白色念珠菌、黑曲霉 5 天 文件类型：技术标准 生效日期：2015.10.22 文件编码：TS-VP-4201-00 页数：14/21佛山市华普生药业 有限公司 人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案 试 验 组 供 试 品 对 照 组 菌 液 对 照 组 稀 释 剂 对 照 组 试 验 菌 株 菌 种 代 数 1 2 均 值 1 1 2 均 值 1 2 均 值 试 验 组 各 菌 株 回 收 率 稀 释 剂 对 照 组 各 菌 株 回 收 率 金 黄 色 葡 萄 球 菌 铜 绿 假 单 胞 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 白 色 念 珠 菌 黑 曲 霉 试验人/日期： 复核人/日期： 7.
32、4.8. 离心沉淀-薄膜过滤测定需氧菌总数方法验证小结 按照验证方案的要求进行试验，若试验组各试验菌株的回收率在 0.52 范围内，稀释剂对照 组各试验菌株的的回收率也在 0.52 范围内，则可确认离心沉淀-薄膜过滤法适用于本品的需氧 菌总数检查。人工牛黄甲硝唑胶囊照此验证过的供试液制备方法及计数方法进行需氧菌总数计数。 7.5.控制菌检查方法验证离心沉淀-薄膜过滤法 若在 7.3 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证-常规倾注平皿法的试验中，证实 了人工牛黄甲硝唑胶囊有抑菌性，不能使用常规倾注平皿法进行需氧菌总数检查，则为了确保控 制菌检查的可靠性，采用可去除供试品抑菌物质的离心沉淀
33、- 薄膜过滤法进行控制菌检查，按照以 下方案进行方法学验证。 7.5.1 试验菌株 人工牛黄甲硝唑胶囊质量标准中规定检查的控制菌为大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌，所以 选择这两种菌株进行控制菌检查的方法学验证。试验菌株的传代次数不得超过 5 代，并采用适宜 的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。 7.5.2 控制菌检查方法验证的菌液制备 文件类型：技术标准 生效日期：2015.10.22 文件编码：TS-VP-4201-00 页数：15/21佛山市华普生药业 有限公司 人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案 分别接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌的新鲜培养物至 10ml 胰酪大
34、豆胨液体培养基中， 3035培养 1824 小时，取此培养液 1ml 加 0.9无菌氯化钠溶液 9ml，采用 10 倍递增稀释法， 稀释至 10-510 -7,制成 50100cfu/ml 的菌悬液备用。 菌液制备后若在室温下放置，应在 2 小时内使用；若保存在 28，可在 24 小时内使用。 验证时，对各试验菌的回收率逐一进行验证。 7.5.3 大肠埃希菌检查方法验证 7.5.3.1 供试液的制备 取供试品 10g，加 0.9%无菌氯化钠溶液至 100ml，振摇，制成 1：10 的供试液贮备液。取 1:10 的供试液贮备液 50ml，经 500 转/分钟离心 4 分钟，取上清液得供试液。 7
35、.5.3.2.试验组 取供试液 10ml，加至 100 ml0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜后，以 0.9%无菌氯 化钠溶液冲洗滤膜 2 次（100ml/次） ，然后在第 3 次冲洗液（100ml0.9%无菌氯化钠溶液）中加入 7.5.2 项下制备的 50100cfu 的大肠埃希菌，过滤。取膜接种至 100ml 胰酪大豆胨液体培养基中， 混匀，3035培养 1824 小时。 取上述增菌培养物 1ml 接种至 100ml 麦康凯液体培养基中,4244培养 2448 小时。 取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，3035培养 1872 小时。麦康 凯琼脂培养基平板上应有大
36、肠埃希菌典型菌落生长。 7.5.3.3 阳性对照组 照 7.5.2 项下菌液制备方法，以 0.9%无菌氯化钠为稀释液，将大肠埃希菌液稀释至含菌 50100cfu/ml，然后以 500 转/分钟离心 3 分钟，取上层菌液作下面的试验。 取上层菌液 1 ml，加至 100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜（孔径 0.45m 混合纤维素膜）后，以 0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜 3 次（100ml/次） 。取膜接种至 100ml 胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，3035培养 1824 小时。 取上述增菌培养物 1ml 接种至 100ml 麦康凯液体培养基中,4244培养 2448 小
37、时。 取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，3035培养 1872 小时。麦康 凯琼脂培养基平板上应有大肠埃希菌典型菌落生长。 7.5.3.4 阴性对照组 取 0.9%无菌氯化钠溶液 300 ml，全量通过薄膜（孔径 0.45m 混合纤维素膜）后，取膜接种 至 100ml 胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，3035培养 1824 小时。阴性对照应无菌生长。 7.5.3.5 离心沉淀-薄膜过滤法测定大肠埃希菌方法验证结果 文件类型：技术标准 生效日期：2015.10.22 文件编码：TS-VP-4201-00 页数：16/21佛山市华普生药业 有限公司 人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查
38、方法验证方案 试验次数 1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: 大肠埃希菌对照菌来源 批号（菌种编号） 过程 增菌培养 选择培养 分离培养 培养基 胰酪大豆胨液体培养基 配制批号 麦康凯液体培养基 配制批号 麦康凯琼脂培养基 平板 配制批号 培养箱 型号 编号 温度 型号 编号 温度 型号 编号 温度 培养时间 开始 月 日 时 结束 月 日 时 开始 月 日 时 结束 月 日 时 开始 月 日 时 结束 月 日 时 结果判断 试验组 阳性 对照组 阴性 对照组 试验人/日期： 复核人/日期： 试验次数 2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: 大肠埃希菌对照菌来源 批号（菌种编号） 过程 增菌培养 选择培养 分离
39、培养 培养基 胰酪大豆胨液体培养基 配制批号 麦康凯液体培养基 配制批号 麦康凯琼脂培养基 平板 配制批号 培养箱 型号 编号 温度 型号 编号 温度 型号 编号 温度 培养时间 开始 月 日 时 结束 月 日 时 开始 月 日 时 结束 月 日 时 开始 月 日 时 结束 月 日 时 结果判断 试验组 阳性 对照组 阴性 对照组 试验人/日期： 复核人/日期： 文件类型：技术标准 生效日期：2015.10.22 文件编码：TS-VP-4201-00 页数：17/21佛山市华普生药业 有限公司 人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案 试验次数 3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: 大肠埃希菌对照
40、菌来源 批号（菌种编号） 过程 增菌培养 选择培养 分离培养 培养基 胰酪大豆胨液体培养基 配制批号 麦康凯液体培养基 配制批号 麦康凯琼脂培养基 平板 配制批号 培养箱 型号 编号 温度 型号 编号 温度 型号 编号 温度 培养时间 开始 月 日 时 结束 月 日 时 开始 月 日 时 结束 月 日 时 开始 月 日 时 结束 月 日 时 结果判断 试验组 阳性 对照组 阴性 对照组 试验人/日期： 复核人/日期： 7.5.3.6 大肠埃希菌检查方法验证结果小结 按照验证方案的要求进行试验，若试验组与阳性对照组均检出典型大肠埃希菌，阴性对照组 无菌生长，则可确认离心沉淀-薄膜过滤法适用于本品
41、的大肠埃希菌检查。人工牛黄甲硝唑胶囊照 此验证过的供试液制备方法及大肠埃希菌检查方法进行检查。 7.5.4 沙门菌检查方法验证 7.5.4.1 供试液的制备 取样品 10g 加 0.9%无菌氯化钠溶液至 100 ml 制成 1:10 的供试液。取全部供试液经 500 转/ 分钟离心 4 分钟，取全部上清液为供试液。 7.5.4.2.试验组 取全部供试液，加至 100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜后，以 0.9%无菌 氯化钠溶液冲洗滤膜 2 次（100ml/次） 。然后在第 3 次冲洗液（100ml0.9%无菌氯化钠溶液）中加 入 7.5.2 项下制备的 50100cfu
42、的乙型副伤寒沙门菌，过滤。取膜接种至 200ml 胰酪大豆胨液体 培养基中，混匀，3035培养 1824 小时。 取上述增菌培养物 0.1ml 接种至 10mlRV 沙门增菌液体培养基,3035培养 1824 小时。 取少量 RV 沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上， 3035培养 1848 小时。 沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上应生长良好，菌落为淡红色或无色、透明 或半透明、中心有或无黑色。 用接种针挑选出木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上的典型菌落，于三糖铁琼脂培养基 文件类型：技术标准 生效日期：2015.10.22 文件编码：TS-VP-
43、4201-00 页数：18/21佛山市华普生药业 有限公司 人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案 高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养 1824 小时。 7.5.4.3 阳性对照组 照 7.5.2 项下菌液制备方法，以 0.9%无菌氯化钠为稀释液，将乙型副伤寒沙门菌液稀释至含 菌 50100cfu/ml，然后以 500 转/分钟离心 3 分钟，取上层菌液作下面的试验。 取上层菌液 1 ml，加至 100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜（孔径 0.45m 混合纤维素膜）后，以 0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜 3 次（100ml/次） 。取膜接种至 200ml 胰酪大
44、豆胨液体培养基中，混匀，3035培养 1824 小时。 取上述增菌培养物 0.1ml 接种至 10mlRV 沙门增菌液体培养基,3035培养 1824 小时。 取少量 RV 沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上， 3035培养 1848 小时。 沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上应生长良好，菌落为淡红色或无色、透明 或半透明、中心有或无黑色。 用接种针挑选出木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上的典型菌落，于三糖铁琼脂培养基 高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养 1824 小时。 7.5.4.4 阴性对照组 取 0.9%无菌氯化钠溶液 300 ml，全量
45、通过薄膜（孔径 0.45m 混合纤维素膜）后，取膜接种 至 200ml 胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，3035培养 1824 小时。阴性对照应无菌生长。 7.5.4.5 离心沉淀-薄膜过滤法测定乙型副伤寒沙门菌方法验证结果 文件类型：技术标准 生效日期：2015.10.22 文件编码：TS-VP-4201-00 页数：19/21佛山市华普生药业 有限公司 人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案 试验次数 1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: 乙型副伤寒沙门菌对照菌来源 批号（菌种编号） 过程 增菌培养 选择培养 分离培养 培养 基 胰酪大豆胨液 体培养基 配制批号 RV 沙门增菌液 体培养基 配
46、制批号 木糖赖氨酸脱氧胆酸 盐琼脂培养基 平板 配制批号 三糖铁琼脂培养基斜 面和高层穿刺接种 配制批号 培养 箱 型号 编号 温度 型号 编号 温度 型号 编号 温度 型号 编号 温度 培养 时间 月 日 时 至 月 日 时 月 日 时 至 月 日 时 月 日 时 至 月 日 时 月 日 时 至 月 日 时 结果判 断 试验 组 阳性 对照 组 阴性 对照 组 试验人/日期： 复核人/日期： 试验次数 2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: 乙型副伤寒沙门菌对照菌来源 批号（菌种编号） 过程 增菌培养 选择培养 分离培养 培养 基 胰酪大豆胨液 体培养基 配制批号 RV 沙门增菌液 体培养基 配制批号 木糖赖氨酸脱氧胆酸 盐琼脂培养基 平板 配制批号 三糖铁琼脂培养基斜
