肿瘤细胞与分化、凋亡一.ppt

1、肿瘤细胞与分化、凋亡 (一 ) 源于一位权威专家的课件，和大家 一起分享 前 言 大量研究证明，肿瘤的发生是多因素、多阶段、多基因大量研究证明，肿瘤的发生是多因素、多阶段、多基因 共同作用的结果。其特点是多因素（环境因素，如物理、化共同作用的结果。其特点是多因素（环境因素，如物理、化 学、生物等；机体因素，如遗传、免疫、年龄与性别等）交学、生物等；机体因素，如遗传、免疫、年龄与性别等）交 互作用，有的起致癌作用，即诱导细胞恶性转化，有的起促互作用，有的起致癌作用，即诱导细胞恶性转化，有的起促 癌作用。肿瘤的发生发展经历了启动、促发、侵袭、转移等癌作用。肿瘤的发生发展经历了启动、促发、侵袭、转移

2、等 阶段。并且，各阶段都可能发生多种癌基因激活、抑癌基因阶段。并且，各阶段都可能发生多种癌基因激活、抑癌基因 失活。表现为失活。表现为 增生过度、分化异常、凋亡受阻增生过度、分化异常、凋亡受阻 。 长期以来，长期以来， “细胞一旦癌变后，就永远是癌细胞细胞一旦癌变后，就永远是癌细胞 ”的的 观点一直统治着肿瘤学领域，即恶性肿瘤是不能逆转的观点一直统治着肿瘤学领域，即恶性肿瘤是不能逆转的 。在这种思想指导下，传统的肿瘤治疗不外乎外科手术。在这种思想指导下，传统的肿瘤治疗不外乎外科手术 切除、化疗、放射或免疫治疗。切除、化疗、放射或免疫治疗。 1971年，年， Friend报告小报告小 鼠红白血病

3、细胞（鼠红白血病细胞（ MEL）可被二甲基亚砜（）可被二甲基亚砜（ DMSO）诱）诱 导分化，开创了肿瘤细胞分化研究的先河。目前，诱导导分化，开创了肿瘤细胞分化研究的先河。目前，诱导 肿瘤细胞分化的已经成为重要研究前沿。肿瘤细胞分化的已经成为重要研究前沿。 细胞分化与肿瘤 一、肿瘤细胞诱导分化的有关概念 1. 分化 (differentiation） 细胞分化是指幼稚的胚胎细胞生长发育为各 种不同形态结构和功能代谢的成熟细胞的过程。 如人起源于一个受精卵，通过细胞分裂形成内、 中、外三个胚层细胞。 2. 反分化 (retro-differentiation) 又称去分化 (dedifferen

4、tiation)，肿瘤的反分化 是指细胞恶变后，细胞的多种表型又回到胚胎细胞 表型的现象 。 恶性肿瘤细胞表现分化异常，不成熟 。 3.再分化 （ redifferentiation） 又称逆转 （ reversion）， 它是指在分化诱 导剂的作用下，恶性肿瘤细胞被诱导而重新向 正常细胞的方向演变分化，表现为形态学、生 物学、生物化学等诸多指标均向正常细胞接近 ，甚至完全转变为正常细胞。 二、分化诱导剂 1.内源性分化诱导剂 内源性分化诱导剂是由肿瘤或宿主细胞产生的具有分化 诱导作用的化学物质。它有以下几种： 集落刺激因子（ CSF）： 分为 CSF-M和 CSF-G； 粒细胞巨噬细胞分化因

5、子（ GM DF） ； 类固醇类化合物：如糖皮质激素和 1， 25-（ OH） 2-vitD3 ； 细胞因子 :如 TNF-和 INF-； 糖脂 :如神经节苷脂 GM3； 其它，如 cAMP等。 2.外源性分化诱导剂 可分为以下几类： 无机化合物：亚硒酸钠等。 简单的有机化合物：正丁酸、二甲基亚砜 (DMSO)、 六次 甲基二乙酰胺 (HMBA)等。 维生素 A类化合物：维甲酸、 AM80、 芳维甲等。 佛波酯类化合物： 12-O-十四酯酰佛波 -13-乙酸 (TPA)。 抗生素类：放线菌素 D、 丝裂霉素等； 抗癌药： 6-巯基嘌呤、 5-氮胞嘧啶等。 三 、诱导肿瘤分化的研究 1.体外分化

6、诱导模型 (1)白血病细胞分化诱导模型 最常用的是急性 髓性 白血病细胞株 HL-60。 它在分化诱导 剂作用下可出现分化表型如形态上由早幼粒白血病细胞分化为 中、晚幼粒、杆状核细胞和分叶核细胞，生化方面出现硝基蓝 四氮唑还原性（ NBT）， 功能方面出现吞噬活性及趋化性，生 物学方面丧失了在软琼脂培养基上形成集落及裸鼠体内移植成 活的能力。 (2)实体瘤分化诱导模型实体瘤分化诱导模型 人胃癌分化诱导模型 国内外有人用 DMSO、 HMBA、 suramin、维甲酸、大蒜油及大蒜与其烯丙基硫化合物等处 理胃癌细胞株时，癌细胞在形态结构、功能代谢和生物学 等方面均出现分化特征。 人神经母细胞瘤分

7、化诱导实验 在正丁酸、苯丁酸及其盐 类作用后，瘤细胞可形成树突状结构，功能上能产生神经 递质合成酶，生物学上其致瘤性明显降低，表现出分化的 特点。 人粘液表皮样癌分化诱导实验 MEC-1细胞是上皮样细 胞，体外增殖迅速，形态异型性明显，裸鼠体内成瘤性，在 HMBA的作用下出现分化表型：生长抑制、核异型性降低、 表面微绒毛减少、胞浆内粗面内质网增加和出现特征性的成 熟分泌颗粒、 DNA含量减少及倍体趋向二倍体等。 其它实体瘤分化诱导模型 其它实体瘤如黑色素瘤、肝癌、 前列腺癌、胶质母细胞瘤、肺癌等均有报道。 2.体内分化诱导模型 目前，体内分化诱导尚无理想的模型。人白血病细胞 一般采用小鼠腹腔扩

8、散法及裸鼠皮下移植法 ;人实体瘤采用 小鼠肾包膜下移植和裸鼠移植建立分化诱导模型。分化诱导 效果主要根据肿瘤生长抑制和荷瘤鼠生命延长，细胞标记酶 、抗原以及形态的变化来判断。国内用 NB4细胞株建立了 SCID小鼠人 APL腹水细胞模型，在 ATRA作用下能发生分化 ，如明显提高 NBT还原率和 CD11b的表达，小鼠的生存期明 显延长。该模型的建立是评价新的或已有的治疗 APL药物和 临床前期实验研究的理想模型。 3.分化诱导的临床试验 尽管诱导分化研究取得了成绩，但其最终目的是能应用 于临床， ATRA治疗 APML能有效地达到临床缓解，被认为是 人类恶性肿瘤分化治疗的成功典范。 ATRA

9、能诱导 APL病人恶 性肿瘤细胞分化成熟，口服 ATRA可使大多数患者达到完全临 床缓解，即使是传统化疗失败后亦是如此。在欧洲的随机实验 证实， ATRA加化疗比单用化疗方案能明显降低复发率和延长 生存期。 四、诱导肿瘤细胞分化的调控机制 1.核内受体途径 维甲类化合物诱导肿瘤细胞分化主要通过核内受体途径。 维甲酸受体 (RAR)是广泛存在各种组织细胞核内的一类受体蛋 白，有 RARS和 RXRS两类，每一类又有 、 、 三种类型，比 较其 DNA序列和结构特点，二者属于类固醇 -甲状腺素 -vitD3受 体在内的核内受体超家族。在细胞液内存在 RA结合蛋白 ，能将 RA从细胞浆运输到核内染色

10、体上的受体部位，自身则释放回到 胞浆。 RA经胞质内 RA结合蛋白运输到染色体上的受体部位，与 核受体以二聚体形式结合某些靶序列，进而引起特定基因的转 录激活或转录抑制来诱导细胞分化。 Manfredini 等用 ATRA和 vitD3诱导白血病母细胞分化 实验中发现， M0、 M1对二者不敏感， M3在 ATRA诱导下向 粒细胞方向分化， M2则在二者诱导下向单核细胞分化。进 一步研究方发现， ATRA和 vitD3有效地增加核内 VDR， VDR与 RXR形成二聚体，再结合到 DR3型 VD反应元件，从 而激活 VD反应元件调控的报告基因的转录，启动了 M2向 单核细胞方向分化。 2. 影

11、响基因转录 Naka 等用 9-cis-维甲酸诱导胃癌细胞株分化研究中，发现 大多数胃癌细胞株能合成 RARs和 RXRs mRNA，其中一些 细胞株并不停滞于 G0/G1期，但可一过性增加 p21WAF1 蛋白 表达，降低 CDK7、 EGFR及 cyclinD蛋白量，减少 Rb基因产 物磷酸化。认为 9-cis-维甲酸抑制细胞生长是通过调控细胞 周期，影响维甲酸受体 mRNA转录来实现的。 Okabe 发现 TPA可诱导 Ph阳性白血病细胞 MC3向巨核细 胞系分化，血小板糖蛋白 GP b表达增强， GP b mRNA水平 增高，处理组有 GATA-1表达，而 GATA-3不表达，未处理组

12、仅 GATA-2转录。 TPA则通过影响 GP b及 GATAs转录来诱导 MC3细胞分化。 Garingo在诱导 MEL分化中发现红细胞特异性基因转录活 化， PKA缺陷时则转录出现障碍。转录因子 NF-E2是提高球蛋 白位点控制区活性的必须成分。 DNA与 NF-E2结合， -球蛋白 位点控制区增强子活性在 PKA缺陷细胞中明显低于具有 PKA活 性的细胞， PKA对转录因子的调控影响了红细胞特异基因转录 而诱导 MEL细胞分化。 研究表明，染色质重塑在基因转录调控中有重要作用， 而组蛋白乙酰化、去乙酰化修饰是影响染色质重塑的重要因 素。我们前期研究的基础上，建立人胃癌 MGC803细胞裸

13、鼠 移植瘤模型，以被证实有显著诱导肿瘤细胞分化的药物丁酸 钠（ Sodium butyrate, SB）为阳性对照，观察 DADS（ diallyl disulfide）在体内外诱导 MGC803细胞分化时，对其核组蛋白 乙酰化表达的调控作用，以及二者之间的关系，进一步探讨 DADS对 MGC803细胞抑制和诱导分化的作用机理。 H3 -actin DADS(mgL-1): 15 30 60 30 SB(mM) : 5 5 DADS对体外培养 MGC803细胞组蛋白乙酰化的影响 H4 -actin DADS(mgL-1) : 15 30 60 30 SB(mM) : 5 5 DADS对体外培养

14、 MGC803细胞组蛋白乙酰化的影响 p21WAF1 -actin 处理时间 （ h） : 12h 24h 12h 24h 12h 24h 12h 24h DADS(mgL-1) : 0 0 15 15 30 30 60 60 DADS对 MGC803细胞 p21WAF1 蛋白表达的影响 DADS对各组移植瘤组织中乙酰化组蛋白表达的影响 H3 -actin 各处理因素 ： NS SB DADS DADS DADS 浓度 (mgkg-1)： 66 50 100 200 H4 -actin 各处理因素 ： NS SB DADS DADS DADS 浓度 (mgkg-1)： 66 50 100 20

15、0 DADS对移植瘤细胞 p21WAF1 表达的影响 p21WAF1 -actin 各处理因素 ： NS SB DADS DADS DADS 浓度 (mgkg-1) ： 66 50 100 200 3. 对癌基因和抑癌基因的影响 细胞的基因控制细胞的生长与分化，而这些基因的变化 则影响基因的表达或功能被认为是癌变的主要原因。 Ras基因 在细胞内有 H-， K-， N-Ras，编码分子量为 21kd的蛋白， p21Ras蛋白具有 GTP酶活性。 Ras能使 3T3细胞恶性转化，促 使细胞增殖。 C-myc过表达可以促进基因转录和细胞分裂，与 肿瘤的形成关系密切。 P53基因编码 P53蛋白，

16、P53蛋白有野生 型和突变型，野生型 P53基因具有抑制细胞增殖和转化的作用 。 李晓光等用大蒜油诱导 MGC803细胞分化和凋亡研究 中，发现处理组细胞形态接近正常细胞，细胞的致瘤性明显 下降， Northern杂交有 P53和 P21表达增强，提示大蒜油通 过促进抑癌基因 P53、 P21的表达，抑制细胞恶性增殖、诱 导凋亡和促进细胞分化。 王代树等用 HMBA诱导 MGC803细胞分化时发现 C-myc 和 C-H-ras表达抑制。 Naka 用 9-顺 -维甲酸诱导胃癌细胞分 化时则有 P21蛋白一过性增加。 这些基因在诱导癌细胞分化过程中的改变进一步影响其 调控的基因表达而实现瘤细胞

17、分化的效应。 我们发现， DADS作用下， MGC803细胞明显抑制，且呈 剂量 -效应依赖关系；瘤细胞对 Con A的凝集率、 集落形成率 与 ALP比活性下降；瘤细胞异形性降低，核浆比下降，细胞表 面微绒毛数目减少，胞浆内细胞器丰富，胞核及部分细胞器呈 退行性变，可见细胞间连接结构；细胞骨架蛋白合成增加与重 组，细胞间缝隙连接通讯功能恢复，提示 DADS可诱导 MGC803细胞分化。 DADS处理后的 MGC803细胞 S期细胞含 量减少， G2期细胞含量增加，细胞停滞于 G2期， p21WAF1 、 Rb 表达增强， p21ras、 c-Myc、 突变型 p53表达减弱。 MTT比色实验

18、结果比色实验结果 .DADS对对 MGC803细胞生长的影响细胞生长的影响 倒置显微镜观察 MGC803细胞（ 20） DADS组 （ 20） 普通光镜观察 MGC803细胞 HE （ 20） DADS处理组 HE（ 20） 电镜观察 微绒毛是良恶性细胞区分的重要标志之一，本实验通过 透射电镜和 Con A凝集性实验证实了 MGC803细胞在 DADS 处理后，细胞表面微绒毛明显减少，对 Con A的凝集率下降 ，表明 MGC803细胞生物学行为表现出恶性性下降。 未处理组 MGC803细胞核浆比例大，核仁均质，以 1-2个 核仁细胞为主；胞质内细胞器稀少，细胞分化程度低。 DADS处理的 M

19、GC803细胞表面微绒毛减少，细胞核浆 比例下降，胞质内细胞器丰富，有散在的核糖体，细胞核和 线粒体水肿退变，细胞之间有腺腔结构形成并可见细胞间连 接结构，细胞分化好 。 MGC803细胞 核浆比例大， 核畸形，线粒 体水肿（ 5000 倍 ） 图示 DADS组 细胞电镜结构 图示 DADS组 细胞电镜结构 结构的破坏及功能的抑制都是细胞转 化早期的异常表现，并与细胞增殖失控及其 它恶性行为有关，而微管解聚与 DNA合成 的启动有关。本实验中观察到 DADS处理后 ， MGC803细胞出现微丝微管合成增加与重 组装，呈现规则的放射状分布，提示瘤细胞 恶性表型下降，表现为去恶化。 MGC803细

20、胞骨架 考马丝亮蓝染色（ 20） DADS组细胞骨架 考马丝亮蓝染色（ 20） 细胞结构观察 MGC803细胞骨架呈弥散荧光 间接免疫荧光染色（ 100） DADS组细胞骨架阳性，呈黄 绿色荧光环绕胞核。 间接 免疫荧光染色（ 100） 划痕标记后数分钟即可观察到黄色荧光传播， 人胃癌 MGC-803细胞不显示荧光染料的传播，表明 无间缝隙连接通讯功能。 DADS处理后，黄色荧光分布在伤沿细胞列和 相邻的数列细胞内，荧光强度从伤沿细胞列到临近 数列细胞逐渐减弱，以伤沿细胞列最强，表明间缝 隙连接通讯功能恢复 。 细胞间缝隙连接通 讯功能 未处理人胃癌细胞 Lucifer Yellow 10 处

21、理组人胃癌细胞 Lucifer Yellow 10 MGC803细胞 (+) p53表达 DADS组 ( ) p21WAF1 表达 DADS组 （） MGC803细胞 （） MGC803细胞 ( ) DADS组 （） pRb表达 MGC803细胞 （） DADS组 （） p21ras表达 MGC803细胞 (+) DADS组 ( ) C-Myc表达 裸鼠移植瘤 形成实验 移植瘤形成实验 表 1. DADS处理后各组裸鼠移植瘤重量变化情况 Group Dose(mg/kg) Tumor weight Inhibition rate(%) NS - 1.150.23 - SB 66 0.440.1

22、4 61.7 a DADS 50 0.830.16 27.8 a DADS 100 0.390.11 66.1 b DADS 200 0.310.08 73.0 b 移植瘤光学显微镜下形态变化 HE40 (A: 未处理组； B: 100mgkg-1DADS处理组 ) PCNA -actin 各处理因素 ： NS SB DADS DADS DADS 浓度 (mgkg-1) ： 66 50 100 200 DADS处理移植瘤后 PCNA蛋白表达 SSH技术成功构建 DADS诱导人胃癌细胞 MGC803细胞 差异表达基因的 cDNA文库。 差异表达片段 DADS1，长 208bp，为人类 -synu

23、clein 基因部分序列，其上调可能与 DADS诱导人胃癌 MGC803 细胞分化相关。 差异表达片段 DADS2，长 272bp，与鱼类 hepcidin-like precursor mRNA具有高同源性，其上调可能与 DADS造成 细胞内低铁低氧环境，继而诱导人胃癌 MGC803细胞分化 相关。 不同浓度的 DADS可显著抑制 HL-60细胞的增殖，且 与药物浓度有明显依赖关系； 0.625-2.5 g/mL时， NBT还 原反应显著增强，且在 1.25gmL-1时诱导分化作用达峰 值； DADS小鼠肾囊膜下移植的 HL-60细胞具有显著的生 长抑制作用，并呈剂量依赖关系， 21 mg/

24、kg 时抑瘤率达 49.5% ； 21 42mg/kgDADS可诱导 HL-60细胞向中性粒系 方向分化。 DADS对 HL-60细胞作用的研究 DADS对 HL-60细胞呈浓度依赖性的生长抑制效应 1.25 gmL-1DADS 处理 HL-60细胞不同时期 NBT还原 反应的变化 未处理的 HL-60细胞 处理的 HL-60 细胞 DADS对小鼠肾囊膜下 HL-60细胞的诱导分化作用 4.影响细胞周期蛋白活性 研究者们认为，细胞周期的失调控是癌症发生发展的 原因，而细胞周期素 cyclins、 细胞周期素依赖性激酶 CDKs 及调节 CDKs的激酶和磷酸酶则是细胞周期调控的分子基础 。在真核

25、生物细胞进行有丝分裂时，其细胞周期可分为间 期（ G1期、 S期、 G2期）和 M期， G1期细胞可进入持续时 间不等的 G0期。 我们 上述研究结果显示， pRb、 p21表达的增强 和 c-Myc、 Ras及突变型 p53表达减弱均可导致细胞停 滞于 G1期。本实验采用流式细胞仪检测了 MGC803 细胞在 DADS作用后细胞周期的分布，结果表明细胞 停滞于 G2期而非 G1期。 DADS可诱导 HL-60细胞表面 分化抗原 CD11b表达升高， CD33表达下降及细胞周 期阻滞在 G0/G1期。 DADS对人胃癌 MGC803细 胞周期的影响 0gmL-1 DADS 0.625gmL-1

26、 DADS 1.25gmL-1 DADS 2.5gmL-1 DADS 5gmL-1 DADS ATRA DADS对白血病 HL-60细胞周期的影响 DADS对 HL-60细胞周期的 DNA含量的 影响 CD11b CD33 DADS对 HL-60细胞表面分化抗原的影响 流式细胞术检测结果显示经 SB和 100mg/kg、 200 mg/kg DADS作用后， MGC803细胞移植瘤细 胞 G2/M期百分率分别比 NS对照组增加 1.92、 2.22 和 3.37倍 (P 0.05)，表明 DADS呈浓度依赖性对 移植瘤细胞有 G2/M期阻滞 。 不同浓度 DADS处理后移植瘤细胞周期的变化 N

27、S组 SB组 DADS 50mgkg-1组 DADS 100mgkg-1组 DADS 200mgkg-1组 研究表明， cyclin有 7种，它们的表达随细胞周期时相的 转换而发生改变，不同 cyclin须与相应的 CDK结合才能促使 细胞周期的完成。细胞增殖分裂过程中， cyclins有如下变化 ：细胞由 G0期进入 G1期时， cyclinD1-3合成均增加； G1/S期 时， cyclinDs及 cyclinE降解， cyclinA合成增加； S期进入 G2 期时， cyclinB合成逐渐增加积累； G2/M期转换时， cyclinA 、 B降解， cyclinDs、 E合成增加。 cy

28、clinD1在细胞增殖过程 中意义最大，是 G1期细胞增殖信号的关键蛋白。许多作者将 它视为一种癌基因，其过度表达可导致细胞增殖失控，最终 形成肿瘤。 CDKs由 CDK1-7 组成，其在细胞周期的特定时间与 相应的 cyclin结合后，并经磷酸化或去磷酸化后方具有生物 活性，促使与细胞周期有关蛋白的基因表达，从而对 DNA 合成及有丝分裂进行调控。 G1/S期有不同的 cyclin/CDK复合体， cyclinD/ CDK4和 cyclinE/CDK2激酶活性是细胞周期 G1/S期转换所必须的， 与 cyclinA、 E结合的 CDK2激酶活性在 G1/S期转换时升高， 而在 M期则降低。

29、CyclinB/cdc2复合体的活性是细胞进入 M期所必的，而 G1/S期转换，关系到细胞周期的启动， G2/M期转换则是细 胞进行有丝分裂增殖的前提。 CDIs是 CDKs的负调控因子，可使 CDKs失活； cyclins 是 CDKs的正调控因子，使 CDKs活化，二者对 CDK活性的 影响控制细胞周期各时相的转换。 CDIs可分为两类，一类是 P16家族，包括 P16、 P18、 P15、 P19，特异地抑制 CDK4和 CDK6；另一类是 P21家族，它包括 P21、 P27、 P57，对 CDK具有广谱的抑制作用。 Lee 用 flavopiridol处理 NSCLC细胞株 NCI-

30、H358时，发 现 flavopiridol可使该细胞生长停止和诱导分化，且分化的启 动与 cdk2失活相一致， western blot分析处理后细胞的有 cyclinE和 D1的缺失，表明 CDKs调控亚单位缺失是 CDK2激 酶失活的一个原因，同样 CDK1、 2、 5的抑制剂 roscovitine 也可以诱导 NCI-H358细胞分化，因此诱导分化剂可能通过 阻抑 CDK2的活性诱导细胞分化。 我们应用 Western blot 分析发现，在 G2/M期阻滞同时 有 Cdc25C蛋白表达下降，但 CDK1蛋白表达不受 DADS 作 用的影响。表明 DADS对 MGC803细胞的抑制增

31、殖作用与 G2/M期阻滞有关，其分子机理可能与降低 Cdc25C蛋白水 平有关。 p38通路调节 Cdc25C磷酸酶的表达在 DADS诱导 MGC803细胞 G2/M期阻滞中起着重要作用。 DADS对人胃癌 MGC803和 BGC823细胞 G2/M期检查点 激酶通路的影响 RT-PCR检测 Chk1和 Chk2在 mRNA水平的改变 Western blot 检测各蛋白的改变 免疫共沉淀检测 Chk1、 Chk2与 Cdc25C结合 M 1 2 3 4 5 6 600bp 300bp Chk1 -actin RT-PCR 检测 MGC803、 BGC823细胞 Chk1mRNA表达水平 M：

32、 Marker； 1： MGC803细胞对照组； 2-3： DADS 处理 MGC803细胞 1d、 2d； 4: BGC823细胞对照组； 5-6： DADS 处理 BGC823细胞 1d、 2d M 1 2 3 4 5 6 600bp 300bp Chk2 -actin RT-PCR 检测 MGC803、 BGC823细胞 Chk2mRNA表达水平 M： Marker； 1： MGC803细胞对照组； 2 3： DADS 处理 MGC803细胞 1d、 2d； 4: BGC823细胞； 5 6： DADS处理 BGC823细胞 1d、 2d DADS诱导 MGC803和 BGC823细胞

33、Chk1和 P-Chk1表达 0 1 2 4 8 12 (hr) P-Chk1(Ser345) Chk1 -actin DADS对 MGC803细胞磷酸化 Chk1表达的影响 P-Chk1(Ser345) Chk1 -actin DADS对 BGC823细胞磷酸化 Chk1表达的影响 0 1 2 4 8 12 (hr) DADS诱导 MGC803和 BGC823细胞 Chk2和 P-Chk2表达 0 1 2 4 8 12 (hr) P-Chk2 Chk2 -actin DADS对 MGC803细胞磷酸化 Chk2表达的影响 0 1 2 4 8 12 (hr) P-Chk2 Chk2 -acti

34、n DADS对 BGC823细胞磷酸化 Chk2表达的影响 DADS诱导 MGC803和 BGC823细胞 ATR和 P-ATR的表达 0 15 30 60 90 120 (min) P-ATR（ Ser428） ATR -actin DADS对 MGC803细胞磷酸化 ATR表达的影响 0 15 30 60 90 120 (min) P-ATR（ Ser428） ATR -actin 图 27 DADS对 BGC823细胞磷酸化 ATR表达的影响 DADS诱导 BGC823细胞 Chk下游分子 CDC25C、 Cyclin B1的表达 0 12 24 36 48 (hr) CDC25C -a

35、ctin DADS对 BGC823细胞 Cdc25C磷酸酶表达的影响 0 12 24 36 48 (hr) Cyclin B1 actin 图 25 DADS对 BGC803细胞 CyclinB1表达的影响 免疫共沉淀检测 Chk1激酶活性 Chk1 Cdc25C MGC803细胞 BGC823细胞 UntreatedTreated by DADS Negative controlUntreatedTreated by DADS Negative control 图 29 免疫共沉淀 Western-blot分析 MGC803和 BGC823细胞中的 Chk1表达 免疫共沉淀检测 Chk2激酶

36、活性 Chk2 Cdc25C Negative control UntreatedTreated by DADS Negative controlUntreated Treated by DADS MGC803细胞 BGC823细胞 免疫共沉淀 Western-blot分析 MGC803和 BGC823细胞中 Chk2的表达 Chk1和 Chk2 基因沉默对 DADS G2/M期阻滞作用 及检查点激酶通路的影响 1. 实时荧光定量 PCR检测 RNAi后 Chk1和 Chk2 mRNA表 达的改变 2. Chk1和 Chk2 RNAi后 Chk1和 Chk2蛋白表达的改变 3. Chk1 、

37、Chk2基因沉默后 MTT比色实验结果 4. 干扰后细胞周期的改变 5. Chk1和 Chk2 RNAi后下游蛋白表达的改变 定量 RT-PCR检测 MGC803细胞 Chk1 mRNA表达的改变 样 品 GAPDH chk1 chk1/GAPDH MGC803 1.03E-01 5.93E-03 5.76E-02 MGC803+vector 2.02E-01 9.34E-03 4.62E-02 MGC803+DADS 2.93E-01 4.05E-03 1.38E-02 MGC803+DADS+vector 2.98E-01 4.07E-03 1.37E-02 定量 RT-PCR检测 BGC

38、823细胞 Chk1 mRNA表达的改变 样 品 GAPDH chk1 chk1/GAPDH BGC823 1.21E-01 7.59E-03 6.27E-02 BGC823+vector 1.07E-01 6.41E-03 5.99E-02 BGC823+DADS 3.96E-01 3.79E-03 9.57E-03 BGC823+DADS+vector 1.26E-01 1.38E-03 1.1E-02 定量 RT-PCR检测 MGC803细胞 Chk2 mRNA表达的改变 样 品 GAPDH chk2 chk2/GAPDH MGC803 9.19E-02 3.65E-04 3.97E-0

39、3 MGC803+vector 1.03E-01 3.47E-04 3.37E-03 MGC803+DADS 9.08E-02 5.74E-05 6.32E-04 MGC803+DADS+vector 3.13E-01 2.19E-04 7.00E-04 定量 RT-PCR检测 BGC823细胞 Chk2 mRNA表达的改变 样 品 GAPDH chk2 chk2/GAPDH BGC823 1.07E-01 1.30E-04 1.21E-03 BGC823+vector 1.21E-01 1.44E-04 1.19E-03 BGC823+DADS 2.93E-01 1.10E-04 3.75E

40、-04 BGC823+DADS+vector 2.98E-01 1.12E-04 3.76E-04 chk1 、 chk2 RNAi转染 MGC803 和 BGC823细胞后其 mRNA表达 1、 2： chk1 RNAi后 MGC803 、 BGC823细胞 chk1表达抑制率 3、 4： chk2 RNAi后 MGC803 、 BGC823细胞 chk2表达抑制率 DADS SiRNA: C Chk1 Chk2 Chk1 Chk2 actin RNAi MGC803细胞 Chk1和 Chk2 后蛋白表达的改变 DADS SiRNA: C Chk1 Chk2 Chk1 Chk2 actin

41、RNAi BGC823细胞 Chk1和 Chk2 后蛋白表达的改变 Chk1 、 Chk2基因沉默后 MTT比色实验结果 Chk1干扰后 MGC803细胞 96小时的 OD570值 n=12 untransfected empty vector- transfected DADS Chk1 SiRNA Chk1 SiRNA +DADS 0.71 0.68 0.36 0.44 0.31 S 0.021 0.032 0.046 0.041 0.038 Inhibition rate（ % ） 50.7 38 56.3 Chk2干扰后 MGC803细胞 96小时的 OD570值 n=12 untra

42、nsfected empty vector- transfected DADS Chk2 SiRNA Chk2 SiRNA +DADS Chk1+ Chk2 SiRNA 0.71 0.068 0.36 0.58 0.34 0.45 S 0.021 0.032 0.046 0.033 0.037 0.026 Inhibition rate（ % ） 50.7 18.3 52.1 36.6 Chk1干扰后 BGC823细胞 96小时的 OD570值 n=12 untransfected empty vector- transfected DADS Chk1 SiRNA Chk1 SiRNA +DADS 0.79 0.82 0.35 0. 41 0.25 S 0.049 0.07 0.023 0.036 0.04 Inhibition rate（ %） 55.7 48.1 68.4