1、甲状腺癌分子诊断的研究进展 答：1、甲状腺癌分子诊断主要体现在 RET 重排、RAS 突变、BRAF 突变和 MAP 激酶信号转导 途径、RET/ PTC 重排、PI3K/Akt 信号转导通路、PAX8-PPAR 重排、p53 钝化和表观遗传调节。 2、其中甲状腺癌 DNA 相关标志物有 RET、RAS、BRAF、PAX8-PPAR 3 (1) RET/PTC 重排:有证据表明 RET/PTC 重排代表导致 PTC 进展的早期基因改变。约有 20%不定期发生的 PTCS 中可见 RET/PTC 重排。而且在甲状腺皮质和其他良性损伤中也可见 RET/PTC 重排。用 RET/PTC 法识别来自
2、FNA 的甲状腺结节诊断 PTC 已经开始启用。此外还 包括 BRAF 和 RAS 点突变 (2) BRAF 突变:是甲状腺癌中最为常见的基因改变。仅发生在 PTC 和 PTC 演化的 ATC 中， 在前者中的发生率为 45%，后者为 25%，在 FTC 和其他类型的甲状腺肿瘤中不会发生这种突变。 BRAF 突变是甲状腺癌预后不良的新型强效分子学预后标志物。 (3) RAS 突变: 在 3 型甲状腺癌，丝裂素活化蛋白激酶、胞外信号调节酶 (RAS/Raf/MEK/ERK)和磷脂酰肌醇-3 激酶(PI3K)/Akt 信号转导途径中，RAS（Rat 肉瘤的简写 形式）癌基因家族调节两个重要的信号转
3、导途径。良性和恶性甲状腺肿瘤中均可见 RAS 突变. 一些研究表明在良恶性甲状腺肿瘤中 RAS 突变盛行率相当，这说明 RAS 激活么能代表着早期 事件。另外一些研究表明 RAS 突变特别是 N-RAS61 号密码子的突变与肿瘤的进展和侵袭性临 床表现有关。Garcia-Rostan 等人近期研究显示 RAS 突变预示着 WDTC 独立肿瘤阶段的预后不 好。 (4) PAX8-PPAR 重排: PAX8-PPAR 基因重排与甲状腺滤泡状癌有关。在甲状腺滤泡状癌 和 PTC 滤泡状变异中可见 PAX8-PPAR基因重排，在所有肿瘤中其发生率接近 33%。在滤泡状 皮质腺瘤中也可见这种重排，对肿瘤
4、来说并不具有特异性。 (5) p53 钝化: 在甲状腺肿瘤中，p53 突变通常仅限于 PDTC 和 ATC 中。约 60%的 ATC 和 25% 的 PDTC 中会发生 p53 基因的点突变。而且，在分化良好的和未分化元件的肿瘤中，p53 突变仅 见于未分化组分中。在 PDTC 或 ATC 中，p53 突变不可能是启动事件；他像是有助于转换后表型 演化的晚期事件。 (6) 甲状腺癌中表观遗传调节: 表观遗传学修饰涉及 DNA 结构、组蛋白和或核小体重塑的 遗传学改变，导致基因表达的改变。现在正研究如何对染色质修饰有助于肿瘤的形成。最近在 组蛋白如何进行翻译后修饰会影响癌症方面有了显著进步。核小
5、体或染色质基本结构单位，包 含 147 bp 的 DNA 包裹四个核心组蛋白 (H2A, H2B, H3,和 H4)构成的八聚物。组蛋白修饰包括 甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化，可能与 DNA 启动子甲基化一起调节基因沉默。表观遗传 学药物靶位可能在将来的癌基因治疗中气核心作用。 附全文翻译 甲状腺癌的分子诊断的最新进展 最常见的内分泌肿瘤甲状腺癌的发病率在过去十年中日益增加。滤泡起源的甲状腺癌的组 织学分型有甲状腺乳头状癌（PTC），甲状腺滤泡状癌（FTC）,和甲状腺未分化癌（ATC）. 良 性甲状腺肿瘤（BTA）是常见的内分泌肿瘤。另一方面，甲状腺髓样癌并非滤泡细胞起源，而 是起源与滤泡旁
6、细胞或 C 细胞，因此，在此不做赘述。 大量研究表明，高治愈率的分化良好的甲状腺癌(WDTC)，滤泡细胞起源的甲状腺肿瘤， 到常常致命的甲状腺未分化肿瘤是逐级进展的。低分化的甲状腺癌及 WDTC 的侵袭性变体（如 高细胞和柱细胞）常为这一生物连续性进展模型中的中间体。 临床、流行病学及病理学均有证据支持该逐步进展和去分化这一概念。例如，伴随着有丝 分裂，坏死，及核的多形性的出现，在侵袭性甲状腺肿瘤中可见乳头状及滤泡状增长的逐步消 失，与此同时稳健增长逐步加强。这些肿瘤中大部分含有分化的甲状腺肿瘤的残余灶。 在临床医治甲状腺癌时，常常会难于诊断。原因之一在于评估甲状腺结节时广为应用的细 针吸取标
7、本(FNAB)为模棱两可的细胞学。如在美国，每年在甲状腺结节的 300000 个病例中， 大部分为 BTA.而且，20-30% 的 FNAB 显示为模棱两可的细胞学表现，这一报告模式在过去的 20 年来一直没变。尽管相当多的患者为良性结节，但他们为使结节完全回复常态，全都选择手 术治疗。 在甲状腺癌患者进行合适的外科治疗和药物治疗中，谨慎的风险分层是其中关键的一步。 这种风险评估通常基于临床病理学因素，这种评估可信度低且大部分时候不能在甲状腺手术前 得到结果。 大部分甲状腺癌患者的愈后都非常好。一般的治疗包括全甲状腺切除，在疾病进一步发展 阶段，用放射碘(I-131)疗法进行残余物消融或治疗。
8、只有肿瘤表形与正常甲状腺一样，存在通 过 TSH 受体和碘盐共输体(NIS)的表达对生长因子 TSH 有反应时，这些治疗方法才能见效。用 颈部超声等解剖成像、全身放射碘扫描和带有抗甲状腺球蛋白抗体的特异性甲状腺球蛋白血清 学测定等方法对患者进行监测。 在另一方面，伴有再发性或代谢性疾病的甲状腺癌患者其死亡率高达 50%。甲状腺癌的去 分化包括 TSH 受体表达的丢失，NIS,和甲状腺球蛋白的丢失。在肿瘤不能进行 NIS 表达过程中， 临床医生也不能用放射碘进行监测和治疗。然而，处于该状态的肿瘤在 18F-脱氧葡萄糖正电子 发射断层扫描（FDG-PET）中可见。就临床而言，对于 FDG-PET
9、阳性的非碘敏感肿瘤的治疗 方法有观察、附加手术、外部离子束照射，还有像美国 FDA 认证的 doxorubicin 化疗药物，及 临床实验。 近来引进的靶向治疗药物有多个靶点，包括受体酪氨酸激酶，非受体酪氨酸激酶，和丝氨 酸苏氨酸激酶，这些药物为甲状腺癌沉珂患者带来了福音。 分子医学的现行目标是能够描绘每位患者的肿瘤，以决定用何种方法来达到最佳疗效。在 基因和/或表观遗传调节等肿瘤生物学领域其概念的阐述和技术方面有着显著进步，但在甲状腺 致癌基因中却缺乏统一的理论。本综述旨在提供一个框架，以了解相关研究该如何发展才能针 对不同肿瘤基于相应治疗。 2、染色体重排 在甲状腺乳头状癌中最早能识别的基
10、因改变为原癌基因 RET（转录时重排）的染色体改变。 此 RET 原癌基因是位于 10 号染色体长臂近端的 21 号外显子，他可编码酪氨酸激酶受体。他 涉及神经嵴起源细胞的生长，生存，分化和移动的调节。正常情况下，他不在卵泡细胞中表达。 易发生异位基因部位有独特的空间接近性，这可以在甲状腺有丝分裂中期、favors RET 基因重 排时优先发生，这就是甲状腺肿瘤中 RET 重排具有特异性的原因。 尽管有 10 多个重排得以描述，但是在 PTC 中发现的重排大部分是 RET/PTC1, RET/PTC2, 和 RET/PTC3。这些重排中管家（或普遍表达）基因的上游（5端）元件能驱使 RET 酪
11、氨酸 激酶区域表达。融合基因提供的异源引物有助于 RET/PTC 嵌合蛋白的表达，导致乳头状癌细胞 中 RET 受体酪氨酸激酶中组分及依赖性配体的激活。 临床上，在放射相关 RTC 中常可发现 RET/PTC 变体。1986 年切尔诺贝利核电厂爆炸后小 儿甲状腺癌增加导致甲状腺癌两个组分的形成。第一个为可早期发现并有侵袭性的 PTC 稳固变 体，他含有 RET/PTC3 重排。而第二个 PTC 为带有更为典型的表型和临床过程，在切尔诺贝利 核爆后的生存者中含有 RET/PTC1。 转基因小鼠和体外细胞作用均表明这些融合蛋白能启动 PTC。在甲状腺未分化癌中 RET/PTC 重排并不常见，这表明
12、这些肿瘤可用常规疗法处理。而且，用 RET/PTC 法识别来自 FNA 的甲状腺结节诊断 PTC 已经开始启用。 有证据表明 RET/PTC 重排代表导致 PTC 进展的早期基因改变。约有 20%不定期发生的 PTCS 中可见 RET/PTC 重排。而且在甲状腺皮质和其他良性损伤中也可见 RET/PTC 重排。然 而，既然这种重排见于大部分肿瘤细胞，我们就有理由认为他具有 PTCS 特异性。 有几项研究表明与 PTC 有关的 RET/PTC 重排缺乏进展到 PDTC 或 ATC 的证据。近期 Santoro 等人的研究表明显示 RET/PTC 重排的 PDTCs 少于 10%。因此他们得出结论
13、：相对而言， 带有 RET/PTC 重排的 PTC 发展为 PDTC 或 ATC 的可能性较小。 近来已经发现有显著抑制 RET 酶活性的复合物。特别是在用甲磺酸伊马替尼（可激活 ABL 激酶的抑制因子）治疗慢性髓性白血病方面取得了显著成效，这一成功显著促进了治疗性 蛋白激酶抑制因子的研究。有对抗 RET 活性的多种药物正处于试验阶段，最值得关注的有 ZD6474-Vandetanib 和 Bay 43-9006-Sorafenib,但是这些药物也作用于其他酪氨酸激酶受体。 特别是 Sorafenib，他在两次二期临床试验中的有效率分别为 15%和 23%，由于 Vandetanib 有 阻断
14、 RET 信号活性才能力，他率先应用于髓性甲状腺癌患者，然而，对于 DTC 患者，还正处于 二期临床试验。 3、RAS 突变 在 3 型甲状腺癌，丝裂素活化蛋白激酶、胞外信号调节酶(RAS/Raf/MEK/ERK)和磷脂酰肌 醇-3 激酶(PI3K)/Akt 信号转导途径中，RAS（Rat 肉瘤的简写形式）癌基因家族调节两个重要的 信号转导途径。良性和恶性甲状腺肿瘤中均可见 RAS 突变，在 ATCs 中有可变频率。 由 H-RAS, K-RAS, 和 N-RAS 三个 RAS 基因合成的 21-kDa 蛋白质家族在肿瘤形成过程中 起重要作用。RAS 蛋白有两种存在形式：一种为富含二磷酸鸟苷(
15、GDP)的非活性形式和富含三 磷酸鸟苷(GTP)的活性形式。他们能将起于酪氨酸激酶膜受体的信号传给级联的有丝分裂素激 活蛋白激酶（MAPKs ）。这将激活靶基因的转录、细胞的增殖、存活和凋亡。在外显子 1GTP 结合区域（密码子 12 或 13）或外显子 2GTPase 区域（密码子 61）的点突变可激活致癌基因 RAS，这可使蛋白质处于激活状态并导致下游靶位的慢性刺激，基因组的不稳定性，额外的突 变和恶性转化。RAS 突变是转化细胞中最常见的突变之一。在良恶性甲状腺肿瘤中均可见三种 RAS 基因的突变。他们在滤泡癌，PDTC, 和 ATC 中均较常见，在 PTC 中较少。RAS 致癌基 因在
16、甲状腺肿瘤发展过程中的作用还不清楚。 一些研究表明在良恶性甲状腺肿瘤中 RAS 突变盛行率相当，这说明 RAS 激活么能代表着 早期事件。另外一些研究表明 RAS 突变特别是 N-RAS61 号密码子的突变与肿瘤的进展和侵袭 性临床表现有关。伴有甲状腺特异性 RAS 表达突变的转基因小鼠会发展为甲状腺增生和甲状腺 肿瘤。Garcia-Rostan 等人近期研究显示 RAS 突变预示着 WDTC 独立肿瘤阶段的预后不好。 而且，他们发现 PDTC 和 ATC 常有多个 RAS 突变。这些突变可能代表甲状腺肿瘤进展过 程的中间阶段。 4、甲状腺癌中的 BRAF 突变和 MAP 激酶信号转导途径 进
17、化上较保守的 MAPK 信号通路允许细胞对像激素和与各种受体（包括 RET 类酪氨酸激 酶受体和 TSH 类 G 蛋白偶联受体）有相互作用的生长因子等外部刺激做出反应。在甲状腺癌 中，RET/PTC 重排是 MAP 激酶通路常见的激活因子。可激活 MAP 激酶通路的 Ras 突变在甲 状腺癌中也很常见。 在人类癌症中 BRAF 突变是引起 MAP 激酶通路异常激活的主要原因。在已知的三种 Raf 酶（A-Raf, B-Raf (BRAF), 和 CRaf）中，BRAF 是 MAP 通路中最有效的激活因子。已知的 40 种 BRAF 基因突变中，90%以上属于 T1799A 位点 BRAF 突变
18、。这一突变引起 BRAF 蛋白中 V600E 氨基酸改变，导致 BRAF 激酶本身和致癌基因的激活。 甲状腺癌中 T1799A BRAF 突变的发现和特性描述代表着近年来甲状腺癌在分子生物学领 域的令人振奋的进步。实际上，这种突变是甲状腺癌中最为常见的基因改变。在甲状腺癌中也 发现几种非常少见的其他激活的 BRAF 突变。他们是 BRAF K601E 71, AKAP9-BRAF 66, BRAF V600E+K601del 72, 73, BRAF V599ins74, 和 V600D+FGLAT601-605ins,这些是由 T1799 核苷酸位点 18 个核苷酸插入引起的。因此，T179
19、9A 突变是甲状腺癌中最常见且是唯一 的 BRAF 突变，通常被称作“BRAF 突变”。 之前的研究表明在家族性非髓性甲状腺癌中，BRAF 突变不是生殖细胞突变，作为一个体 细胞基因突变，仅发生在 PTC 和 PTC 演化的 ATC 中，在前者中的发生率为 45%，后者为 25%，在 FTC 和其他类型的甲状腺肿瘤中不会发生这种突变。有细胞系和异种移植物肿瘤的转 基因小鼠模型的研究阐释了 BRAF 突变肿瘤发生能力及其维持肿瘤细胞生长和增值的要求。 大量临床研究表明 BRAF 突变与侵袭性临床病理结果有关，包括肿瘤的侵入、转移和 PTC 的复发。此外，还有研究表明 BRAF 突变和复发 PTC
20、 中放射碘亲和力减弱及其不能得以治愈有 关。这与 BRAF 突变触发的甲状腺碘处理基因的沉默和通过使甲状腺细胞中 BRAF 突变的表达 沉默进而使这一过程逆转所得的研究数据一致。此外，有研究表明 BRAF 突变与 PTC 的去分化 有紧密联系，其表现为 PTC 中甲状腺特性基因（包括 NIS,TPO. Pendrin 和 Tg）表达减弱。因 此，BRAF 突变是甲状腺癌预后不良的新型强效分子学预后标志物。 5、甲状腺癌中 PI3K/Akt 信号转导通路 与 MAP 激酶通路一样，磷脂酰肌醇 3 激酶(PI3K)/Akt 信号通路（(PI3K 通路)在细胞的生 长、增值和生存及人类肿瘤的形成中起
21、重要作用。在 PI3Ks 的几个分级中，I 级是最有特点的， 是组成异源二聚体的调节亚单位，特别是 p85 和 p110 催化亚单位。 -型(PIK3CA)和 -型 (PIK3CB) p110 亚单位在不同组织中广泛存在，而 p110 亚单位的其他型只在有限的组织中表达。 Akts 有三种类型：Akt-1, Akt-2, 和 Akt-3.激活的 Akt 使下游蛋白影响因子磷酸化、信号级 联放大，促进细胞增值抑制细胞凋亡。肿瘤抑制基因 PTEN 对抗 PI3K/Akt 通路信号的产生。 PTEN 是 PIP3 脱磷酸作用中的磷酸酶，因此可终止 PI3K/Akt 通路的信号。 之前的研究显示甲状腺
22、癌中 PI3K 的一般激活。在甲状腺癌中 Akt 三种亚型中的 Akt-1, 和 Akt-2 含量最丰富且最为重要。据报道在甲状腺肿瘤中会发生 PIK3CA 的基因组复制增益和扩 增，在 FTC 和 ATC 中尤为明显。而且，ATC 中 PIK3CA 突变十分常见，相对而言，在不同的 甲状腺癌中并不常见但也会发生。在 PI3K 通路中有许多基因改变，包括 PIKCA 突变和扩增、 Ras 突变和相对来说较广泛的 PTEN 突变，特别是在 FTC 和 ATC 肿瘤中。这些基因改变中有 些共存，在侵袭性甲状腺癌特别是 ATC 中，与 BRAF 突变共存的基因改变跟为常见。有意思 的是，在大多数(8
23、1%) ATCs 中，基因改变可同时激活 MAP 酶和 PI3K 通路。 这些数据为 ATC 发病机制中 MAP 酶和 PI3K 通路的双参与的广泛作用提供最有力的基因 学证据，这支持了最近的一个假说，该假说认为靶标多重信号通路，特别是 MAP 酶和 PI3K/Akt 通路，可能会是甲状腺癌的一种有效且必要的治疗方法。 6、PAX8-PPAR 重排 PAX8 基因编码转录因子对于甲状腺滤泡系的形成和甲状腺特异性基因表达的调节是必不 可少的。过氧化物酶体增值激活受体 (PPAR )是核素受体超家族中的一员，该超家族包括 甲状腺激素、维 A 酸和雌雄激素受体。PAX8-PPAR 重排导致 PAX8
24、 在 2q13 的 7、8、9 号外显 子和 PPAR 在 3p25 的外显子 1 帧内融合。 这种重排赋予一种致癌的表型的确切机制尚不明确。表面上像是 PAX8-PPAR嵌合蛋白使 公认的肿瘤抑制因子野生型 PPAR 失活。 与 RAS 突变一样，PAX8-PPAR 基因重排也与甲状腺滤泡状癌有关。在甲状腺滤泡状癌和 PTC 滤泡状变异中可见 PAX8-PPAR基因重排，在所有肿瘤中其发生率接近 33%。在滤泡状皮 质腺瘤中也可见这种重排，对肿瘤来说并不具有特异性。 这种重排在滤泡状甲状腺癌到 PDTC 和 ATC 进展和去分化中的作用尚不明确。 7、p53 钝化 p53 基因编码在细胞周期
25、调节、DNA 修复和凋亡中起核心作用的核转录因子。作为基因组 的守护者，p53 基因在细胞在 DNA 损伤因素下暴露后会过度表达并引起瞬态细胞周期停滞，有 助于 DNA 修复。 然而，如果损伤严重，他会启动凋亡程序以阻止缺陷细胞复制。p53 功能损伤的细胞有可 能积累遗传损伤并在克隆扩增时有选择性优势。通过钝化点突变可改变 p53 肿瘤抑制因子，常 涉及 5-8 外显子，或通过删除导致基因组渐进式的不稳定，额外的突变和恶性克隆的传播。这 代表了人类癌中最为频繁的基因损伤，通常作为晚期肿瘤发生事件出现。 在甲状腺肿瘤中，p53 突变通常仅限于 PDTC 和 ATC 中。约 60%的 ATC 和
26、25%的 PDTC 中会发 生 p53 基因的点突变。而且，在分化良好的和未分化元件的肿瘤中，p53 突变仅见于未分化组 分中。这些发现与假说（即 p53 钝化像再次刺激，导致肿瘤去分化，并向 PDTC 和 ATC 进展）一 致。 实验性研究表明 p53 丢失导致甲状腺肿瘤逐步去分化。伴有甲状腺特异性 RET/PTC 重排 的转基因小鼠会发展为 PTC,但与 p53/小鼠杂交后，后代会死于快速演进的 PDTC 和 ATC。相 反，在培养的 ATC 细胞中野生型 p53 的恢复导致甲状腺特异性基因和甲状腺刺激激素反应可读 性的重新表达。 在 PDTC 或 ATC 中，p53 突变不可能是启动事件
27、；他像是有助于转换后表型演化的晚期事件。 8、甲状腺癌中表观遗传调节 我们知道 DNA 和组蛋白结合形成密集的结构为染色质，现在正研究如何对染色质修饰有助 于肿瘤的形成。表观遗传学修饰涉及 DNA 结构、组蛋白和或核小体重塑的遗传学改变，导致基 因表达的改变。我们已阐述过甲状腺癌中的表观遗传学改变，最为显著的是在正常甲状腺功能 如碘化钠同向转运体和促甲状腺激素受体的重要基因的启动子 CpG 岛中 DNA 甲基化模式的改变。 通过 DNA 甲基化转移酶(DNMTs)增强启动子甲基化导致基因沉默和甲状腺肿瘤的进一步去分化。 像 5_-azadeoxycytidine 这类 DNMT 抑制因子正被评
28、估为在分化因子，因此，使得肿瘤对像放射 活性碘等传统治疗更为敏感。特异性甲基化样式的识别可对对甲状腺激素抑制疗法和 I-131 疗 法不再敏感的肿瘤进行分层。 最近在组蛋白如何进行翻译后修饰会影响癌症方面有了显著进步。核小体或染色质基本结 构单位，包含 147 bp 的 DNA 包裹四个核心组蛋白(H2A, H2B, H3,和 H4)构成的八聚物。组蛋 白修饰包括甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化，可能与 DNA 启动子甲基化一起调节基因沉默。 表观遗传学药物靶位可能在将来的癌基因治疗中气核心作用。 9、结论 近年来在甲状腺癌的分子生物学领域的研究取得了显著进展。 在甲状腺癌的几项主要生物领域这一特点得到反映，包括甲状腺癌放射碘活性丢失引起的 分子生物学改变、MAP 激酶和 PI3K/Akt 通路的致病性和与其相关的基因型改变以及在甲状腺 肿瘤形成和发病过程中功能性重要基因的异常甲基化。在分子生物学领域取得的这些令人振奋 的成就为甲状腺癌进行有效诊断、预测和治疗障碍寻找新的分子方法带来了很大希望。
