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1、细菌与真菌学实验 实验一 细菌形态结构观察 【目的】 1、了解细菌的基本形态和特殊结构观察法 2、明确细菌特殊结构在医疗实践中的意义 3、细菌不染色标本的观察方法 4、观察活细菌的形态及运动情况 【材料】 革兰染色标本片： 1、球菌：葡萄球菌、链球菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌。 2、杆菌：伤寒沙门菌、大肠埃希菌、炭疽芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌。 3、螺形菌：霍乱弧菌或水弧菌。 细菌特殊结构标本片： 1、鞭毛:变形杆菌、 霍乱弧菌 2、荚膜:肺炎链球菌、 产气荚膜杆菌 3、芽孢：破伤风杆菌、 炭疽杆菌 细菌动力观察材料： 1、菌种：普通变形杆菌、表皮葡萄球菌。 2、变形杆菌和表皮葡萄球菌 812mi

2、n 肉汤培养物。 3、其他：凹玻片、盖玻片、凡士林、牙签、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、擦镜纸 一 细菌形态结果观察 1、使用油镜观察上述革兰染色标本片：认识细菌的三种基本形态。 注意观察各菌的形态、大小、排列方式及染色性等特点。 2、使用油镜观察细菌的特殊结构标本片： （1）荚膜：肺炎链球菌经革兰染色后，呈矛头状成双排列，菌体四周有不着色的透明圈（既荚膜） ；肺炎链球菌与产气荚膜杆菌的荚膜（荚膜染色法），注意观察菌体及荚膜的颜色及两者的形态特点。 （2）鞭毛：变形杆菌与霍乱弧菌的鞭毛（鞭毛染色法），注意观察菌体和鞭毛的颜色、鞭毛的长 短、数目及在菌体上的位置。 （3）芽胞：破伤风梭菌及炭疽

3、杆菌芽胞（芽胞染色法），注意观察菌体、芽孢的形态、颜色及芽 孢在菌体中的位置。 二、细菌不染色标本观察法（动力观察法） 1、悬滴法 图 211 （1）取一张洁净盖玻片，用牙签涂少许 凡士林于盖玻片的四个角处。 （2）用接种环取 34 环普通变形杆菌或 表皮葡萄球菌液体培养物于盖玻片中央。 （3）把凹玻片凹面朝下盖在盖玻片上，使 凹窝中央正对菌液（见图 211）。 （4）迅速翻转凹玻片，使粘附在凹玻片上 的盖玻片朝上。 （5）先用低倍镜观察，再换高倍镜观察。 图 211 悬滴法 普通变形杆菌有鞭毛，运动活泼， 可向不同方向迅速运动。表皮葡萄球菌无鞭毛，不能作真正运动，只能在一定范围内作移位不大的

4、颤动， 这是受水分子撞击而呈分子运动（即布朗运动）。 2、压滴法 （1）用接种环取 34 环菌液于洁净载玻片中央。 （2）用小镊子挟一块盖玻片轻轻覆盖在载玻片的菌液上，放置盖玻片时，应将盖玻片的一端接触 载玻片，然后缓慢放下，以免菌液中产生气泡。 （3）先用低倍镜对光找到细菌的位置，再换高倍镜观察细菌的运动。 【思考题】 1、在油镜下你看到了细菌有几种特殊机构？能否看到细菌菌毛？ 2、细菌特殊结构在医学上有何意义？ 3、细菌的动力检查有何意义？ 实验二 细菌涂片标本的制备及革兰染色法 【目的】1、掌握细菌涂片标本的制备和革兰染色法。 2、了解革兰染色法的意义。 【原理】 1、细胞壁结构学说：革

5、兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易渗入； 革兰阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄，含大量脂质，乙醇容易渗入。2、等电点学说：革兰阳性菌等 电点（pH23）比革兰阴性菌等电点（pH45）低，在相同 pH 条件下，革兰阳性菌所带负 电荷比革兰阴性菌多，故与带正电荷的结晶紫染料结合牢固，不易被 95%乙醇脱色。 3、化学学说：革兰阳性菌菌体含有大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合成大分子复合物， 使已经着色的细菌不被 95%乙醇脱色；革兰阴性菌菌体含核糖核酸镁盐很少，故容易被 95%乙醇脱色。 【材料】 1、菌种：大肠埃希菌、葡萄球菌。 2、染液:革兰染色液一套：结晶紫染液

6、、碘液、95%乙醇、稀释石炭酸复红染液。 3、玻片、生理盐水、酒精灯、吸水纸、接种环、玻璃蜡笔、香柏油等。 【方法】 一 细菌涂片制备 1、涂片：取一张洁净载玻片，用玻璃蜡笔在洁净载玻片上标记，于玻片两端各滴 1 滴生理盐水， 不要太靠近玻片边沿。接种环在火焰上灭菌后，分别挑取少量葡萄球菌和大肠埃希菌于玻片两端的生理盐 水中，并研磨成均匀混浊的菌液（如系液体标本，则不需加生理盐水，可直接涂于载玻片上），涂成约 1cm1cm 大小的均匀薄膜，接种环灭菌后放回试管架上。 2、干燥：涂片最好在室温下自然干燥，如欲加速干燥，也可将涂膜背面置火焰上方不烤手的高处 略加烘烤，但切勿紧靠火焰，以免将涂膜烤焦

7、，细菌变形，染色后难以观察。 3、固定：涂片干燥后，手持玻片的一端，将载玻片的背面往返通过酒精灯火焰三次，共约 23 秒 钟，注意温度不可太高，以玻片加温面触及皮肤感觉烫而尚能忍受为度。 固定的目的一是杀死细菌，二是使菌体与玻片粘附牢固，以免玻片上的细菌在染色过程中被水冲洗 掉，三是固定后细菌蛋白质变性易被着色。 固定完毕，放置待冷后再进行染色。 注： 无论何种染色，涂片均不可太厚，一定涂成薄膜；取第 二个菌之前，一定要注意灭菌，否则两菌混淆；最好取湿润的菌落，便于将细菌混匀 。 二 革兰染色法 1、初染：将固定好的细菌涂片放在染色架上，滴加结晶紫染液 23 滴，以全面覆盖涂膜为度，染 色 1

8、min 后用细流水冲洗，将玻片上积水轻轻洒净。 2、媒染：滴加卢戈（Lugol）碘液数滴，染色 1min 后用细流水冲洗，将玻片上积水轻轻洒净。 3、脱色：滴加 95%乙醇数滴，轻轻前后摇动玻片数秒钟，使均匀脱色，然后倾斜玻片，使脱掉的染 料随乙醇流去，再滴加乙醇，如此反复 23 次，直到流下的乙醇无色或稍呈淡紫色为止，大约 30s 左右， 用细流水冲洗，将玻片上积水轻轻洒净。 4、复染：滴加稀释石炭酸复红液数滴，复染 1min，用细流水冲洗，将玻片上积水轻轻洒净。 待标 本片自然干燥或用吸水纸吸干后，在涂菌处滴加一滴香柏油，然后用油镜观察结果。 【结果】 染成紫色的为革兰阳性菌；染成红色的为

9、革兰阴性菌。 【注意事项】 1、涂片应均匀，如太厚或太薄，菌体分散不均，会影响乙醇脱色，造成染色结果不准确。固定时 应避免菌体过分受热，否则会使菌体变形影响染色效果。脱色时应把握好时间，若脱色时间过长易造成假 阴性，但脱色时间过短革兰阴性菌也会被误认为革兰阳性菌。 2、所用染色液应防止水分蒸发而影响浓度，特别是碘液久存或受光作用后可形成碘酸，易失去媒 染作用。脱色用的乙醇以 95%浓度为好，若瓶口密封不好或涂片上积水过多，均可引起乙醇浓度降低而增 强脱色能力。 3、不同时间的细菌培养物，染色结果有差异。如葡萄球菌，培养 48h 以上的老龄菌，易染成红色， 而幼龄菌则易染成紫色。细菌染色一般用

10、1824h 的细菌培养物。 4、染色过程中勿使染色液干凅，用水冲洗后应甩去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色 效果。 【思考题】 1、为什么接种环（针）使用前后都必须烧灼灭菌？忽略了有什么危害？ 2、制备一张好的涂片应注意些什么？ 3、如革兰阳性菌被染成革兰阴性菌可能有哪些原因？ 【附录】 1、革兰染色液的配制 （1）结晶紫染液：称取结晶紫 48g，溶于 95乙醇 100ml 中，配成结晶紫乙醇饱和液。取此饱 和液 20ml 与 1草酸铵水溶液 80ml 混匀，过滤后备用。 （2）卢戈（Lugol）碘液：先将碘化钾 2g 溶于 10ml 蒸馏水中，再加入碘 1g，略加振摇，使之全部 溶解

11、后，再加蒸馏水至 300ml 既成。 2、鞭毛染色法（魏曦染色法） （1）染液： 甲液：钾明矾饱和液 2ml，50gL 石炭酸液 5ml，200gL 鞣酸液 2ml，混匀。 乙液： 碱性复红乙醇饱和液。 使用前，将甲液 9 份，乙液 1 份混合后过夜，次日过滤后使用，3 天内使用效果 最佳。此液不能长期保存。 （2）染色方法： 先将鞭毛菌在肉汤培养基中传代 67 次。取琼脂斜面培养基吸出凝结水，加入 2ml 无菌蒸馏水，然后将肉汤中传代的细菌接种于斜面琼脂与液体交界处，再从该交界处向上划一直线， 放人温箱中培养 16h。用接种环从交界处取一环菌液，轻轻放人盛有 34ml 蒸馏水的小碟液体表面，

12、使 细菌自由分散，浮在液体表面，静置于温箱内 45min 后，用接种环取一环液面混合液放于高度洁净的载 玻片上，切勿研磨和摇动，置 37或室温下让其自然干燥，切勿火焰固定，加数滴染液染色 12min，轻 轻水洗，干后用显微镜油镜观察。 （3）结果：细菌菌体和鞭毛均染成红色，菌体着色较鞭毛深。染色时间长则鞭毛粗，否则鞭毛较 细。 3、荚膜染色法（黑斯染色法） （1）染液：结晶紫染液：结晶紫饱和乙醇溶液 5ml，加蒸馏水 95ml 混合；200g/L 硫酸铜水溶液。 （2）染色方法：将荚膜菌涂片，在空气中自然干燥，无需加热固定，滴加结晶紫染液，在火焰上 微微加热，使玻片上染液冒蒸汽为止。再用硫酸铜

13、水溶液冲洗，切勿用水冲洗。待干后油镜检查。 （3）结果：细菌菌体染成紫色，荚膜染成淡紫色。 4、芽胞染色法(复红美兰法) （1）染液:石炭酸复红液，95乙醇，碱性美兰液(配法：取美兰 2g，溶于 95乙醇 100ml 中配成 美兰乙醇饱和液。取此饱和液 30ml 与 0.0lKOH 水溶液 100ml 均匀混合即成)。 （2）染色方法：将有芽胞的细菌培养物涂片，自然干燥后，火焰固定。滴加数滴石炭酸复红染液 于涂片上，并用微火加温，使染液冒蒸汽，持续 5min，冷却后用流水轻轻冲洗；用 95乙醇脱色 2min， 流水轻轻冲洗；再加数滴碱性美兰染液复染 0.5min，流水轻轻冲洗，干后油镜检查。

14、（3）结果：细菌菌体染成蓝色，芽胞染成红色。 实验三 常用培养基制备 【目的】 1、熟悉培养基制备的基本程序。 2、掌握常用培养基的种类及用途。 【材料】1、试剂：牛肉膏、氯化钠、蛋白胨、琼脂粉、脱纤维绵羊血或兔血、蒸馏水、1N 的 NaOH、1N 的 HCl 等。2、器材：三角烧瓶、量筒、精密 pH 试纸、天平、高压蒸气灭菌器、脱脂棉、滤纸、 漏斗、无菌平皿、酒精灯、电炉、血清凝固器等。 【方法】 一 培养基制备的基本程序 制备一般培养基的基本程序可分为：调配、溶化、矫正 pH、过滤、分装、灭菌、鉴定和保存等步骤。 1、调配：按培养基组成准确称取各成分用量，放人三角烧瓶或大容量烧瓶中，加一定

15、量蒸馏水， 振摇后使其充分混匀。应注意染料、胆盐和指示剂等应在矫正 pH 后加入。 2、溶化：将调配好的混合物在电炉上加热，随时搅拌，防止外溢，使其完全溶化。溶化完毕，注 意补足失去的水分。 3、矫正 pH：可用 pH 比色法或精密 pH 试纸，矫正培养基的 pH，pH 矫正方法见附录，一般将培养 基的 pH 调至 7.27.6 左右。经高压灭菌后，其 pH 值约降低 0.10.2，故在矫正 pH 时应比实际需要的 pH 高 0.10.2。 4、滤过：自配的培养基通常有一些混浊或沉淀，需滤过澄清后方可使用。液体或半固体培养基常 用滤纸过滤，固体培养基在熔化后趁热以绒布或双层纱布加脱脂棉过滤。如

16、称取的为半成品成分则不需要 过滤。 5、分装：根据需要将培养基分装于三角烧瓶或试管等。 （1）基础培养基：一般分装于三角烧瓶内，灭菌后备用，以便随时分装倾注平板或配制营养培养 基等； （2）琼脂斜面：通常在熔化后分装于试管，量约为试管高度的 1413，加塞后灭菌，趁热摆 成斜面，斜面长度约为试管长度的 23，且保持试管下端有 lcm 柱高； （3）半固体培养基：分装量约为试管容量的 1413，加塞灭菌后趁热直立，凝固待用； （4）琼脂高层培养基：分装量约为试管长度的 13，灭菌后趁热直立凝固待用； （5）液体培养基：分装量约为试管长度的 13，灭菌后趁热直立待用； （6）琼脂平板：先将灭菌加热

17、熔化后的固体培养基，冷至 50左右，以无菌操作倾注于无菌平皿 内。内径 9cm 的平皿约 1315m1，若内径 7cm 的平皿约 78m1，轻摇平皿，使培养基平铺于平皿底部， 待凝固后将平皿翻转，置 4保存备用。 6、灭菌： （1）高压蒸汽灭菌：耐热物质配制成的培养基(如普通培养基等)常用高压蒸气灭菌，通常压力在 10343kPa（1.05kgcm2）蒸气压力下，温度达到 121.3，维持 1530min；含糖培养基加热 10 磅 （6895kPacm2、115.6），1015min 为宜，以免破坏糖类物质。 （2）间歇灭菌：不耐高热的物质配制成的培养基，如糖类、明胶和牛乳等常用间歇灭菌，方法

18、是 用流通蒸汽法加热 100 30min，置 37温箱内过夜，第二天再加热 100 30min，连续三次。 7、鉴定：培养基鉴定的基本要求是： 无菌试验：将灭菌后的培养基置 37温箱中培养 24h，无任何细菌生长为合格。 效果试验：将已知菌种接种至此培养基上，证明相应的细菌可在此培养基上生长，且形态、菌落、 生化反应等特征典型。 8、保存：制备好的培养基应注明名称、制作日期，用牛皮纸包裹或装于保鲜袋内，以减少水分蒸 发，存放于 4冰箱或冷暗处保存备用。琼脂平板应将底朝上，盖朝下放置；液体培养基应直立放置。 二 常用培养基的种类、制备及用途 根据各种细菌生长繁殖时所需要的条件不同，培养基可分为很

19、多种类。常用的种类按物理性状分： 液体培养基、固体培养基、半固体培养。按用途不同分：基础培养基、营养培养基、选择培养基、鉴别培 养基及厌氧培养基等。 1、液体培养基 （1）肉膏汤培养基 成分： 牛肉膏 3g 蛋白胨 10g 氯化钠 5g 蒸馏水 1000ml 制法： 1）用天平分别称取牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，氯化钠 5g 置三角烧瓶中。 2）加入蒸馏水 1000ml，把三角烧瓶在电炉上加热，使蛋白胨等溶化。 3）测定培养基的酸碱度，用 1N 的 NaOH 调 pH 至 7.47.6，煮沸 35min，必要时滤过。 4）分装试管或烧瓶，加塞，用牛皮纸包扎管口、瓶口。 5）高压蒸气灭菌 15

20、 磅 20min 取出冷却后，置 4冰箱贮存备用。 用途：肉膏汤培养基可供营养要 求一般的细菌生长。 （2）肉汤培养基 成分： 新鲜牛肉 500g 蛋白胨 10g 氯化钠 5g 制法： 1）将新鲜牛肉去除筋和脂肪，切碎绞细，加水 1000ml，置 4冰箱过夜。 2）次日取出，搅拌均匀，加热 10030min，用数层纱布或滤纸过滤，补足失去的水分。 3）加入蛋白胨 10g，氯化钠 5g，加热溶化。 4）冷至 50左右，矫正 pH 至 7.4。 5）分装试管或烧瓶，加塞，用牛皮纸包扎管口、瓶口。 6）高压蒸气灭菌 15 磅 20min 取出冷却后，置 4冰箱贮存备用。 用途：作基础培养基使用，营养

21、 比肉膏汤培养基好，可供营养要求一般的细菌生长。 2、普通琼脂培养基 成分： 肉汤或肉膏汤 1000ml 琼脂 2030g 制法： （1）将琼脂加入肉汤或肉膏汤中，加热溶化。 （2）矫正 pH 至 7.4，分装于试管或三角烧瓶中，每管约 5ml。 （3）高压蒸气灭菌 15 磅 20min。 （4）取出试管，斜放使其凝成斜面培养基。 （5）将已溶化的肉汤或肉膏汤琼脂冷至 50左右，以无菌操作注于无菌平皿中。内径 9cm 的平皿 约 1315m1，若内径 7cm 的平皿约 78m1，厚度约 34mm。凝固后即反转过来，底向上，以免在平皿盖 上积存凝结水，冷后置 4冰箱保存备用。 用途： 普通琼脂培

22、养基用于一般细菌的分离培养，纯种接种或保存菌种。 3、血液琼脂培养基 成分： 普通琼脂培养基 100ml 无菌脱纤维绵羊血或兔血 810ml 制法： （1）取已制备好的无菌普通琼脂 100ml，加热溶解并冷至 50左右。 （2）在已消毒的无菌室内打开瓶口，瓶口通过火焰杀死瓶口外的杂菌，用无菌吸管吸取 810ml 血液（临用前置 37水浴箱预温 30min），加入 100ml 普通琼脂培养基内，轻轻摇匀。 （3）在无菌条件下，倾注于无菌平皿中，冷凝后即成血琼脂平板培养基。凝固后即反转过来，底 向上，置 4冰箱保存备用。 用途：血液琼脂培养基用于分离培养或保存营养要求高的细菌，如链球菌、 肺炎链球

23、菌等。 4、巧克力色培养基 成分：同血液琼脂培养基 制法： （1） 同血液琼脂培养基，但在培养基中加入血液混匀后，须再置 80水浴轻轻摇匀 1015min， 使血液由鲜红色转变为巧克力色。 （2） 冷至 50左右，倾注于无菌平皿中，冷凝后即成巧克力色培养基。 （3）凝固后即反转过来，底向上，置 4冰箱保存备用。 用途：巧克力色培养基主要用于分离培养奈瑟菌属、嗜血杆菌属等。 5.半固体培养基 成分： 肉膏或肉膏汤 1000ml 琼脂 2.55g 制法： （1）将 2.55g 琼脂加到 1000ml 肉膏汤中，加热熔化，矫正 pH 至 7.4。 （2）分装于小试管中，每管约 23ml，加塞。 （3

24、）高压蒸气灭菌 15 磅 20min。 （4）冷却后 4冰箱保存备用。 用途：半固体培养基用于保存菌种或观察细菌的动力。 6.SS 培养基(见肠道菌) 【思考题】 培养基的制备程序可概括划分为那几个步骤来完成？ 【附录】 1、常用指示剂的配制： 指示剂的种类繁多，可按需要选择所需的指示剂。在矫正培养基的 pH 时， 一般多用酚红或溴麝香草酚蓝为指示剂。 （1）0.2g/L 酚红指示剂的配制： 称取酚红 0.lg，置于研钵中，一边研磨一边加入 0.01mol/LNaOH 溶液 28.2ml，然后加蒸馏水使其总量为 500ml 即成，用于 pH 的测定。 （2）0.4g/L 溴麝香草酚蓝指示剂的配

25、制： 称取溴麝香草酚蓝 0.4g，在研钵中随研随加 0.1mol/LNaOH 溶液 6.4m1，然后加蒸馏水至 100ml，即为 4g/L 溴麝香草酚蓝贮存液。贮存液加蒸馏水作 10 倍稀释即为 0.4g/L 溴麝香草酚蓝指示剂，用于矫正 pH 值。 2、矫正培养基 pH 图 232 比色架 1.培养基管 2.标准比色管 3.测定管 4.蒸馏水管 取与标准管同口径的试管(通常用华氏试管)3 支，于第 1、3 管各加入欲矫正 pH 的培养基 5ml，并 在第一管中加入 0.2gL 酚红液 0.25ml 作为测定管，混匀。第 2 管中加入蒸馏水 5ml，第 4 管为标准 pH 比色管。4 个试管分

26、别按图 232 插入比色架中进行比色。 若测定管中培养基过酸或过碱(多为偏酸)， 可用 0.1molLNaOH 或 0.1molLHCl 矫正，直到测定管颜色与标准比色管颜色相同为止。 加酸或加碱时要缓慢、准确，每加一滴后要充分混匀， 比色后再加一滴，准确记录加入的量。 计算：设 5ml 培养基矫正 pH7.4 需 0.1molL NaOH 0.15ml，现制培养基 1000ml，需加 NaOH 量为： 5:1000=0.15:X X=（0.151000）/5=30ml 若将 0.1molLNaOH 换算成 lmolLNaOH，则需 3ml。培养基 中加入所需 NaOH 后，充分混匀后，再测

27、一次 pH，如仍未达到所需求的 pH 值，再按以上法加以 矫正。 实验四 细菌的培养及生长现象观察 【目的】 1、熟悉细菌的培养方法。 2、掌握平板、斜面、液体和半固体培养基等接种方法。3、掌握 细菌在液体、固体、半固体培养基中生长现象和意义。 一 细菌的接种技术 【材料】 1、菌种：葡萄球菌和大肠埃希菌混合液、痢疾志贺菌、枯草芽胞杆菌、链球菌。 2、培养基：液体(肉汤)、半固体、固体(琼脂平板和斜面)培养基。 3、其他：接种环、接种针、酒精灯等。 【方法】 1、平板划线接种法： 主要用于临床标本中混杂着多种细菌的分离培养，经过划线接种，将细菌分散到固体培养基的表面，以获 得单个菌落。常用的平

28、板划线接种法可分为以下两种： （1）分区划线法 图 2-4-1 分区划线法 注意事项： 此法多用于含菌量较多的粪便、脓汁、痰液等标本的细菌分离培养。 具体操作如下： 1）右手以持毛笔式握住接种环，垂直在火焰上烧灼灭菌。 2）待接种环冷却后，取葡萄球菌和大肠埃希菌混合液一环。 3）左手持平板培养基，左手拇指、食指开启平皿盖，右手将取菌后的接种环在平板培养基表面一 角来回划线涂布，密而不重叠，接种环与培养基表面呈 3045o 角度，作为第一区，约占平板总表面积的 1/5。 划线时，以腕力在平板表面作 轻快的滑动动作，不可用力太大，以免划破培养基表面，并注意无 菌操作，防止空气中微生物的污染。 4）

29、再次烧灼接种环，以杀灭接 种环上剩余的细菌，待冷。 将 平皿转动 一定角度 进行第 2 区划线， 第 2 区划 线与第 1 区划线开始相交 23 条， 以后可不 必相交。约占平板表面积的 1/4。 再灭菌接 种环后用相同方法进行第 3 区、第 4 区划线。 5）种完毕，烧灼接种环，放回原处，平板底部做好标记（姓名、日期、标本名称等），倒置（平 板底部向上）于 37温箱中培养 1824h，观察结果（图 2-41）。 严格无菌操作：操作时不能说话，不能离酒精灯太远，平皿盖不能开得太大，以免空气污染； 划线时，力量要适中，切勿划破培养基表面； 充分利用平板表面，但第四区不能与第一区划线相交。 （2）

30、连续划线法 图 24-2 连续划线法 连续划线法又称平行划线法，此法多用于含菌量不多的标本或咽拭、棉拭的细菌分离培养。 具体操作如下： 1）将接种环在火焰上烧灼灭菌。 2）待接种环冷却后，以无菌操作取标本或少许菌液，涂布于培养基的 1/5 处， 3）然后在培养基表面连续左右划曲线，密而不重叠，并逐渐下移，将整个平板布满曲线。 4）接种完毕，烧灼接种环，放回原处。平板底部做好标记（姓名、日期、标本名称等），平板底 部向上于 37温箱中培养 1824h，观察结果（图 242）。 2、斜面培养基接种法: 图 24-3 斜面培养基接种法 主要用于纯培养、保存菌种及生化反应试验等。通常是从平板培养物上调

31、取某一单个菌落，移种至 斜面培养基上。 （1）左手持平板培养基（或同时持菌种管和接种管，见图 243），右手持接种环或接种针在火 焰上烧灼灭菌，待冷后挑取单个菌落。 （2）左手换取待接种的斜面培养基， 斜面部向上，以右手手掌与小指拔取并夹持 试管塞，管口通过火焰灭菌。 （3）将取菌后的接种环（针）伸入斜 面管内，先从斜面底部到顶部划一条直线， 然后再从斜面底部由下而上做蛇形划线。接 种环（针）进出试管时，均不应触及试管口内壁。 （4）将试管口和接种环（针）灭菌后放好，塞上试管塞。 （5）注明标记，置 37温箱培养 1824h 后观察生长情况。 3、液体培养基接种法： 主要用于增菌培养和生化反应

32、试验。 （1）左手拇指、食指、中指及无名指分别握持菌种管与待接种的肉汤管。 （2）接种环灭菌冷却后，分别从菌种管（大肠杆菌、枯草杆菌、链球菌）挑取少量菌苔或菌落移 种到肉汤管中。在接近菌面上方的管壁上轻轻研磨，并沾取少量肉汤与之调和，使细菌混合于肉汤中。 （3）灭菌试管口和接种环，加塞、标记，置 37温箱培养 1824h 后观察生长结果。大肠埃希菌 可出现均匀混浊生长；链球菌可出现沉淀生长；枯草芽胞杆菌为表面生长，形成菌膜。 图 244 液体（左）及半固体（右）培养基接种法 4、半固体培养基接种法： 主要用于检查细菌的动力和保存菌种。 （1）同液体培养基接种法，左手握住菌种管与待接种的半固体培

33、养基。 （2）右手持接种针灭菌冷却后，挑取接种管少量大肠埃希菌或痢疾志贺菌菌苔，垂直刺入半固体 培养基的中央，深入管底至 3/4 处（不必穿至管底），随即沿原穿刺线退出。 （3）试管口灭菌后加塞，注明标记，置 37温箱培养 1824h 后观察结果（图 244 右）。有 鞭毛的细菌（如大肠埃希菌）能够沿穿刺线向四周扩散生长，为动力实验阳性；而无鞭毛的细菌（如痢疾 志贺菌）只能够沿穿刺线生长，为动力实验阴性。 二 细菌的培养技术 【材料】 1、器材：温箱、磨口玻璃干燥器、厌氧培养箱、厌氧袋或厌氧罐、二氧 化碳培养箱等。 2、试剂：重碳酸钠、盐酸、焦性没食子酸等。 【方法】 常用的细菌培养方法可分为

34、四类，即普通培养法、二氧化碳培养法、厌 氧培养法和微需氧培养法。 1、普通培养法 用于无须特殊要求的需氧菌和兼性厌氧菌的培养。 是指需氧菌和兼性厌氧菌在有氧条件下的培养 方法。将已接种细菌的琼脂平板、斜面、半固体或液体培养基等，在空气中置于 37温箱，培养 1824h，观察细菌的生长情况。一般细菌培养 1824h 后即可出现生长迹象，但若标本中的细菌量少或 为生长缓慢的细菌(如分枝杆菌)，需培养 37 天，甚至 48 周后才能观察到生长迹象。 2、二氧化碳培养法 用于肺炎链球菌、奈瑟菌属、布鲁菌属和流感嗜血杆菌等的培养。 是将已接种细菌的培养基置于 510CO 2环境中进行培养的方法。某些细菌

35、特别是在初次分离时，需要在 510CO 2环境中培养 才能生长良好。常用的二氧化碳培养法有以下三种。 图 245 烛缸法 （1）烛缸法：取有盖磨口标本缸或玻璃干燥器，在盖及磨口处涂以凡士林。将接种细菌的培养基 放人缸中，再放人蜡烛并点燃之，加盖密封。随燃烧产生的 CO2增加，蜡烛自行熄灭，此时缸内 CO2的浓 度约为 510，然后放置 37温箱培养。 （2）化学法(重碳酸钠盐酸法)：每升容积的容器内，重碳酸钠与盐酸按 0.4g 与 0.35m1 比例， 分别将两种试剂各置于一容器内（如平皿内），连同容器放置于标本缸或干燥器内，盖紧盖后倾斜容器， 使盐酸与重碳酸钠接触而产生 CO2。 （3）二氧

36、化碳培养箱：能自动调节二氧化碳的含量、温度和湿度，培养物置培养箱内，培养一定 时间后能直接观察生长情况，使用较为方便，但价格较昂贵。 3、厌氧培养法： 用于专性厌氧菌的培养。必须将培养环境或培养基中的氧气除去，或造成低氧化还原电势的厌氧环 境，以利于专性厌氧菌生长。 常用的方法有：肉渣（庖肉）培养法、焦性没食子酸法（见厌氧菌）、厌氧罐培养法、厌氧袋培养 法及需氧菌共生厌氧法等（略）。 三 细菌生长现象观察 【材料】 1、菌种：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌、炭疽芽胞杆菌(无毒株)、痢疾志贺菌、 大肠埃希菌。 2、培养基：固体培养基（普通琼脂平板和斜面）、半固体培养基、肉膏汤、血液琼

37、脂培养基。 【方法】 1、接种细菌： （1）将金黄色葡萄球菌、炭疽芽胞杆菌(无毒株)分别用分区划线法，接种于普通琼脂平板和血液 琼脂培养基，将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌分别接种普通琼脂斜面。 （2）将枯草芽胞杆菌、链球菌和金黄色葡萄球菌分别接种于肉膏汤培养基。 （3）将痢疾志贺菌和大肠埃希菌分别用穿刺法接种于半固体培养基。 2、将上述接种细菌的培养基送 37温箱培养 1824h。 3、观察细菌的生长现象： （1）液体培养基：均匀混浊生长（葡萄球菌）、沉淀生长（链球菌）、菌膜形成（枯草芽胞杆菌 或铜绿假单胞菌）。观察细菌在其中生长时，应注意观察液体培养基的透明度，管底是否有沉淀，表面是 否有菌

38、膜。 （2）固体培养基：形成菌落和菌苔。观察菌落的大小、形状、突起（扁平、凹陷）、湿润度（湿 润或干燥）、透明度（透明、半透明、不透明）、表面（光滑、粗糙、有无光泽）、边缘、颜色、溶血环、 粘度及气味等情况。比较金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌、炭疽芽胞杆菌(无毒株)的菌落 特点。 （3）半固体培养基： 用于观察细菌有无动力。有鞭毛的细菌（如大肠埃希菌），动力阳性，沿穿刺线向周围扩散生长， 穿刺线模糊、增粗或呈根须状，培养基变混浊。无鞭毛的细菌（如痢疾志贺菌），动力阴性，沿穿刺线生 长，穿刺线清晰，周围培养基透明。 【思考题】 1、以上几种接种培养细菌的方法，各有何用途? 2、如何识

39、别琼脂平板培养基上出现的菌落是种上去的，还是杂菌污染的? 实验五 细菌的生化反应 【目的】 1、了解细菌各种生化反应的原理、方法、步骤、结果判断及用途。 2、要求熟悉常见细菌生化反应试验的名称。 一 糖发酵试验 【原理】 不同细菌含有不同的糖分解酶，因此分解糖的能力不同，有的产酸，有的尚有气体形成。检查细菌 对加在基础培养基中的特殊的糖发酵(降解)后产酸或产酸产气的能力，可协助鉴别细菌，尤其在肠道细菌 的鉴定中经常使用，有助于细菌的种、属鉴定。 【材料】 1、菌种：大肠埃希菌和伤寒沙门菌的琼脂斜面培养物各一支。 2、培养基：葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖和蔗糖发酵管各 2 支。每支管中放置一个倒

40、置的杜汉 氏(Durham)发酵小管，以测定气体产生。（也可使用商品化的微量发酵管进行实验。） 【方法】 1、将上述 2 种细菌分别接种葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖和蔗糖发酵管中。 2、置 37温箱中培养 1824h，观察结果。 【结果】 观察结果时，首先确定细菌是否生长，细菌生长则培养基呈混浊。再确定细菌对糖类分解情况，如 发酵糖类产酸，则培养基中指示剂（酚红或溴甲酚紫）变为黄色，可用“”号表示。 如发酵糖类后产酸又产气时，则培养基除变黄色外，在倒置的杜汉氏发酵小管中可有气泡出现，可 用“”表示。如细菌不分解该糖时，则指示剂不变色，培养基变浑浊，倒置的杜汉氏发酵小管中无气 泡，以“”表示之。

41、 二 甲基红试验 【原理】 该试验可检查细菌发酵葡萄糖产生并保持稳定的酸性终末产物和克服培养基中缓冲体系的能力。 这是一个检查某些细菌比其他细菌能够产生更多酸的定性试验(pH 测定)。 某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸继续被分解，则可产生甲酸、乙酸、琥珀酸、乳酸等，这 样使培养基的 pH 降至 4.5 以下，这时加入甲基红（MR）指示剂呈红色。 若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质（如：醇、酮、醛、气体和水等）， 则培养基的酸度仍在 pH6.2 以上，故加入甲基红指示剂呈黄色。 本实验常用于鉴定大肠埃希菌（）与产气肠杆菌（）；阴沟肠杆菌（）和克雷伯菌属（一般 为）；耶尔

42、森菌属（）。也可用于鉴定单核细胞增生李斯特氏菌（）。 【材料】 1、菌种：大肠埃希菌、产气肠杆菌斜面琼脂斜面培养物各一支。 2、培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基 2 支。 3、甲基红试剂（pH 感应界为 4.46.0，色调变更由红黄）一瓶。 【方法】1、将大肠埃希菌、产气肠杆菌分别接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，37培养 48 小时。 2、分别滴入甲基红试剂 23 滴，观察结果。 【结果】 阳性：培养基呈红色，用“”表示。 阴性：培养基呈黄色，用“”表示。 本实验中大肠埃希菌为“”，产气肠杆菌为“”。 【注意事项】 细菌的培养时间不应少于 48h，若过早地进行结果判定，则常出现模棱两可的或假阳性的结

43、果，因 MR 阴性菌还没有足够的时间对葡萄糖发酵积聚的最初酸性产物进行完全代谢。所以假如仅孵育 1824h， 所有结果均有可能为 MR 阳性。 三、吲哚试验 【原理】 有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚（即靛基质）。吲哚无色，不易观察， 加入吲哚试剂后，试剂中的对二甲基氨基苯甲醛与吲哚结合，生成红色的玫瑰吲哚，易于观察。主要用于 肠杆菌科细菌的鉴别。 【材料】 1、菌种：大肠埃希菌、产气肠杆菌斜面琼脂斜面培养物各一支。 2、培养基：蛋白胨水培养基（加入 1%色氨酸的效果更佳）2 支。 3、吲哚试剂一瓶。 【方法】 1、将大肠埃希菌、产气肠杆菌分别接种于蛋白胨水中，37培养 2

44、4h48h，备用。 2、取出培养物后，沿管壁加入吲哚试剂数滴，即刻观察结果。 【结果】 阳性：两液接触面出现玫瑰红色环，用“”表示。 阴性：两液接触面仍为黄色，用“”表示。 本实验中大肠埃希菌为“”，产气肠杆菌为“”。 【注意事项】 1、若用 24h 培养物检测吲哚的产生，建议取出 2ml 来做试验。24h 后出现阳性反应，表示试验成功。 苦 24h 的培养物是阴性，剩余的培养物应继续孵育 24h 后再行试验。 2、蛋白胨中色氨酸含量与实验结果密切相关，蛋白胨肉汤做吲哚试验时，要用已知吲哚阳性菌做 试验，以检查蛋白胨是否含有足够的色氨酸适合吲哚的产生，同时检查最适孵育时间。如果加入 1%的色

45、氨酸或采用含色氨酸量高的胰酪胨做吲哚试验效果更佳。 3、不要用含葡萄糖的蛋白胨水培养基来检查吲哚。因产生吲哚的细菌都能发酵糖类，通过氧化过 程利用糖类的细菌是不能产生吲哚的。葡萄糖发酵产生的高酸度，可阻止细菌生长或抑制酶活性。 四、硫化氢试验 【原理】 某些细菌具有半胱氨酸酶，能分解培养基中的含硫氨基酸（如胱氨酸和半胱氨酸）生成硫化氢，硫 化氢是一种无色气体，与培养基中的醋酸铅或硫酸亚铁作用生成黑色的硫化铅或硫化亚铁沉淀。黑色沉淀 越多，表示生成的硫化氢量也越多。在肠杆菌科细菌的鉴别中具有重要作用。 COOHCHNH2CH2SSCH2CHNH2COOHH24H2OH2S2NH32CH3COOH

46、2HCOOH H2S Pb(CH3COO)2 PbS 2CH3COOH H2S FeSO4 FeS H2SO4 【材料】 1、菌种：大肠埃希菌、普通变形杆菌斜面琼脂斜面培养物各一支。 2、培养基：硫酸亚铁琼脂培养基 2 支。 【方法】 将上述菌株穿刺接种到培养基中，经历 37 24h 培养后，观察结果。 【结果】 培养基呈黑色为阳性（普通变形杆菌），用“”表示。 不变黑色为阴性（大肠埃希菌），用“”表示。 【注意事项】如果主要目的是观察细菌产生硫化氢的情况，尽量不要选用含蔗糖的三糖铁培养基， 因为蔗糖的利用有抑制产生硫化氢酶活性的作用。 五、V-P 试验 【原理】 V-P(Voges-Pros

47、kauer)试验是检查葡萄糖代谢产生的中性最终产物乙酰甲基甲醇。 细菌在葡萄糖代谢中生成中间代谢产物丙酮酸，随细菌种类不同，丙酮酸的代谢途径有多种，使其 进一步分解的最终产物有所不同。某些细菌如产气肠杆菌具有丙酮酸脱羧酶，可使分解葡萄糖后产生的丙 酮酸脱羧生成中性的乙酰甲基甲醇，后者在碱性条件下，可被空气中的 O2 氧化成二乙酰，二乙酰可与培 养基中精氨酸的胍基起作用，生成红色化合物。 常用于肠杆菌科细菌的鉴别。 【材料】 1、菌种：大肠埃希菌、产气肠杆菌斜面琼脂斜面培养物各一支。 2、培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基 2 支。3、V-P 试剂：一套（A 液和 B 液）。 【方法】1、将大肠埃希菌

48、、产气肠杆菌分别接种于上述培养基中，置 37培养 24h48h 后， 备 用。2、分别取 2ml 培养物，加入 A 液（6%-萘酚酒精溶液）1ml，再加入 B 液（40%氢 氧化钾溶液） 0.2ml，充分振荡，室温下静置 5min10min 观察结果。 【结果】 呈红色反应为阳性（如产气肠杆菌）；如无红色出现，需要置 37 4h，仍无红色反应者 为阴性（如大肠埃希菌）。 【注意事项】 1、牛肉浸液肉汤不能用作该试验的培养基，因为在肌肉提取物中含有乙酰甲基甲醇、双乙酰和其 他有关物质，会产生假阳性试验结果。 2、加入 VP 试剂的次序是非常重要的。首先加入 -萘酚，然后加入 KOH。加入试剂的顺

49、序颠倒可 产生弱阳性或假阴性结果。 3、要准确地加入 0.2ml 40的 KOH，不能超过此量。因 KOH 过多，它可与 -萘酚反应出现类似铜 的颜色，从而使 VP 弱阳性反应不易被发现。 六、枸橼酸盐利用试验 【原理】 枸橼酸盐培养基不含任何糖类，枸橼酸盐为唯一碳源、磷酸二氢铵为唯一氮源。当有的细菌(如产 气肠杆菌)能利用铵盐作为唯一氮源，并能同时利用枸橼酸盐作为唯一碳源时，便可在此培养基上生长， 分解枸橼酸钠，使培养基变碱，培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。 【材料】 1、菌种：大肠埃希菌、产气肠杆菌斜面琼脂斜面培养物各一支 2、培养基：枸橼酸盐培养基 2 支。 【方法】 将细菌分别接种于上述培养基斜面上，于 37培养 14 天，每日观察结果。 【结果】 培养基斜面上有细菌生长，而且培养基变蓝色为阳性（如产气肠杆菌）；无细菌生长，培养基颜色 不变，保持绿色