1、SDS-PAGE 电泳操作步骤： 试剂配制： （实验中采用均为分析纯） （1）丙烯酰胺贮液 （4下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久） 丙烯酰胺贮液（T=30%，C=3%） 称取 29.1 g 丙烯酰胺和 0.9 g 甲叉双丙烯酰胺，用双蒸水溶解，定容至 100 ml， 过滤备用。(试剂有毒，操作中注意防护) （2）浓缩胶缓冲液（1 mol/L Tris-HCl，pH 6.8） （4下棕色瓶中储存，试剂尽 量勿存储过久） 6.06 g Tris 溶解于 35 ml 双蒸水中，用浓盐酸调节 pH 至 6.8，再用双蒸水定容 至 50 ml。 （3）分离胶缓冲液（1.5 mol/L Tris-HCl
2、，pH 8.8） （4下棕色瓶中储存，试剂 尽量勿存储过久） 18.16 g Tris 溶解于 75 ml 双蒸水中，用浓盐酸调节 pH 至 8.8，再用双蒸水定容 至 100 ml。 （4）10% SDS （5）10% 过硫酸铵（APS ）：使用前新鲜配制，低浓度 APS 一般当天用当天 配制，勿过夜使用。 （6）尿素 （7）TEMED(N，N，N，N-四甲基乙二胺) （8）电极缓冲液(1) （棕色瓶中 4储存，一般使用 3-4 次） 0.025 mol/L Tris，0.192 mol/L 甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3 （9）电极缓冲液(2) （棕色瓶中 4储存，一般使用 3-4
3、 次） 0.050 mol/L Tris，0.384 mol/L 甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3 （10）样品缓冲液（pH 6.8） （4下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久） 1.6 ml 浓缩胶缓冲液（ pH 6.8）+ 4 ml 10% SDS + 0.6 g 二硫苏糖醇(DTT) + 2.5 ml 87%甘油+0.1 mg 溴酚蓝，用双蒸水稀释到 20 ml. （11）考玛斯亮蓝 R-250 染色方法： a固定液 20%三氯乙酸 b脱色液 250 ml 乙醇，80 ml 冰醋酸，加水稀释至 1000 ml。 c染色液 称取 0.29 g 考玛斯亮蓝 R-250 溶于 250 ml
4、 上述脱色液中 样品处理： 处理完样品应尽快使用，若存储，须于-20下。 .CytC 酶解样 1 每管分别加入 8 l 细胞色素 C（20 mg/ml） ，10 ul 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）,1 l 胰蛋白酶（细胞色素 C：胰蛋白酶=50：1） 。37 水浴，2 h。立即放入-20 冰箱冷冻保存备用。上样前加 15 上样 BUFFER，75水浴 5-10min 大肠杆菌蛋白2. 取 10 工程菌种接入 10nml LB 液体培养基里，过夜培养 12h，取出 1ml 菌液 离心 10000g/r，5min。弃上清，用 1ml Tris-Hcl （pH 8.0 50mM）洗涤
5、 1-2 次， 后分别加入 20（pH8.0 5mM） 、10EDTA，-20保存。上样前加入 2 5%X，再加入 50 上样 BUFFER，75水浴 5-10min .CytC 3 15 CytC 加入 15 上样 BUFFER，75水浴 5-10min .低分子量肽标准 4 取 8-10 Maker（2mg/ml ）,加入 10 上样 buffer，再加入 5 ddH2O，75 水浴 5-10min .SPI 多肽的制备 5 材料及试剂（试剂均为分析纯） 纯大豆粉 木瓜蛋白酶（sigma P3250 500-2000AU/g） 正己烷 巯基乙醇 Tris-HCl缓冲液（0.03 M、pH
6、8.0） 0.2 M HCl 叠氮钠 考马斯亮蓝G250 标准牛血蛋白 制备方法 .SPI制备：大豆分离蛋白的制备参照Iwabuchi 和Yamauchi 9的方法, 具体步骤如下: 全脂豆粉加正己烷(1/5)室温下搅拌1 h脱脂，于3 000 g 离心5 min, 取沉淀反复脱脂两次 , 于沉淀中加入1520 倍含10 mM 巯基乙醇0.03 M、 pH 8.0 的Tris-HCl 缓冲液, 室温搅拌12 h, 于20 6 000 g 离心25 min,取上清液,用0.2 M HCl 调节pH 至4.8, 置于冰箱下层冷沉过夜, 再于4 9 000 g 离心20 min, 取沉淀分散于少量水
7、中, 调节pH 至7.0, 搅拌1 h 充分溶解后于4 下用含0.05 % 叠氮钠的蒸馏水透析2 d, 再用蒸馏水透析两 次去叠氮钠, 冷冻干燥即得大豆分离蛋白(SPI)。 （可能透析会损失掉一定量的 多肽。 ） .SPI蛋白含量测定：利用考马斯亮蓝蛋白含量测定法，根据牛血蛋白作出的 标准蛋白曲线，测定SPI的蛋白浓度：（具体方法参见生物化学实验原理和方 法P174 ） 标 准 蛋 白 曲 线 0.453 0.559 0.725 0.768 0.84 1.035 1.16 00.2 0.40.6 0.81 1.21.4 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06蛋 白 浓
8、度 吸光度 吸 光 度线 性 (吸 光 度 ) 测得1%（1mg/ml）的SPI吸光度为0.779 ，求得即在SPI质量分数为1%的情况 下，其蛋白浓度约为3mg/ml. .SPI多肽制备：本实验采用木瓜蛋白酶水解SPI，制取SPI 多肽。标准的酶解 体系为溶于0.05 mol/L, pH8.0Tris-HCl 缓冲溶液的SPI 溶液(质量分数为2%),含 质量分数为0.05% 的叠氮钠,先于38 下预热5 min,分别添加蛋白酶至750 AU/mL，然后继续于反应温度下反应，反应时间也很影响SPI多肽的产率，木 瓜蛋白酶持续低温水解16小时也可以产生较多小肽。反应混合物可定期取样并 分别加入
9、X- PAGE样品缓冲液终止反应(1: 1, v/v)。实验上样一般采用过夜酶 解透析样(2%*5%)。上样前应将酶解样与样品缓冲液混合物水浴。 操作方法： 所制均为 1.0mm 小板所需体积 （1）配制分离胶（16.5%T, 3%C）： 丙烯酰胺贮液3ml 分离胶缓冲液1.5ml 尿素2.16g 10%SDS72 （2）配制浓缩胶（4%T, 3%C） 丙烯酰胺贮液0.34ml 浓缩胶缓冲液0.24ml ddH2O 1.4ml 10% SDS24 （3）将上两步配制的分离、浓缩胶真空抽气 15min，同时配制 10%过硫酸铵: 准确称量 0.1g 过硫酸铵固体（因其易氧化，操作尽量快，且尽量从
10、底部取样） ， 溶于 1ml 双蒸水中，即配即用，低浓度 APS 只限当天使用。 （4）吸取 22l 过硫酸铵及 5lTEMED 于分离胶中，轻轻混匀，灌胶，小心的 在分离胶的表面加封一层水，封住胶面。注意分离胶与浓缩胶的比例。 （5）大约 40min，待分离胶聚合形成界面后，吸掉水，加 11l 过硫酸铵及 4lTEMED 于浓缩胶中，轻轻混匀，灌注浓缩胶，慢慢斜插入梳子（以免产生 气泡） 。 胶配制完成之后可直接放置于室温下，而且切忌即配即用及 4下冷藏，应使 其充分凝固，这样可以在一定程度上提高分辨率。 （6）样品处理【此省略】 （7）上样：将处理好的样品依据其蛋白浓度加入上样 buffe
11、r，水浴后离心，去 适量体积加入上样孔内，切忌样品直接互相污染（上样量一般 8-12g，视样品 不同而异） （8）电泳：将电极缓冲液注入电泳槽中。恒流情况下，电压一般设为最大值 (300V),在分离胶内电流一般为 10mA 左右，大约 30min 左右，样品前沿跑过分、 浓界面后，电流加大为 20-25mA，整体电泳时间约 2 h；恒压条件下，浓缩胶内 电压取 60V，电流一般设最大值，样品跑至分、浓界面后电压加大到 120V，整 体电泳时间约 2.5h。 （9）染色：利用考玛斯亮蓝 R-250 染色系统固定、染色和脱色：电泳完毕后， 将胶置于固定液中固定 1 h，然后放置于染色液中染色过夜，转置脱色液中脱色， 并多次更换脱色液，直至背景清晰。 （10）观察分析电泳结果
