透明质酸(玻尿酸).doc

1、0 目录 1、透明质酸的简介 2 2、透明质酸的结构及理化性质 2 2.1 透明质酸的结构 2 2.2 透明质酸理化性质 2 2.3 透明质酸生理功能 .3 3 透明质酸的制备方法 .3 3.1 动物组织提取法 .3 3.2 酶聚人工合成法 .4 3.3 微生物发酵法 .4 3.3.1 透明质酸生产菌株的选育 5 3.3.2 透明质酸发酵条件的优化 5 3.3.3 透明质酸的提取 6 4 透明质酸的改性 11 4.1 酯化改性 .11 4.2 酰胺化改性 .12 4.3 交联改性 .13 4.4 疏水改性 .14 4.5 接枝改性 .15 4.6 还原末端改性 .16 5 透明质酸的应用 17

2、 5.1 在化妆品中的应用 .17 5.2 在临床医学中的应用 18 5.3 在保健食品中的应用 .18 6 透明质酸的国内外生产研究现状及常见产品 18 6.1 透明质酸的国内外生产研究现状 18 6.2 常见产品 20 7 我的设计方案 20 参考文献： 22 1 透明质酸简介 1、透明质酸的简介 透明质酸(Hyaluronic Acid，简称 HA)，又名“玻璃酸”，是一种不含硫 酸基团的天然粘多糖，广泛分布于动物和人体的细胞外基质中，在皮肤、肺和 肠中含量较高(大于 50%)，同时也存在于滑液、脐带和血液中。透明质酸另一 名称为玻尿酸，但是玻尿酸与尿酸没有任何关系。 透明质酸因其独特的

3、理化性质和生物学功能，被广泛应用于临床医学、高 级化妆品、美容整形和保健食品等领域。但天然透明质酸存在稳定性较差、易 发生降解和亲水性过强等缺点，限制了其应用，因此通过对透明质酸修饰改性， 从而开拓具有新的生物活性和功能性的透明质酸衍生物成为目前研究的热点 1。 2、透明质酸的结构及理化性质 2.1 透明质酸的结构 透明质酸是一种高分子的聚合物。是由单位 D-葡萄糖醛酸及 N-乙酰葡糖胺 组成的高级直链粘多糖。D-葡萄糖醛酸及 N-乙酰葡糖胺之间由 -1，3-配糖键 相连，双糖单位之间由 -1，4-配糖键相连。分子中两种单糖按 1:1 的摩尔比 组成。双糖单位可达 25000 之多。在体内透明

4、质酸的分子量从 5 千到 2 千万道 尔顿 2,3。 2.2 透明质酸理化性质 电子显微镜下观察证实 HA 为一线性单链, 分子量为 4106, 链长约为 10m。由于直链链轴上单糖之间氢键的作用,HA 分 子 在 空 间 呈 刚 性 的 2 螺 旋 柱 型 , 其 半 径为 200nm, 柱内侧因有大量羟基而产生强亲水性。在 溶 液 中 HA 结 合 的 水 分 可 达 其 本 身 重 量 的 1000 倍, 且这些水 在螺旋柱内固定不动, 不易流失 4 。 HA 水溶液是一种非牛顿型流体, 有着良好的粘弹性和应变性。一般来说, 溶液浓度和分子量的增加会使溶液粘度增加。低浓度的 HA 溶液主

5、要表现为粘 性, 而高浓度溶液则主要显示其弹性 5。 2.3 透明质酸生理功能 在生物组织中，HA 以游离形式广泛分布于结缔组织的细胞外基质中，是细 胞外基质（ECM）的主要成分之一，在保持组织抗压缩性及张力和维持组织形态 方面具有重要作用。而 HA 在体内不仅是通过其粘弹性、大分子网状结构等发 挥细胞连接、物理屏障、渗透压调节和机械离缓冲等功能，而且具有灭活自由 基、调节细胞功能等生理活性，在肿瘤扩散、伤口愈合、胚胎形成、抑制疼痛 和炎症反应中具有重要的作用 6。 HA 为关节滑液的主要成分之一，因其独特的润滑特性，对维持关节功能具 有重要意义（杨小立，2006；王国金，2009；Gasto

6、n et al.，2007）。据研究 表明（郭学平等，2002）HA 具有抗皮肤衰老和防止皮肤皱纹形成功能，阳光中 紫外线照射所产生的活性氧自由基能被表皮中的 HA 可清除，保护皮肤免受其 害，被称为高效的自由基“清道夫”。HA 在皮肤中表现的生理功能还有保水作 用，维持细胞外的空间，参与角蛋白细胞的变化过程和受体结合作用等。 3 透明质酸的制备方法 3.1 动物组织提取法 HA 几乎存在于所有的动物组织中，分布广泛。提取 HA 的传统方法是以动 物组织为原料，从人脐带（Lagoa G et al.，2005 ；沈渤江等，1985）、鸡冠 （颜延宁，2006）、牛羊眼珠的玻璃体（Tadashi

7、 Y et al.，2004）、鲸鱼软 骨中（E.Yu.Ignatova et al.，1990）来提取 HA。动物组织提取法对原料要求 较高，原料必须是新鲜采集的，并经过冷冻处理。动物原料组织价格昂贵、来 源困难，并这些动物原料组织中 HA 纯度低、收率低。在提取过程中，要消耗 大量的有机溶剂和酶，并且操作单元多、工艺复杂，会大大增加制备 HA 的成 本。此外，从动物组织中提取的 HA 杂质含量高，产品精制困难。总之，由于 3 该方法制备 HA 生产成本高，原料来源有限，HA 纯化工艺复杂，动物原料组织 提取法已不能满足目前市场的需要，已逐渐被发酵法所取代。 3.2 酶聚人工合成法 通过研究

8、表明, 在生物体内 HA 是通过透明质酸合成酶催化 UDP-G1cA 和 UDP-G1cNAc 合成 7利用单体酶催化在体外聚合合成透明质酸, 首先使用多糖类 聚合物合成透明质酸氧氮杂环戊烯衍生物, 然后添加透明质酸分解酶制造出衍 生物和酶的复合体, 接着在 90反应液中清除其中的酶合成透明质酸, 然后再 对其进行沉淀、分离即可得到透明质酸精品。凌敏等 8根据从 Streptococcus equi 扩增出透明质酸合成酶 (sqHAS)基因 , 构建表达质粒 pSE-sqHAS 并转化 大肠杆菌 DHSa, 诱导培养后在细胞膜中检测到 sqHAS 蛋白及活性。利用携带 该酶的细胞膜以 UDP-

9、G1cA 和 UDP-G1cNAc 为底物在体外合成了分子量为 3.6106Da 的 HA, 分别是发酵法生产和提取法生产的 HA 的分子量的 2.5 倍 和 5 倍左右。但是 HA 体外合成的前体物质价格昂贵, 难于应用于实际工业化 生产中, 因此这种方法仅适用于生产高分子量、高纯度具有特殊用途的 HA。 3.3 微生物发酵法 发酵法制备透明质酸可以最早可以追溯到 70 年代，但一直没有大量开发， 直到 1985 年，日本资生堂首次报道了用链球菌生产透明质酸的方法后，发酵法 制备透明质酸才有了长足的进展。已报道的产透明质酸菌主要为伯杰氏手册中 链球菌的 A 组与 C 组，如化脓链球菌(Str

10、ep tococcus pyogenes A 群)、兽疫 链球菌(Streptococcus 200epidemicus (群) )、马疫链球菌( Streptococcus egui c 群) 、类马链球菌 (Streptococcus eguismilis c 群) 、缺 乳 链 球 菌 ( c 群) 、鸡霍乱杆菌等。 A 群主要是化脓链球菌，系人体致病菌，不宜作 为生产菌种，目前很少使用。C 群链球菌为非人体致病菌，相对来说适用于工 业生产。国外近年来利用 C 群链球菌生产透明质酸已达到产业化阶段。 利用发酵法制备透明质酸的品质主要取决于如下四个方面：菌种的筛选、培养 基的选配、发酵工艺

11、的优化和分离提纯过程。生物发酵法的优点是产品不受原 料资源限制、工艺简单并且成本低，所以目前对于透明质酸的制备多选用发酵 法。发酵法制备透明质酸目前所用的菌种主要有兽疫链球菌、马疫链球菌和类 马疫链球菌等。发酵法制备透明质酸分为需氧发酵和厌氧发酵，其中需氧发酵 产率高且得到的透明质酸分子量高。在发酵过程中，温度通常为 37，pH 值需 要控制在 6.0-8.5 范围内，过酸过碱的环境都会影响菌体生长，降低透明质酸 4 的产率。也可在不同发酵阶段采用不同的溶氧量来提高透明质酸的产率。此外， 发酵液黏度可直观反映出透明质酸的产率，透明质酸的假塑性在高剪切速率作 用溶液黏度下降，高搅拌速率能显著提高

12、透明质酸的分子量，但过高的速度会 破坏分子反而降低透明质酸的分子量，所以搅拌速度通常控制在 100800r/min。也可通过在发酵液中加入少量尿嘧啶、谷氨酰胺和天冬氨酸， 或加入溶菌酶来提高透明质酸产率 9-12。 3.3.1 透明质酸生产菌株的选育 野生型的链球菌作为 HA 产生菌, 首先要经过诱变使其成为溶血素和透明 质酸酶缺陷型菌株。链球菌多会产生溶血素( Streptolysin) , 溶血素有溶解 红细胞、杀死白细胞和毒害心脏的作用。溶血素混入成品 HA, 还会使 HA 的品 质降低, 不能用于医药品和化妆品, 所以规模生产必须获得非溶血性的菌株。 邓开野 13从血琼脂平板上筛选出一

13、株不具有溶血性的突变菌株, 其性能比原始 菌株有很大提高。野生型的产生 HA 的链球菌在产生透明质酸的同时产生透明 质酸酶, 透明质酸酶可将透明质酸降解或低分子量化, 因此透明质酸酶的产生 对 HA 的发酵非常不利。虽可采用在发酵培养集中添加透明质酸酶的抑制剂, 如藻酸硫酸盐等的方式来提高 HA 的产量。但现在发酵生产上所采用的菌种, 一般都是经诱变处理得到的透明质酸酶的缺陷型。冯建成 14对马疫链球菌 SH- 0 进行诱变,筛选出溶血素和透明质酸酶双缺陷型突变菌株 SH-2,使透明质酸产 量提高 5 倍。诱变菌种的目的是为了获得 HA 产量高、优良性状稳定的菌株。 孙建 15通过紫外线和 N

14、TG 复合诱变处理得到溶血性弱的菌株,突变菌株比出发 菌株透明质酸产量提高 1 倍以上。张淑荣等 16利用物理方法紫外线, 射线 及辅助磁场筛选诱变兽疫链球菌, 研究获得性状优良,产量相对稳定的透明质酸 高产菌种, 透明质酸产量可稳定在 35g/L。罗强 17 采用 NTG 诱变原生质体,选 育了一株产透明质酸的兽疫链球菌( Streptococcus zooepidemicus) H235。化 学诱变剂污染环境、操作不安全, 因此较为安全的物理诱变方法越来越受到人 们的关注, 但诱变剂量的大小以及突变后菌株的回复突变是采用物理诱变剂所 需进一步研究的工作。目前, HA 产生菌的诱变方法多为紫

15、外线照射和化学诱变 剂等常规方法。另外, 郝宁 18等运用基因诱变育种将 vgb 基因导入兽疫链球 菌以促进细胞在低氧状态下的生长, 同时 HA 合成基因的导入将增加 HA 合成 途径的前体供应, 使 HA 产量增加 31%。此法生产的 HA 相对分子质量相对均 一、分散性小,由于 2 个前体物 UDP-N-乙酰氨基葡糖和 UDP-葡萄糖醛酸价格 昂贵。因此, 此法生产 HA 成本高, 目前只用于实验室中。 3.3.2 透明质酸发酵条件的优化 5 链球菌的营养需求较为苛刻, 通常在含血清、脑心浸液等培养基上菌体才 能较好地生长, 但这类营养物质价格昂贵, 大规模生产成本太高, 所以通常以 蛋白

16、胨、酵母膏或浸出粉、牛肉浸膏等的复合氮源代替。另外, 有研究表明在 发酵液中添加一定量的谷氨酸和精氨酸, 可以提高 HA 的产率。国内外文献资 料大多使用葡萄糖作为碳源, 也有用蔗糖、半乳糖等研究链球菌的利用情况, 姚敏杰等 19以不同碳源进行对比实验, 发现只有蔗糖不能被利用, 而高海军 20等 发现蔗糖仅比葡萄糖利用率低。考察兽疫链球菌对于常用碳源的利用情况,发现 可溶性淀粉作碳源其菌体量和透明质酸产量较大; 其次, 才为葡萄糖和蔗糖。 产生如此大的差异的原因是因为菌种的差异还是方法所造成的仍需要深入的研 究。氮源不仅为菌体长氮元素, 而且大多数有机氮源还能提供多种生长因子。 国外有报道用

17、化学合成培养( Chemical defined media) 与酵母粉为复合氮源 培养基比较, 发现在化学合成培养基中兽疫链球菌生长速率降低, 而 HA 产率 系数和比合成率却与复合氮源中的类似。国内大多采用有机物作为氮源, 包括 胨、酵母膏、大豆水解物等。不同的菌株对于氮源利用情况相差也大, 高海军 21等发现酵母膏作为单一氮源时, HA 产量及菌体量均较高, 其次为酵母膏与 蛋白胨的混合氮源以及玉米浆。安海平 22等发现对于马链球菌 N2506, 蛋白胨 与酵母膏以 1: 1 比例效果最好, 无机氮源对 HA 发酵过程作用不大。 Ogrodowski 等 23发现添加溶菌酶能够提高透明质

18、酸的产量, 这是因为透明 质酸生产菌需分泌大量的透明质酸以保护其细胞壁免遭破坏;同时, 溶菌酶能诱 导透明质酸合成酶的活性。在发酵过程中添加含有羟基的酚类化合物如苯酚、 丹宁等能大幅提高透明质酸的产量;此外葡糖胺、丙酮酸、尿嘧啶等因为是 HA 合成的前体物质, 通过添加也可获得高分子量的 HA24。孟庆繁 25添加 十二 烷基硫酸 钠( SDS) 能够大幅度提高 HA 产量。这是因为菌体在产生 HA 的同 时会产生 HA 酶, 该酶可以使 HA 分解,导致 HA 产量下降。而 SDS 作为 HA 酶活性抑制剂,保护 HA 不被降解。 3.3.3 透明质酸的提取 发酵法之所以没有得到广泛应用其原

19、因是多方面的, 其中对发酵液中 HA 产 物的提取工艺不成熟是一个重要方面。具体表现在缺少一条被广泛认可和接受 的可用于工业生产的下游分离工艺。分离纯化发酵液中的 HA 有多种报道, 如 有机溶剂沉淀法、离子交换法等。沉淀 HA 的有机溶剂有乙醇、丙酮、乙酸等, 有机溶剂的作用是通过降低水溶液的介电常数从而增加溶质分子异性电荷库仑 力的引力达到沉淀的目的。 3.3.3.1 预处理 6 预处理是在分离纯化前对发酵液进行灭酶、灭菌、除菌的工艺。对于一些 非透明质酸酶缺陷型菌株发酵所得的发酵液，通过预处理可以杀灭透明质酸酶， 减少 HA 分子量的降低。史鹏等 26采用两种预处理方式进行灭酶，热处理方

20、式 为发酵液在 70 下保温 1 h，静置 5 h；酸处理方式为发酵液用三氯乙酸调 pH 值至 4.5，1 h 后回调至 6.0，静置 5 h，两种预处理方式的蛋白质去除率、 HA 得率很接近，但酸处理的分子量降低率要低于热处理，表明酸处理能更有效 的抑制透明质酸酶的活性。 杀灭发酵液中的菌体通常加入杀菌剂，常用的杀菌剂包括三氯乙酸、氯仿 等。三氯乙酸可以溶解细胞上的脂类物质，使细胞破坏，从而起到灭菌和抑制 酶活力的作用。氯仿和三氯乙酸的作用类似，能够使 HA 逐渐从细胞膜上脱落 27，使蛋白质变性沉淀，并能渗入细胞膜，除去细菌内毒素等致炎物质，使 HA 产品安全性提高 28。采用加热进行灭菌

21、，灭菌温度一般为 7580 29， 国外专利报道，将发酵液加热到 90 ，再除去菌体 30。 通过有效除菌可以改善分离效果，使 HA 分离得率提高，同时也可以去除 部分杂蛋白。除菌的方法较多，祝庆等 31比较了微滤除菌和经盐酸、甲醛和三 氯乙酸分别处理后再离心除菌的效果，发现微滤除菌效果最好，但微滤过程中 需要加压和不断稀释，在后期沉淀阶段需消耗大量有机溶剂，滤速慢也使得整 个分离周期延长，因此工业化生产可行性不大。相对于盐酸法、甲醛法，三氯 乙酸除菌法 HA 产量和质量均有提高，这是由于三氯乙酸的加入使 HA 与蛋白质 的络合有一定的解除。邓禹等 32采用 25 g/L 三氯乙酸灭活菌体并使

22、蛋白质变 性沉淀，以混合硅藻土为过滤助剂，再配以特定的后处理工艺，所得成品透明 质酸中蛋白质含量仅为 0.047%。周荣清等 33比较了絮凝、离心、三氯乙酸 3 种预处理方式对超滤膜污染的影响，所采用的絮凝剂为阴离子型聚丙烯酰胺 （AN926），添加量为 100103mg/mL，絮凝预处理的上清液经超滤后膜通量 降低率仅为其它两种方法的 1/10，表明絮凝法预处理可以有效除去菌体和杂蛋 白，改善膜分离效果郭育涛等 27采用发酵液中加入 2 倍体积的氯仿除菌体的方 法，在 28 、pH 值为 7.0 的条件下搅拌 60 min，离心后，HA 提取率达 97.5%，纯度达 97.3%。国外专利报道

23、了采用过滤除去菌体的方法 33,34。盛瑞 堂等 35也采用过滤法除去菌体，并发现使用硅藻土作为吸附剂时的滤液浊度和 终滤液 HA 收率优于活性炭。在 HA 发酵结束后，将发酵液加入工业乙醇得到 HA 粗品沉淀，以 20 g/L 的浓度溶于去离子水，加入硅藻土，充分搅拌以吸附 菌体杂质，在 pH 值 4.64.8 的条件下过滤，滤液在 pH 值为 4.8 时浊度最 小，在 pH 值为 4.6 时蛋白含量最低，蛋白含量和浊度变化趋势随 pH 值改变 基本一致。过滤法除菌体是物理过程，操作简便，效果明显，并且容易在工业 7 化生产中应用。 3.3.3.2 分离工艺 3.3.3.2.1 乙醇分离 除

24、去发酵液中的菌体后，需要将 HA 分离出来，这是一个初步纯化的过程。 乙醇沉淀是分离各种多糖常用的一种方法，可以使 HA 有效脱水、脱色，从而 提高 HA 产品品质 26。为了使 HA 完全沉淀，溶液中应有足够的离子强度，常 加入浓度为 1%左右的 NaCl 或 NaAc 以达到适宜的离子强度。乙醇添加量一般 为发酵液体积的 2 倍 27，如果乙醇添加量足够大，HA 浓度低至 0.1%也可沉 淀完全 28。HA 溶液具有较高的黏度，乙醇沉淀时如果 HA 浓度过高，沉淀趋向 于糖浆状而难以分离；如果浓度过低，所需乙醇量偏大，不利于降低成本 29。 预处理时由于发酵液黏度较高，离心或过滤前往往要对

25、发酵液进行稀释，HA 常 因稀释而浓度较低，直接采用乙醇沉淀会消耗大量乙醇，而浓缩可以减少乙醇 用量。盛瑞堂等 35采用超滤法对过滤后的发酵液进行浓缩，使 HA 溶液体积减 少了 67.1%，相应的乙醇用量降低了 67.1%。孙宏伟等 36应用气隙式膜蒸馏分 离技术对发酵液进行浓缩分离，使用膜孔径为 0.2 m 的聚四氟乙烯（PTFE） 微孔疏水平板膜组件，可使原料液的浓度提高 1.6 倍以上。在浓缩发酵液的同 时，超滤还可以去除一些小分子杂蛋白，有利于后期的纯化 Bracke37及 Ellwood38采用 MWCO（截断相对分子质量）分别为 10 000、20 000、30 000 的超滤膜

26、渗滤去除发酵液中的小分子物质，效果显著；盛瑞堂等 35采用超滤除 去杂蛋白总量的 53.9%。可见，在乙醇沉淀前采用膜技术进行浓缩有利于降低 成本和后期纯化。 3.3.3.2.2 膜技术分离 膜技术不仅可以用于发酵液的浓缩，将其作为一种主体技术分离、提纯发 酵液中的 HA 也有一定可行性。周海东等 39采用 PVDF 材质的膜，对 HA 发酵 液进行错流微滤和超滤，HA 浓度在一定的范围内（微滤1.2 g/L，超滤1.5 g/L），膜工艺可稳定地运行。Zhou 等 40采用先微滤后超滤的两步切向流过滤 工艺对发酵液中 HA 进行分离，共进行两次，第一次微滤和超滤以纯水作为过 滤洗液，第二次微滤

27、时以第一次超滤所得的透过液作为过滤洗液，两次高效的 分步分离纯化可使 HA 得率超过 77%。可见，以膜分离技术为主体，采用微滤 和超滤相结合的工艺，能够实现 HA 发酵液的分离提纯。但是，在微滤过程中 HA 的透过率较低；在超滤过程中虽然蛋白质相对于 HA 的选择性较高，但蛋白 质的透过率较低，因此，应针对溶液条件的变化进行研究，以提高 HA 在微滤 膜中及蛋白质在超滤膜中的透过率。 8 3.3.3.2.3 壳聚糖分离 近年来，利用壳聚糖带相反电荷的吸附作用将 HA 分离下来的方法也见诸报 道。德国专利 41报道了将壳聚糖直接加入发酵液中以沉淀 HA。Yang 等 42通过 沉淀方法使壳聚糖

28、与磁铁矿微粒共轭形成复合物微粒（壳-磁微粒），探讨了该 复合物微粒通过电荷吸附作用从发酵液中分离 HA 的效果，发现通过调节 pH 值在 68 之间，HA 在发酵液中并不能直接被分离下来。经乙醇沉淀分离后的 HA 粗品，在 pH 值为 6 的条件下溶解，用壳-磁微粒进行吸附；在 pH 值为 8 的条件下进行洗提，只有 30% HA 被壳-磁微粒吸附结合，又只有大约 30%壳-磁 微粒结合的 HA 被洗提下来；通过降低 pH 值至 4.0 来增加壳-磁复合物正电 荷密度后，吸附作用显著提高，但又会出现壳聚糖与磁微粒易分散等问题。因 此，这种分离与纯化方法在实际生产中的可行性尚有待进一步研究。 3

29、.3.3.3 纯化工艺 3.3.3.3.1 季铵盐纯化 氯化十六烷基吡啶（CPC）是一种季铵盐类阳离子表面活性剂，它能与黏多 糖分子中的聚阴离子形成络合物，此络合物在低浓度盐溶液中产生沉淀，而在 高浓度的盐溶液中逐渐解离，引起 HA 与 CPC 复合物解离所需的盐浓度远比其 它黏多糖与 CPC 复合物解离所需浓度要低，利用此性质可达到纯化 HA 的目的。 Cifonelli 等 43早在 1957 年就对发酵液经浓缩后再用 CPC 纯化进行了研究。 洪水声等 44向 HA 粗品溶液中加入等体积的质量分数为 4%的 CPC 溶液，形成 絮状物后静置 1h，再离心分离，沉淀溶于 1.5 mol/L

30、 的 NaCl 溶液中，离心 除去不溶物。祝庆 45将乙醇沉淀得到的 HA 粗品溶于 0.05 mol/L 的 NaCl 溶 液中，加入 1% CPC，搅拌 30 min 后静置 1 h，离心收集沉淀后溶于不同浓度 NaCl 溶液中，发现 NaCl 溶液浓度为 0.35 mol/L 时 HA 纯度和产量较高。丁霞 46将 HA 粗品溶于 0.15 mo1/L NaCl 中得到 0.25%的 HA 溶液，1 倍体积 10% CPC(溶在 0.15mo1/L NaCl 中)加入 8 倍体积的 0.25%的 HA 溶液中，通过离 心分离 CPC 沉淀，用 0.15 mol/L NaCl 洗涤，得到较

31、纯的 HA 溶液。采用 CPC 进行纯化的优点是操作简单，但 CPC 回收困难，单位价格较高，所以应用 成本较高。十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）纯化 HA 的作用机制与 CPC 相似， 但成本相对较低。丁霞等 47将初步除去菌体和不溶性杂质的提取液中加入 CTAB，通过离心分离沉淀，并用 0.15 mol/LNaCl 洗涤沉淀，浸泡在 1.5 mol/L NaCl 溶液中过夜，CTAB-HA 复合物可解离溶解，最终可得清亮、较纯的 HA 液体。盛瑞堂等 35报道了用 CTAB 沉淀法从发酵液中分离 HA 的方法，将发 酵液稀释至 4.5 倍，调节 pH 值至 6.5，加入发酵液体积 12%的

32、 CTAB 溶液 9 （体积分数为 10%），HA 的收率可高达 97.0%，与乙醇法相比， CTAB 法 HA 的收率提高了 2.1%，HA 沉淀中杂蛋白的质量分数降低了 2.4%，与 CPC 法相 比成本降低了 45.2%。可见，采用 CTAB 法对 HA 进行分离纯化具有明显优势 和很好的应用前景。 3.3.3.3.2 酶解纯化 加入蛋白酶能够使 HA 与蛋白质的络合状态解除，HA 更多地游离于溶液中， 使其易于纯化。常用的蛋白酶有胃蛋白酶、木瓜蛋白酶，链酶蛋白酶等，链酶 蛋白酶对接近糖蛋白质链肽键上的作用效果优于木瓜蛋白酶，而胃蛋白酶的水 解作用不够彻底，往往需要配以其它酶才能见效。祝

33、庆等 31将除菌体后的上清 液加入链酶蛋白酶作用 2 h，乙醇沉淀后再经氯仿除蛋白，HA 产量得到了较大 幅度的提高，杂蛋白的含量为 2.8%，与采用氯仿三次除蛋白后的纯度相当。 3.3.3.3.3 过滤法纯化 过滤法纯化易于实现工业化，能有效滤除菌体和蛋白质，对分子量影响相 对要小。盛瑞堂等 35报道了采用过滤法纯化 HA 的工艺：将 HA 粗品以 20g/L 的浓度溶于水中，加入硅藻土作为吸附剂，调节溶液 pH 值至 4.64.8，在 HA 粗品溶液中加入 10 g/L 粗硅藻土和 3.3 g/L 细硅藻土为助滤剂，用粗硅 藻土和细硅藻土预涂层过滤，然后用 H 乙-1 型滤板过滤，经过超滤

34、后，将滤 液用乙醇沉淀并干燥，得到葡糖醛酸含量达 44.2%的 HA。邓禹等 32将发酵液 经过前处理后，以发酵液质量 1.2%的混合硅藻土（粗细硅藻土比为 1.51） 作为过滤助剂，过滤温度为 60 ，pH 值为 7.0，再配以酒精沉淀、气浮、酒 精造粒的后处理工艺，得到的成品透明质酸中葡萄糖醛酸含量达 46.39%，蛋白 质含量仅为 0.047%，相对分子质量为 1.9106Da。 3.3.3.3.4 离子交换层析纯化 在进入 HA 纯化阶段后，离子交换层析等具有选择性吸附特点的层析技术 往往被采用。与化学方法相比，离子交换层析分离条件温和，不引起分子结构 的变化，己经成为分离提取生物大分

35、子的有效方法。离子交换法用于纯化 HA 的关键问题是选择合适的交换树脂及相应的交换条件 46。Poli 等 47将粗滤后 的滤液先后流经阳离子交换树脂和 Amberlite IRA900 强碱型阴离子交换树脂， 杂质吸附在树脂上，HA 不被吸附而流出，流出液直接冷冻干燥或减压干燥可得 纯度在 98%以上的 HA，其蛋白质含量为 0.3%。Gerard 等 48曾报道了采用 DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖分离 HA 的研究，但由于这两种层析剂价格昂贵， 限制了在工业上的应用。选择经组氨酸修饰的强碱型阴离子树脂作为离子交换 剂，以增大 HA 及其所含蛋白质、核酸等各组分与交换剂相互作用的差异，

36、选 择氯化钠为洗脱剂，对 HA 粗品进行离子交换层析，纯化质量收率为 10 58%61%，相对分子质量近 1.0106Da，蛋白质含量为 0.075%。 3.3.3.3.5 凝胶过滤柱层析纯化 凝胶过滤层析常在纯化阶段的后期被采用，需要根据不同分离纯化目的和 HA 分子量大小选择合适的分子筛。采用 Sephadex G-25 凝胶过滤柱层析分离 HA 溶液中残留的 CPC 及其它杂质。将发酵液经过氯仿与正丁醇混合液除蛋白、 季铵盐（CPC）复合物沉淀、DEAE-纤维素柱层析后制得的样品，配成质量分数 为 0.5%的溶液， 采用 Sephadex G-75 凝胶过滤柱进行层析纯化，进样量为 2.

37、0 mL，用蒸馏水 进行洗脱，洗脱速度为 6mL/h ，收集洗脱峰并冷冻干燥， HA 总收率为 59.65%， 蛋白质含量为 0.075%。 4 透明质酸的改性 尽管 HA 有诸多优点，但天然 HA 存在半衰期较短，在组织中易扩散和降 解，稳定性较差，水溶性过强等缺点，限制了其应用领域，由此激发了国内外 科学家对 HA 进行结构修饰和改性的兴趣，并对 HA 衍生物进行了大量研究。 如图 1-2 所示，HA 分子中可作为化学修饰位点的 4 个部位分别为羧基、羟基、 N-乙酰氨基和还原末端，其中以羧基和羟基的修饰较常见，利用 HA 的修饰位 点可通过以 下三种方法对它进行改性从而改善其性能：(1)

38、 通过酯化反应、酰胺化反应和 还原胺化反应等方法对 HA 进行交联、疏水、接枝和开环等化学改性，得到具 有一定功能性的透明质酸衍生物，如透明质酸基凝胶；(2) 利用 HA 的聚阴离 子电解质性质，与阳离子化合物通过静电作用等形成复合物；(3) 将 HA 与其 它天然大分子或合成大分子共混改性，通过分子内和分子间氢键作用形成性能 优良的共混膜等。 透明质酸改性示意图 49 11 4.1 酯化改性 羧基和功能羟基是 HA 两个最常用的修饰部位，可与环氧化合物、醇、酸 和酸酐类物质反应生成 HA 酯化衍生物。通过酯化改性，HA 的理化性质和生物 学性能得到一定程度改变，从而扩大了 HA 应用领域。羧

39、基是 HA 的一个最重 要修饰点，一定条件下，HA 的羧基可与多种醇类发生酯化反应得到 HA 酯化衍 生物 HYAFF，较典型的是 HA 乙基酯 HYAFF7 和 HA 苄基酯 HYAFF1150。 HYAFF 具有良好的机械性能、热性能、渗透性、疏水性和稳定性等，在临床医 学领域有广泛应用。Kong 等10-11则在室温下以 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳 化二亚胺(EDC)和 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)为催化剂，通过 HA 羧基与单硬脂酸 甘油酯(GMS)羟基之间的酯化反应合成了双亲性 HA-GMS 衍生物，探讨了 HA/GMS 摩尔比、pH 和反应时间对取代度(DS)的影响，并得出

40、在 pH=7.4，HA/GMS=1/3 及反应时间 48 h 下可以得到较高取代度(DS=23%)的 HA/GMS，并以此 HA/GMS 水溶液为水相，二氯甲烷为油相，Tween-80 和 Span-20(S)为非离子表面活性 剂制备了 O/W/S 纳米微乳液，提供了可用于食品、医药和化妆品等领域的纳米 HA 载体。Prata 等 51用甲基丙烯酸缩水甘油酯(GM)对 HA 改性，得到可光交 联的酯化产物 HAGM，并通过三种不同方法控制 HAGM 的微结构和分子间作用力 制备了轻度交联的 HAGM 类凝胶、HAGM 微球和 HAGM 微凝胶，前两者水溶液具 有高粘弹性，而 HAGM 微凝胶则

41、具有较好的弹性，类似于假塑性流体。HA 侧链 上的功能羟基是其另一个重要修饰点，Burdick 等 52用将甲基丙烯酸酐对 HA 改性同样得到可光交联酯化产物 MeHA，在光引发剂及紫外光照下，MeHA 通过 自由基聚合形成网状凝胶，该凝胶具有良好的机械性能和低降解性，是理想的 软骨组织载体。Eenschooten 等 53在 NaHCO3 缓冲液(pH=89)中用辛烯基琥珀 酸酐(OSA)对 HA 酯化改性得到双亲性 OSA-HA 衍生物，并研究得出 OSA/HA 摩 尔比和 NaHCO3 缓冲液浓度是影响 OSA 取代度的两个重要反应参数。 Tmmeraas 等 54用类似方法通过烷烯基或

42、芳香基琥珀酸酐(ASA)改性 HA 得到 双亲性 ASA-HA 衍生物，并则初步探讨了其乳化性能，结果表明 ASA 的引入降 低了 HA 的表面张力，使 HA 乳化性得到改善。 4.2 酰胺化改性 HA 的羧基活性较高，且通常是 HA 受体或透明质酸酶的识别点，因而对 HA 羧基的修饰较为常见，不仅可以发生酯化反应，还能与多种胺类物质发生酰 胺化反应，得到 HA 酰胺化衍生物。Lee 等 55采用两步法制备了 HA 酰胺化衍 生物 HA-SH，第一步在 pH=6.8 条件下，以 EDC 和 N-羟基苯并三唑(HOBt)为 12 催化剂，制备了 HA 与胱胺盐酸盐的酰胺化产物，将二硫键 S-S

43、引入到 HA 主 链上；第二步在 pH=8.5 条件下用二硫苏糖醇(DTT)还原 S-S 键得到硫醇 SH， 成功制备了 HA-SH。然后将金(Au)纳米粒子溶液逐滴加入到 HA-SH 水溶液中， 通过 SH-Au 之间的相互作用自组装得到 HA/Au 纳米粒子，TEM 显示 Au 纳米 粒子在 HA-SH 模板上呈一维排列，使 HA 链段结构直观可视化。Kim 等 56通 过酰胺化反应将量子点(QDots)与 HA 结合获得了用于实时生物成像的 HA- QDot，可作为治疗肝疾病的特定药物负载体。HA-QDot 具体合成步骤为：第一 步通过酰胺化反应制备了己二酸二酰肼(ADH)改性 HA 的

44、产物 HA-ADH(ADH 含量 为 22%)，第二步在 QDots 的硼酸盐缓冲液中加入催化剂 EDC 和硫代-NHS，反应 30 min 活化 QDots 表面的羧基，最后将 HA-ADH 的磷酸盐缓冲液滴入到已活化的 QDots 溶液中反 应 2 h 得到 HA 的衍生物 HA-QDot。 4.3 交联改性 HA 的交联改性是指 HA 与带有相关官能团的交联剂发生分子间交联反应， 或以交联剂为催化剂，发生分子内交联反应，得到具有不同交联度的分子网状 结构，如水凝胶、交联膜和凝胶粒子等，从而大大改善 HA 的水溶性、粘弹性、 流变性、机械强度和降解性能等，满足 HA 在临床、医药等领域的特

45、殊要求。 常见的交联改性方法有碳二亚胺交联、酰肼交联、二硫化物交联、聚乙二醇交 联、环氧化物交联、醛交联和砜交联等。 已二酸二酰肼(ADH)是较常用的酰肼交联剂，聂素云等 57用溶剂挥发法制备 了 HA-ADH 凝胶薄膜，结果表明 HA 用 ADH 交联后微观结构发生改变，溶解性 降低，干态时 HA-ADH 薄膜结构较密致，可在水中发生明显的溶胀现象，溶胀 后形成多孔网状结构。Pitarresi 等 58以 EDC 和硫代-NHS 为催化剂，采用反 相微乳液法使 HA 和 ,- 聚天冬酰肼(PAHy)在 pH=7.5 的水相液滴中交联反 应 5 h 得到球形复合纳米粒子 HA-PAHy。该纳米

46、粒子在水介质中具有高溶胀率 和较好的稳定性，同时在模拟细胞外液体及人的血浆生理环境中具有较好的药 物释放能力，是有效的药物载体。 二乙烯基砜(DVS)在室温下可与 HA 快速交联反应，因而也是一种较常用的 交联剂。Jha 等 59首先用 DVS 对 HA 进行分子内交联得到 HA 弹性凝胶颗粒 (HGPs)，HGPs 经高碘酸钠氧化后与 HA-ADH 衍生物进行分子间交联反应得到双 层交联网络凝胶(DXNs)，由于二次网络结构的存在，提高了该透明质酸凝胶的 机械性能，适用于软组织修复工程。 聚乙二醇(PEG)为分子大小可变的线性分子，具有良好的生物相容性，免疫 13 学惰性，水溶性和两亲性，因

47、而用 PEG 对 HA 进行交联改性引起国内外学者的 广泛兴趣。陈景华等 60用琥珀酸酐和 NHS 活化 PEG 末端羟基后与乙酰化处理 后的 HA 发生交联反应，制得 HA-PEG 衍生物，结果表明该衍生物溶液属于标 准的假塑性非牛顿流体，其流变性能符合生物医用材料要求。Wells 等 61在 4 下以 EDC/NHS 为催化剂将氨基封端的 PEG-蒽接枝到 HA 主链上，得到具有 优异生物相容性的光敏性 HA-PEG 衍生物。由于蒽基团的光二聚性质，当紫外 波长大于 300 nm 时，可得到光交联 HA 凝胶，而当紫外波长小于 300 nm 时 HA 凝胶解交联(如下图所示)，因此该凝胶可

48、用于眼科药物的运输，通过改变药 物分子量和紫外曝光可达到药物长期缓释作用。 HA 凝胶的交联和解交联示意图 4.4 疏水改性 透明质酸亲水性过强，通常以钠盐形式存在，难溶于绝大多数有机溶剂， 这就限制了许多疏水性物质(药物或脂质)对其进行改性或结合，因而国内外开 展了许多研究工作解决这一问题。较成熟的方法是制备透明质酸的四丁基铵盐 (HA-TBA)使 HA 能溶于有机溶剂，以实现与疏水性物质的反应。Jin 等 62制备 了疏水性 HA-TBA，以四氢呋喃和乙腈为混合溶剂，通过酯化反应将改性后的神 经酰胺(DS-Y30)接枝到 HA-TBA 上，得到双亲性衍生物 HACE。HACE 能与疏水 性

49、药物阿霉素(DOX)在二甲亚砜(DMSO)和水的混合溶剂中进行自组装，得到负载 DOX 的 HACE 纳米粒子，此纳米粒子可以作为黑霉瘤治疗的有效抗癌载体。 Pravata 等 63通过一步法用十六烷基溴化铵(CTA-Br)改性 Na-HA 得到比 HA- TBA 疏水性更强的 HACTA，并以 DMSO 为溶剂将酰氯基封端的低分子量聚乳 酸(COL-OLA)接枝到 HA-CTA 上得到可降解的梳状衍生物 CTA-HAOLA，此 HA 衍 生物能在水溶液中自组装形成 Na-HAOLA 球形聚集体或 CTA-Na-HAOLA 水凝胶。 Bergma 等 64以 2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-嗪(CDMT)为催化剂，水和乙腈的混 合溶液为溶剂，在中性条件下通过酰胺化反应将一系列亲疏水性不一的胺类物 14 质接枝到 HA 主链上。这种嗪活化的酰胺化反应条件温和，胺类物质选择余地 大，提供了一种新的制备功