1、 酵母菌的培养和观察 目的 认识酵母菌的形态特征，了解培养酵母菌的方法。 实验前的思考 人类认识和利用酵母菌的历史悠久，早在史前时期，先人们就学 会酿酒。约在 6000 年前，就发明发面的方法。直到十九世纪有了显微镜，人们 才窥探到醉母菌的真面目。对酵母菌做纯系培养分类研究的是与巴斯德同时代 的丹麦人汉斯，他是为寻求酿造高品质啤酒的途径才去深入研究酵母菌的。 材料器具 甜酒酿汁液，新鲜酵母，豆芽；显微镜，载玻片，盖玻皮，玻璃棒， 镊子，滴管，吸水纸，酒精灯，石棉网，火柴，漏斗架，玻璃斗，量杯，三角 烧瓶，烧杯，天平，量筒，棉絮；蔗糖，乳酸，碘液。 步骤 1观察酵母菌 （1）用滴管从甜酒酿的汁液
2、中吸取一滴汁液，滴在载玻片上，用针摊开，盖上 盖玻片，在低倍镜下就能清楚地看到甜酒酿的汁液中悬浮着无数酵母菌。再换 高倍镜仔细观察一个酵母菌，可以看到酵母菌是椭圆形的单个细胞，细胞中有 许多小颗粒，也有几个大的液泡（图示）。有的酵母菌的一端长出大小不同的 突起，这是酵母菌的芽体。芽体成长脱落，就成为新的个体，有的芽体在从母 体脱落前又长出突起。这种繁殖方法叫出芽繁殖。 （2）在盖玻片一边加一滴碘液，从另一边用吸水纸把染液引入盖玻片下。不久 就能看到被染成棕褐色的细胞核和变成蓝紫色的淀粉粒。 2培养酵母菌 （1）用蔗糖液培养 在盛有 100 毫升的三角烧瓶里加 5 克蔗糖，煮沸。等到溶 液稍稍冷
3、却，加一小块鲜酵母，用玻璃棒搅拌均匀；再用棉絮塞紧瓶口。然后 把烧瓶放在 2530的温暖地方，数小时后就可见到溶液里有气泡产生，并散 发出酒味。这是因为酵母菌正在把糖分解成乙醇和二氧化碳。 （2）二三天后吸取溶液在显微镜下观察，就可看到已培养出大量酵母菌。 注意事项 1观察酵母菌时，视野里杂质较多，有淀粉粒、半分解的淀粉团块、曲霉孢子 和其它杂菌等等，只要掌握住酵母菌的形状和体内具有液泡，尤其是染色后体 内具有褐色的核和蓝色的淀粉粒这些特点，就可以跟其它杂菌区分开来。 2发酵在缺氧的环境里仍能良好地进行，不必为了增加氧气去搅拌已放入菌种 的培养液。 分析和讨论 酵母菌是少数能在缺氧环境里生存较
4、长时间的一种微生物，它属于兼性菌类。 在一般情况下进行有氧呼吸。如环境中有丰富的糖类，它进行缺氧呼吸。其过 程如下： 1C6H12O6+6O26CO 2+6H2O+2.87103 兆焦（有氧呼吸） 2C6H12O62CO2+2C 2H5OH+109103 兆焦（缺氧呼吸） 建议 培养酵母菌还可以采用下列两种方法。 1用乳酸、豆芽汁和蔗糖液培养 （1）取 10 克豆芽放入 100 毫升水中，加热煮沸半小时，盛起，用细布过滤。 在滤液里加 5 克蔗糖和 5 毫升乳酸，配成液体培养液。 （2）把鲜酵母半块或老面（发酵后晾干的面粉团）打碎，投入培养液中，放在 黑暗温暖的地方，二三天后就可以培养出大量酵
5、母菌。 2用巴斯德培养液培养 酵母菌需要的无机营养来自外界环境。如果在培养液内适当增加氮、磷等元素， 效果会更好。巴斯德培养液的配方如下： 蔗糖 15 克，碳酸铵 1 克，磷酸氢钾 02 克，磷酸钙 002 克，硫酸镁 002 克，蒸馏水 100 毫升，培养方法跟上述的相同。 于运联 中学生物学实验大全 1994 年 12 月 酵母菌的培养与转形作用 .目的 酵母菌（ Saccharomyces cerevisiae）是一种很有用的真核生物，他 拥有生物的特性，可用原核生物的方式培养，其基因组较小，复制时间短， 可作为基因分析，在分子生物学研究上的突破，很多都是以它为材料。在 工业上酵母菌也很
6、重要，例如：啤酒、面包、酒、重组胜 和蛋白质之合 成皆与酵母菌有关。 在重组 DNA 技术中，酵母菌（yeast）乃是一种很重要的寄主生物， 可用质体 DNA 为媒介物引入外来 DNA 并表现之。转型技术与大肠杆菌相似， 但其方法需修饰以瓦解其细胞壁，常用的两种方式进行酵母菌的转型作用， 一是使酵母菌形成 Spheroplast，此法较麻烦需将细胞壁去掉，另一种是 用碱性阴离子（例如：LiCl 或 RbCl）加上热休克快速地处理完整的细胞， 本实验用后者来实行，收集对数生长期的酵母菌细胞，经碱性阴离子及热 休克处理，可使细胞外鞘发生变化，有利于吸收质体 DNA，正如大肠杆菌 一样（参照实验 5
7、），不同的因子会影响效率，质体 DNA 吸收能力与质体 的大小、DNA 的构形、寄主品系、筛选步骤有关，与大肠杆菌的转形作用 相比有显着的差别是转形效率，酵母菌的转型效率在每 1 mg 质体 DNA 中， 约可获取 103-104转形细胞。 II.酵母菌的培养 1.仪器用具： a. 30 恒温箱 b. 酒精灯 c. 接种环 2.药品与试剂： a. yeast 菌株： EGY48MAT , ura3, his3, trp1, LexAop(x6)-LEU2 YM4271MATaura3-52, his3-200, lys2-801, ade2-101, ade5, trp1-901, Leu2-
8、3,112, try1-501, gal 80gal 4ade5:hisG Y187MAT, ura3-52, his3-200, ade2-101, lys2-801, trp1-901, Leu2-3,112,gal4, gal 80, cyhr2, LYS2:GALUAS-HIS3TATA- HIS3, URA3:GAL1UAS-GAL1TATA-LacZ Y190 MATa, ura3-52, his3-200, ade2-101, lys2-801, trp1-90, leu2-3, 112, gal4,gal80, cyhr2, LYS2:GAL1uas- HIS3TATA-HIS
9、3, URA3:GAL1uas-GAL1TATA-lacZ b. YPD 培养液、培养基（参照实验 4） 3.方法与步骤： ）单一菌落（single colony）之分离，请参照实验 4。分别将酵母菌 养于 YPD 培养液或培养基中，至于 30 之培养箱中约 3-5 天。 ）隔周实验前，取出酵母菌落并观察。 III.酵母菌转形作用 1.仪器用具： a. 30 培养箱 b. 离心机 c. 干浴器 d. 冰浴 2.药品与试剂： a. minimal synthutic dropout（SD）base agar（clontech） b. Ura c. 1 x TE/LiAc（0.1 M LiAc i
10、n TE 溶液） d. 40PEG4000 e. DMSO 3.方法与步骤： ）制备胜任酵母菌的前一天，接种酵母菌 EGY48 于 3 ml YPD 培养液 中，置于 30 恒温箱中振荡培养（230-250 rpm）过夜。 ）准备 10 ml YPD 培养液，加入 300 l 过夜菌液，使 OD600 = 0.40.6。 ）在室温下以 2200 rpm 离心 5 分钟，倒去上清液，加入 5 ml 水悬浮 酵母菌。 ）在室温下以 2200 rpm 离心 5 分钟，倒去上清液，加入新鲜的 100 l 1 x TE-LiAc 悬浮。 ）加入 0.10.5 g p8OP-LacZ 质体 DNA 及 0
11、.1 mg 片段精子 DNA 携带 者。 ）加入 600 l PEG-LiAc（0.1M LiAc, 40PEG in TE）混匀，置于 30 恒温箱中振荡培养（200 rpm）30 分钟。 ）加入 70 l DMSO，混匀并热休克 42 15 分钟，迅速至于冰浴中 2 分钟。 ）在室温下以 14,000 rpm 离心 5 秒，倒去上清液，以 100 l TE 悬 浮并涂 于 SD/-Ura 培养基中，置于 30恒温箱中 35 天。 http:/www.ndhu.edu.tw/life-science/exp/choice.htm 实验 4 质体 DNA 之基本操作技术 I.目的 本实验介绍培
12、养液（broth）或培养基（plate）的制备、大肠杆菌 的培养、菌种保存与生长曲线所使用的基本技术。 II.培养液（基）的制备 1.培养细菌或酵母菌（yeast）其培养基必须提供下列几种基本的营养 条件：（1）碳源作为能源（2）水分（3）氮源（4）磷（5）硫（6） 不同的矿物质养分，如铁和镁。大肠杆菌和酵母菌能在只有一种碳源 （如葡萄糖）与简单的氮源（如氯化铵、硫化铵及磷、硫等矿物质） 的简单培养基中生长，酵母菌则还需要几种维生素。实验研究上常用 到一些复杂的培养基，其主要成分则由复杂的养分（包括植物或动物） 所提供的一些不详萃取物。例如 LB 和 YPD 培养液，其主要成分是酵 母菌萃取物
13、（yeast extract）和蛋白月柬（peptone,一种水解的蛋 白质）所组成，这些材料和胺基酸以及不明的辅助因子混合在一起， 如维生素等形式提供不同的碳源和氮化合物。液体培养基就是将各成 分溶于水中即可，若加入洋菜（agar，从红藻中萃取出来的复杂萃取 物，与洋菜胶 agarose 不同，请勿用错）则成固体培养基。洋菜是固 体微生物培养基理想的凝固剂，因它具有良好的溶解特性，但对大部 分细菌及酵母菌而言则不具营养价值。固体洋菜在 90100 C 会溶解， 液体洋菜在约 42 C 时凝固。灭菌步骤可去除所有活的微生物，培养 基在做纯系培养时必须将所有的微生物去除，培养容器则要密封或用 棉
14、花、锡箔盖住以避免灭菌后又遭污染。纯系培养过程中所用的液体 及容器可用不同的方法消毒，包括高温、放射线照射、过滤等将微生 物杀死。制备培养基常需要高压灭菌锅（autoclave），让培养基在 特定时间内暴露于高温高压中，通常是 121 C 的高温，蒸汽压 15 Psi，灭菌 20 分钟。 2.仪器用具： a. 高压灭菌锅（ autoclave） b. 磁性搅拌器 c. 天秤 d. pH meter e. 水浴槽 f. 无菌操作台 3.药品及试剂： a. Tryptone（代替 peptone） b. yeast extract c. NaCl d. Agar e. ampicillin 4.方
15、法步骤： 全班区分数组各制备不同的培养液或培养基。 （A）LB 培养液： 1）在 500ml 锥形瓶中加入 1 g tryptone + 0.5 g yeast extract + 1 g NaCl，加水至 100 ml 刻度并用磁性搅拌器混匀，瓶口 以铝箔纸盖住。若用玻瓶装，则旋松盖口（待灭菌后降温再旋 紧）。 2）高温灭菌锅消毒。 注：高压灭菌后必须等它慢慢排气，只有当气体完全排除后，才能 安全地打开灭菌锅，戴耐热手套取出材料，消毒 20 分钟实际 需要约 40 分钟，因为还要把空间加热及排气时间包括在内。 （B）LB 固体培养基： ）在 500 ml 锥形瓶中加入 1 g trypton
16、e + 0.5 g yeast extract + 1 g NaCl + 1.5 g agar，加水至 100 ml 刻度并用 磁性搅拌器混合，agar 此时无法溶解成悬浮状，瓶口以铝箔纸 盖住。 ）高温灭菌锅消毒。 ）灭菌后，小心将瓶放在 50 C 水浴中，使其降温 30 分钟。 ）在培养基凝固前，倒入微生物用的培养皿（petri dish），置 于抽风柜中，以防污染，待完全凝固后，盖紧盖子标明“LB plate“及日期，放在室温或 4 C 中备用。 （C）Ampicillin plate： 1）如同前项（B）步骤 1）至 3）。 2）在培养基凝固前，迅速加入 ampicillin 使成最终
17、浓度为 100 g/ml，摇晃均匀，倒入微生物用的培养皿（petri dish）， 置于抽风柜中，以防污染，待完全凝固后，盖紧盖子标明“Amp plate“及日期，放在室温或 4C 中备用。 （D）YPD 培养液： 1） 在 250 ml 锥形瓶中加入 1 g tryptone + 0.5 g yeast extract，加水至 50 ml 刻度并用磁性搅拌器混匀，瓶口以铝 箔纸盖住。 2）高压灭菌消毒。 3）冷却至 55 C，加入葡萄糖溶液成最终浓度为 2%。 （E）YPD 培养基： ）在 250 ml 锥形瓶中加入 1 g tryptone + 0.5 g yeast extract +
18、1 g agar，加水至 50 ml 刻度并用磁性搅拌器混匀， 瓶口以铝箔纸盖住。 ）高压灭菌消毒。 ）冷却至 55 C，加入葡萄糖溶液成最终浓度为 2%。 4）倒入微生物用的培养皿（petri dish），置于抽风柜中，以防 污染，待完全凝固后，盖紧盖子标明“YPD plate“及日期，放 在室温或 4 C 中备用。 III.大肠杆菌的培养 （A）单一菌落（single colony）之分离： 1.利用微生物的生物技术作纯系（pure line）的保存，常依据纯系培 养，常见的有稀释技术或画线法，本实验将介绍后者，乃在培养基 表面把混合培养的菌涂开或画成线，让个别的细胞分开。每个分离 的细胞
19、会长成一个菌落（colony），可获得一个纯系培养。 2.仪器用具： a. 37 C 恒温箱 b. 酒精灯 c. 接种环 3.药品及试剂： a. E.coli 菌株:DH5 b. LB 及 LB plate 4.方法步骤： ）上课前一天，自-70 C 取出储存的菌种，培养在 LB 培养液中并 置于 37 C 恒温箱中振荡培养过夜。 ）每组取 1 个 LB plate，在培养皿底部标明组别、日期及 “DH5“。 ）将接种环在酒精灯焰上烧红，环上方部分亦以火焰烧过，将接种 环在空白 LB plate 处轻戳数次以使冷却。 ）取过夜菌液，将接种环浸一下。（若为培养基，则轻刮一个菌落） 。 ）打开空白
20、 LB plate，将沾有菌落的接种环在其上轻轻连画数条 横线，画法各异请参阅图，唯再次画前需将接种环重复火焰灭菌 的步骤。 （B）菌落的移殖接种（inoculation）技术 1.生物技术学者均需利用无菌技术，小心操作，才能避免在移殖接种中 被不想要的微生物污染。 2.仪器用具： 同上 3.药品及试剂： 同上 4.方法步骤： 基本上同前，唯一差别是接种于 LB broth 中。 IV.菌种保存 1.菌种保存于 15% glycerol（甘油）中，可保存在低温（-70 C）中数 月甚至数年。 2.仪器用具： a. 37 C 恒温箱 b. 70 C 冰柜 3.药品及试剂： a. 50% glyc
21、erol (autoclaved) b. 2 ml vial 螺旋式保存管 4.方法步骤： ）于无菌操作台中，将长至 mid-log phase 之菌液取出 700 l 置 于 2 ml 螺旋式保存管中。 ）加入 300 l 50 % glycerol 混合均匀。 ）标示菌种名称及日期，置于-70C 冰柜中保存。 V.生长曲线 1.分子生物学中无论是进行胜任细胞的制备，或获得可重复生产之质体 DNA 及生产重组蛋白质，都必须先了解生物之生长特性。若要获得生 长均一的菌类，就必须取对数生长期或指数期的菌类，此时族群中每 个细胞之生长速度和成分接近相同。不同培养基依其营养条件及通风 情形（氧气）的
22、良好与否，其生长曲线多少会有变化。基本上生长过 程包括了呆滞期(lag phase)、对数期(exponential or log phase)、 停滞期(stationary phase)和死亡期(death phase)。 2.仪器用具： a. 37 C 恒温箱 b. spectrophotometer c. 酒精灯 d. 接种环 3.材料： E.coli 菌株: DH5 4.方法与步骤： ）测量生长曲线前一天，自-70 C 取出储存的菌种，培养在 LB 培 养液中并置于 37 C 恒温箱中振荡培养过夜。 ）各组准备 10 ml LB 培养液，加入 50 l 过夜菌液，置于 37 C 振荡
23、培养。 ）接种 1 小时后，每隔 30 分钟取少量菌液测其 OD600值， background 为 LB 培养液。 ）以横轴为时间，纵轴为细菌数目取对数（log）做图，画出 DH5 的生长曲线。 注：1 个 OD600值约含 8108个细菌 啤酒酵母菌 01 啤酒酵母菌 02 酵母菌污染后生长液似乳白色浑浊，就像北方做馒头用的酵母粉溶于温水中的那种颜色，差不 多吧 用灭菌水溶解硫酸铜,温箱里面如 37 度,就加硫酸铜到饱和,100 毫升要 25 克(30 度的溶解度). 1. 彻底通风，停止使用 1 周； 2. 甲醛（福尔马林）熏蒸 24 小时：密闭实验室，将甲醛倒入固体高锰酸甲中， （小心
24、，会喷出 来，容器大些，下垫报纸宽些，倒完立刻跑掉，注意安全） 。之后通风 24 小时，味散后进入实 验室开始实验。 预防为主.我们的是加如硫酸铜在煮过的蒸馏水里.即培养箱里的水盘本身加有防止霉菌的东西. 不知你们后来的处理如何?能否写出来供我们参考使用. 8 个小时，时间短点，用普通肉眼观察差点意思。影响因素有接种量、培养条件、菌中保存与 复苏等。用（D）右旋葡萄糖没问题。也许得多培养几个小时，我遇到过这种问题，是细胞冻 存不好造成的。 葡萄糖是（D）右旋的 酵母双杂交实验疑难解析 问：如果诱饵蛋白对酵母细胞是有毒的，该怎么办？ 答：在有些情况下，在液体培养基中培养不好的菌珠可以在固体培养基
25、上生长得很好。重悬克 隆于 1ml 的 SD/Trp，接着将重悬液平铺于 5 个 100-mm 的 SD/Trp 平板。在 30下温浴，直 至平板上的克隆互相粘在一起。用 5ml 0.5X YPDA 刮下每块板上的克隆，并收集到一管中。接 着就使用这个细胞重悬液进行正常的杂交反应。 问：我的诱饵蛋白能直接激活报告基因的表达，该如何处理？ 答：该蛋白很可能有转录激活域，是个转录因子。这可以通过基因重组切掉转录激活域，然后 重新检测其是否自激活。但重组也有可能破坏蛋白之间的互作。 问：转化效率太低，怎么办？ 答：1. 检测一下 DNA 的纯度，如果可以的话，重新用乙醇纯化。 2. DNA-BD/诱
26、饵蛋白很可能是有毒的。 3. 不适当的培养基，重新配制培养基，并做对照转化。 4. 检测 pGBT9 对照载体的转化效率，放置于 SD/Trp 平板上，转化效率应该在 1 x 105 colonies/mg DNA 以上。 问：杂交效率不高，该如何处理？ 答：在杂交中，预转化的诱饵细胞的数量可能不够。当你对诱饵菌株进行液体培养过夜时，应 挑选大的，新鲜的克隆进行培养。经过离心和重悬后，使用血球计对细胞进行计数。密度应该 在 1 x 109/ml。 一个甚至两个融合蛋白对酵母细胞有毒。你可以通过重组方法来减轻毒性，同时又能保证蛋白 的相互作用。或者使用表达水平较低的载体。也可以在琼脂平板或滤膜上
27、进行杂交。但同时必 须作杂交对照实验。 细胞的酵母污染图片 Did you use the cloney of the yeast cell or the overnight culture yeast cells to culture? Using the overnight culture cells can grow faster. Good luck! 1 检查一下 YPDA 的 pH， 2 确定你的细胞的活力是好的 3 培养或盛 YPDA 的容器中有没有抑制酵母生长的物质或是未洗干净 基本说明 通过将组织细胞裂解后，以 RNase A 和 Proteinase K 消化降解 RNA
28、和蛋白质。然后经过简单抽 提、沉淀获得基因组 DNA。本试剂盒适用于从人或动物的血液、培养细胞、各种组织、 Gram+/Gram-细菌中快速抽提基因组 DNA。 主要特点 1 整个抽提过程 30 分钟，氯仿抽提仅一次，无需酚抽提。 2 本试剂盒抽提 DNA 能用于几乎所有分子生物学实验。 3 按样品准备方法得到的 200l 样品中可获得 210g DNA。 从上面的介绍看适合于提取酵母基因组 DNA 酵母 DNA 在高盐浓度条件下，DNA 吸附于玻璃珠上，吸附了 DNA 的玻璃珠经离心、洗涤去掉盐和杂物后，进行洗脱重悬于水或 TE 缓冲液中。DNA 回收 率高而无降解，操作简单、快速、方便。玻
29、璃珠 SIGMA 有，可以问问代理。 也可以使用蜗牛酶裂解法破酵母细胞壁法。告诉你一种简便实用的提取酵母质粒的方法，其纯 度完全可以用来测序和做 PCR。你可以尝试一下。 氯化苄提取真菌基因组的方法。在 1.5ml Appendorf 管中加入 0.1g 菌体和 500ul 提取液，振荡使 之充分混合，再加入 10SDS100ul，氯化苄 300ul，剧烈振荡，使管内混合物成乳状。50 度保 温 1h，每隔 10min 振荡混合一次，然后加入 300ul 3mol/LNaCl（ph5.2） ，混匀，冰水浴 15min，6000rpm，15min，收集上清，加入等体积无水乙醇，室温沉淀 20mi
30、n，这时会有絮状沉 淀出现。10000rpm，15min，沉淀用 70乙醇洗一次，室温尽量挥发残留的痕量乙醇，但不要 让 DNA 完全干燥，加入 50ulTEbuffer 溶解 DNA。 提取液：0.1mol/LTris-HCL,PH=9.0+0.04mol/LEDTA,PH=8.0 整个过程也就氯化苄可能需要购买，不过它的价格也非常便宜，500ml 只需要 32 元。_ 酵母 RNA 试剂盒的如华舜的，效果还是不错； 下面是我收集的有关酵母基因提取的方法，你也可以参照分子克隆上的方法： 1. Transfer 1.5 ml of liquid culture of yeast grown f
31、or 20 24 h at 30C in YPD (1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose) into a microcentrifuge tube. Pellet cells by centrifugation at 20,000 g for 5 minutes. 2. Add 200 l of lysis buffer (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, pH 8.0). 3. Immerse tubes in a dry ice-et
32、hanol bath for 2 minutes, transfer to in a 95C water bath for 1 minute. Repeat; vortex 30 seconds. 4. Add 200 l of chloroform; vortex 2 minutes. 5. Centrifuge 3 minutes, room temperature, 20,000 g. 6. Transfer the upper aqueous phase to a microcentrifuge tube containing 400 l ice-cold 100% ethanol.
33、Mix by inversion or gentle vortexing. 7. Incubate at room temperature, 5 minutes. Alternatively, precipitate at -20C to increase yield. 8. Centrifuge 5 minutes, room temperature, 20,000 g. Remove supernatant with a pulled Pasteur pipette by vacuum aspiration. 9. Wash the pellet with 0.5 ml 70% ethan
34、ol, spin down as described in step 8 above. Remove supernatant. 10. Air-dry the pellets at room temperature or for 5 minutes at 60C in a vacuum dryer. 11. Resuspend in 2550 l TE 10 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0) or water. Samples obtained directly from plates should be resuspended in a 10 l vo
35、lume。 另外，建议你发贴前先用搜索功能，看一下有没有人问同样的问题。 我也是参考了“精编分子生物学”上的方法。效果还不错，PCR 也扩出了我的目的基因。只是省 去了玻璃珠这一步。 供你参考。 （1） YPD 培养基的配制： 15gYPD 粉末,来自 Clontech 公司,溶于 300ml 水中，6 分钟 121高 压灭菌后，加入 4.5 ml Adenine 溶液（Adenine，Sigma,200ug 溶于 10ml 0.5M HCl 中 ） 。 （2） 取 YPD 培养液 3ml 到 15ml 离心管中，挑 AH109 酵母单克隆到培养液中，30， 200RPM，4 小时培养。 （3
36、） 用 10ml YPD 培养液培养次级 AH109，过夜。 （4） 3000RPM，10 分钟离心。用 0.5ml 水重悬。移液于新的 1.5ml EP 管中，在室温下离心， 倒掉上清，快速振荡。 （5） 取少量酵母菌沉淀，加 1 ml 消化缓冲液（见精编分子生物学,包括： 100mmol/L,NACL; 10mmol/L, Tris.HCl; 25mmol/L EDTA; 0.5% W/V,SDS ）及蛋白酶 K（20 mg/ml）,使终浓度达到 0.1 mg/ml，65水浴使充分消化。 （6） 取出 200ul, 加 200ul 酚 /氯仿（1：1）高速震荡 3 分钟。加 TE 200u
37、l, 高速震荡，高速离 心 13000RPM，5 分钟。 （7） 加 1/2 体积 7.5mol/L (NH3)Ac 及两倍体积无水乙醇,颠倒混匀,室温下 13000RPM,3 分钟 离心。冰 70%乙醇洗涤。 （8） 去上清,干燥沉淀, 30ul 无菌水溶解。测 OD，-20保存。 很多酵母最适生长温度是 28 度 经过不断的努力，终于得到酵母表达阳性结果。特把表达的一些心得写下来，希望对正在努力 中的 XDJM 有所帮助，也以此感谢丁香园对我的帮助。 分泌型载体：pPICZaC 宿主菌：X33 培养基：BMGY/BMMY 目的蛋白：20KD 1.表达过程中防止污染是第一关键，酵母太容易污染
38、 了。在用 BMGY 激活培养时，可进行挑 单菌落培养 24h,而不用常规的 1接种。摇床可定期用 75酒精喷洒消毒。 2.，如果只是检测用，用试管小量培养。先前用 250ml 的锥形瓶培养，既浪费材料，又耗费精 力。目前表达出来的蛋白就是在试管（十几，二十 ml 的那种）培养的。 3. 1.5ml 的 BMGY 激活 24h 后，换液，BMMY 也用 1.5ml.用多少的 BMMY 决定了你的蛋白表 达出来的浓度。用等体积换液，表达完收获的上清不用浓缩，直接上 SDS-PAGE。如果担心浓 度不够，可缩小 BMMY 的体积，那实际上也等于在浓缩上清。先前采用大量培养再取上清进 行 TCA-丙
39、酮法，丙酮法，氯仿乙醇法浓缩，效果都不好。 4.把电泳图也一并传上，与大家分享！ 军科院的方法： 1、用酵母细胞裂解液重悬酵母菌 2、加酚氯仿 3、加玻璃珠 4、振荡半小时 5、乙醇沉淀 6、电转大肠杆菌 Detailed: Plasmid Isolation from Yeast Reagents and Materials Required The YEASTMAKER Yeast Plasmid Isolation Kit (#K1611-1) provides the SDS and lyticase solutions, CHROMA SPIN- 1000 DEPC-H2O Colu
40、mns, and 2-ml centrifuge tubes for use with the columns. Appropriate SD liquid or agar medium to keep selection on the plasmids (Appendix C.A; Appendix E). Sterile, 1.5-ml microcentrifuge tubes (or a 96-tube microtiter array, multichannel pipettors, and centrifuge adaptor for multiwell plates). 20%
41、SDS Lyticase Solution (5 units/ml in TE buffer; store at 4C for up to 2 months or at 20C for up to 6 months. If colloidal material precipitates, mix the solution by inversion before using.) Recommended: CHROMA SPIN-1000 DEPC-H2O Columns (#K1334-1) and 2-ml centrifuge tubes for use with the columns I
42、f you do not use CHROMA SPIN Columns, you will need materials to perform phenol:chloroform extraction and ethanol precipitation: Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1; See Sambrook et al., 1989, for information on preparing neutralized phenol solutions) 10 M ammonium acetate 95100% ethanol 1.Pr
43、epare yeast cultures for lysis (Step a, b, or c below). a. From a solid patch of growth: i. Spread a thin film of yeast cells (2-cm2 patch) onto the appropriate SD agar medium. ii. Incubate plate at 30C for 34 days. (The patch should show abundant yeast growth.) iii. Scrape up a portion of the patch
44、 (10 mm2) and resuspend the cells in 50 ml of sterile H2O or TE in a 1.5-ml microcentrifuge tube. b. From a liquid culture: i. Inoculate a large (24-mm), fresh (24-day-old) yeast colony into 0.5 ml of the appropriate SD liquid medium. Vortex tube vigorously to completely break up the colony and resu
45、spend the cells. ii. Incubate at 30C overnight with shaking at 230250 rpm. iii. Spin down the cells by centrifuging at 14,000 rpm for 5 min. iv. Carefully pour off the supernatant and resuspend pellets in the residual liquid (total volume 50 ml). c. For semi-automated handling of a large number of s
46、amples: i. Place a large (24-mm), fresh (24-day-old) yeast colony into 0.5 ml of the appropriate SD liquid medium in separate wells of a 96-tube microtiter array. Vortex each tube vigorously to resuspend the cells. (Alternatively, use 0.5 ml of an overnight SD liquid culture instead of a yeast colon
47、y.) ii. Using a centrifuge adapted for multiwell plates, centrifuge the entire array at 1,000 x g for 5 min to pellet the cells. iii. Carefully pour (or draw) off supernatants and resuspend pellets in the residual medium (50 ml) by vortexing or pipetting up and down. 2. Add 10 ml of lyticase solutio
48、n to each tube. Thoroughly resuspend the cells by vortexing or repeatedly pipetting up and down. 3. Incubate tubes at 37C for 3060 min with shaking at 200-250 rpm. Optional Check a drop of the cell suspension under a phase contrast microscope (400X) for the progress of cell lysis by adding a drop of
49、 20% SDS to the side of the coverslip. As they come into contact with the SDS, most cells should lose their refractile appearance and appear as “ghost-like“ spheroplasts. If there are still many intact cells present, incubate the samples for another 30 min. 4. Add 10 ml of 20% SDS to each tube and vortex vigorously for 1 min to mix. 5. Put the samples through one freeze/thaw cycle (at 20
