1、第 0 页 共 19 页 盆栽盐胁迫下甜高粱种子萌发及苗期生理观测实验方案 实验一 盐土盆栽条件下贝利等 3 种甜高粱的种子萌发统计 一、实验目的 1. 了解盐碱地概念及目前国内外土壤盐渍化现状及防治措施； 2. 了解实验条件下土壤盐度与实际盐分间的转换关系及调控方法； 3. 掌握便携式土壤多参数测定仪测定要领，依此确定播种墒情； 4. 观测土壤盐分动态变化，思考如何及时调整，以维持实验的盐分梯度的稳定。 二、实验原理 盐碱地是盐碱化土壤的总称，土壤层中含有易检出的可溶性盐。受自然及集约灌溉方 式等因素的影响，我国盐碱地多分布于沿海淡水与海水交汇地区、有地质海洋沉积物析出 且较干旱的西北地区，
2、盐碱地主要含有由钠离子、钙离子、镁离子以及碳酸根、碳酸氢根、 氯离子、硫酸根离子组合而成的 12 种盐。土壤或水体中含盐量的表示方法较多，通常以 25下的电导率（EC：dS/m）为主。盐碱土的盐分由多种离子组成，研究时常以 NaCl 含 量来简化表示，EC 值与可溶性盐（复合盐或 NaCl）含量之间的换算为： 1dS/m=0.64g/L（11mmol/L、0.064%），土壤盐度与其饱和浸提液 EC 值之间的关系为： 当 EC4dS/m（0.252%），土壤为盐土；EC 值介于 48dS/m（0.2%0.5%），为轻度盐 渍化；EC 值介于 915dS/m（0.5%0.975%），为中度盐渍化
3、；EC15dS/m（0.975%）， 土壤为重度盐渍化。不同地区及不同时期，土壤盐渍化标准有所变动，然大致与之相当。 目前国内大部分盐土盐度在 0.4%0.7%1。 世界范围内，受过度耕作及不合理灌溉等自然及人为因素等的影响，6%土壤含盐碱， 且在主要由人口带来的粮食增产需求增加的作用下，预计到本世纪中叶，一半的耕地将盐 渍化 2 ，我国盐碱地约 1 亿公顷 3，宁夏遥感院、农发办等的调查指出，宁夏引黄灌区盐 碱地达 14.79 万公顷，占该区耕地面积的 33.54%，盐碱荒地面积为 5.57 万公顷 4。土壤 表层盐分富集，既与海水运动、盐分沉积等自然作用有关，更多的还是由人为因素导致的。
4、纵观历史，随着人口增加、社会的繁荣，土壤盐渍化就愈演愈烈。且其发展势头，只能适 度减缓，而不能从根本上逆转，故形势较为严峻，改良往往也收效甚微。较好的办法，只 能减少人为干预，且提供必要条件使之逐渐恢复，却较难回到最初的状态，且人们还需要 经受住生存需求的考验。然而，在漫长进化之路上，一些植在遭受盐碱胁迫的同时，逐渐 提高了对环境的适应能力，能获得生存的机会。从中，能给我们提供一些启示：从中选择 合适的物种，加以种植，切断盐渍化与荒漠化之间的联系，结合辅助措施，逐步实现改良 当地生态的目的；了解其适应策略，将之与传统作物种植结合，在生产过程中，逐步改变 原有粗放方式，在实现增产的同时，达到节约
5、资源、保护耕地等目的。 POGO 土壤多参数测定仪由三部分组成：能感应土壤温度、水分、电导率等的 Hydra 精密探头、供电器及装有仪器控制软件的 PAD，测定时在三者相连且各部分状态正 常的情况下，通过 PAD 上的 HydraMon 软件控制没入土壤中的探头，就能实现对样地土壤温 度、水分、电导率等指标的快速测量与记录(Hydra Probe Manual 92915 July 2007)。 在自然条件下，土壤盐分组成一般较为复杂，在实验条件下，常以添加同等比重的单 盐来模拟自然盐分的影响，通常有两种表示方法：盐分浓度（ ）、盐分比重Lmol/ （%），前者用在水培条件下，后者用在盆栽或大
6、田环境下。本实验，考虑到甜高粱的生 第 1 页 共 19 页 长离不开土壤，故以往土里按比例添加氯化钠的方式进行盐分条件模拟。如土壤重量 5 ，往里面加 30 ，混合均匀，则该土壤盐分为 0.6%，近似于水培条件下 100KggNacl 的盐浓度，此时已达到中度盐胁迫水平。Lmol/ 甜高粱出苗率既受种子前处理程度、播种量等自身因素的影响，还取决于播种深度、 土壤含水量、土壤温度及盐分含量等多种外在因素的作用，总的来说，土壤墒情，对出苗 率的影响较大。在田间条件下，一般在土壤温湿度为 20 左右的初夏进行甜高粱播种，播 种深度以 35cm 为宜 5，播种量及种植密度则取决于所选品种、土壤条件及
7、种植目的。本 实验由于是在初春之际于温室中进行，条件应有一些变动：播种深度为 2cm，7 号盆播 25 粒，8 号盆播 30 粒。 三、材料、仪器与试剂 （1）材料：贝利、考力、辽甜 1 号甜高粱种子，农家菜地土壤； （2）仪器：POGO 土壤多参数测定仪（RS485）、恒温培养振荡器（ZWY-100H）； （3）试剂：无水乙醇（AR）、氯化钠（AR） 四、实验步骤 1. 盐土配制 （1）盐分梯度设置： 、 、 、 、 ；）（ 0CK）（ %2.1T）（ 4.03%)6.(4T）（ 8.05 （2） 土壤盐分添加：准备 7 号塑料花盆（20cm18 cm）30 个、8 号塑料花盆 （24cm1
8、8cm）15 个，先往两种规格花盆里各加 2 、5 菜地土壤，接着将它们按 5Kg 盆一行，排成 9 行，前 3 行放大盆、后 6 行放小盆，每 3 行设置一个能区分的间距，并将 每列对齐。之后按盐分梯度设置依次往每行的盆里添加已称量好的盐分，并混合均匀。加 完后，浇适量水（小盆 200mL、大盆 400mL），利用 POGO 测定仪测试并记录各盆中电 导率数值，换算成盐分含量后，与理论值比较，若出现较大差异，思考其中的原因。 2. 种子处理与播种 （1）种子处理：选取籽粒饱满的贝利、考力、辽甜 1 号种子各 600 粒，放到 3 个 250mL 洁净锥形瓶中，各加 50mL75%乙醇溶液，浸
9、泡 15min，之后倒掉溶液，用纯水清 洗 3 次，各加 50mL 纯水，覆膜，置于恒温培养振荡器中，设定温度为 40、转速为 120r/min，摇约 10h，待露白即可。 （2）播种：准备洁净滤纸，将 3 个品种露白的种子分别倒到滤纸上，按三点法进行播 种，大盆播辽甜 1 号，一盆 30 粒，小盆分别播贝利、考力，每盆 25 粒。播种前浇透水， 让土面平整，将种子均匀放在表面，再覆土 2cm。之后，覆膜保温，促其萌发。待一周后， 观察并统计贝利、考力、辽甜 1 号形态指标，为期一周。 表 1 盐分梯度及品种分布情况列表 品种 种 处理 CKT23T4 （0g） （10g） （20g） （30
10、g） （40g） （0g） （10g） （20g） （30g） （40g）辽甜 1 号 （土量 （0g） （10g） （20g） （30g） （40g） 第 2 页 共 19 页 5kg） （0g） （4g） （8g） （12g ） （16g ） （0g） （4g） （8g） （12g ） （16g ）贝利 （土量 2kg） （0g） （4g） （8g） （12g ） （16g ） （0g） （4g） （8g） （12g ） （16g ） （0g） （4g） （8g） （12g ） （16g ）考力 （同上） （0g） （4g） （8g） （12g ） （16g ） 3. 形态指标观测 6 （
11、1）观测指标：发芽势、发芽率、芽苗长、根长、发芽相对盐害率 （2）测算方法： 发芽率= %104播 种 数G 发芽势= 1播 种 数 发芽指数= tDG 活力指数= tS 相对芽长= %10芽 长芽 长CKT 相对根长= 根 长根 长 盐害程度= 10CKTn 公式中， 是指播种后第 天的出苗数， 则是对应的天数， 是幼苗鲜重。tGttDS 五、实验结果 1、土壤盐分监测 表 2 土壤盐分实际测定值 品种 种 处理 CK1T23T4 辽甜 1 号 第 3 页 共 19 页 贝利 考力 2、土壤盐分对 3 种甜高粱形态指标的影响 表 2 3 种甜高粱在不同土壤盐分胁迫下形态指标的观测 含盐量（%
12、 ） GR（% ） GE VI SL（cm ） RL（cm ） SFW（g ） RFW（g ） 0% 0.2% 0.4% 0.6% 0.8% 表中 发芽率； 发芽势； 种子活力指数； 芽长； 根长； 芽：GR：E：VI：SL：R：SFW 鲜重； 根鲜重；下同。：FW 表 3 甜高粱在不同盐分土壤中所受胁迫程度比较 参考指标 含盐量（%） 均值 标准差 变异系数（%） 0.2% 0.4% 0.6% 发芽率 0.8% 0.2% 0.4% 0.6% 发芽势 0.8% 0.2% 0.4% 0.6% 根鲜重 0.8% 六、注意事项 1. 种子前处理时应选好种、消毒时间要严格控制在 15min，置于摇床上
13、培养时，水不 能加太多，没过种子表面 1cm 即可，所设温度温度不能太高、转速适宜即可。 2. 播种前，为保证一定的土壤含水量，应浇一定的水，且注意少量多次，花盆容土量 一定，保水有限，土壤盐分会随着多余的水分而流出。 3. 在使用 POGO 土壤多参数测定仪时，应提前给供电器和 PAD 充电，连接接头时， 注意接口，探头应轻拿轻放，用完之后，请将泥土清理干净。 4. 播种过程中，先将土面摊平，再均匀播种，按三点法播种，单点播种数量 510 粒 为宜。 参考文献 第 4 页 共 19 页 1 陈晓亚,汤章城.植物生理与分子生物学M. 北京,高等教育出版社 ,2007,06:533-534. 2
14、 Alison M.Smith,et al.Plant biologyM.New York,NK:Garland Science,2010:472. 3 张新华.盐碱地这块“硬骨头”有多少料？N.中国绿色时报,2014,06. 4杨琪.中科院合肥研究所给盐碱地披“绿衣”N.中国科学报,2014,07. 5卢庆善.甜高粱M.北京:中国农业科学技术出版社,2008.4:150-163. 6 王秀玲,程序,李桂英.甜高粱耐盐材料的筛选及芽苗期耐盐性相关分析 J.中国生态农业 学报, 2010,18(6): 1240. 实验二 盐胁迫下甜高粱幼苗光合作用测定 一、实验目的 1. 通过实验，掌握植物体叶
15、片光合作用测定原理及方法； 2. 经过对观测值的整理、分析，得出盐胁迫对光合作用影响及其差异； 二、实验原理 作为地球上一重要的生命现象，光合作用一直备受关注，相关研究已不断深入，测量 方法也得到革新，已从关注干物质积累的称重法，过渡到观测气体变化的滴定法、氧气电 极法，继而发展到利用红外线二氧化碳气体分析仪（ ）等工具组合来实现光合作用IRGA 的实时、自动化、智能化测定。 二氧化碳作为光合作用中被植物加以利用的原料，分析其含量变化，就能实现对光合 强度的测量，然而光合作用通常是一个缓慢且微观的过程，二氧化碳浓度变化较难实时测 量， 的出现使之成为了可能。 能吸收途经的红外线，红外线因此而引
16、起辐射能IRGA2CO 减小，变化关系服从朗博-比尔定律，即因受二氧化碳吸收而引起的红外线辐射能降低量与 二氧化碳吸收系数（K）、浓度（ C）、气体层厚度（L）有关，表达式为 1：KCLeE0 红外光源发射出 1-20 的红外光，通过一定长度的气室吸收后，经过一个 4.26 波umum 长的窄带滤光片后，由红外传感器监测透过 4.26 波长红外光的强度，以此计算二氧化um 碳气体的浓度。在实现对二氧化碳浓度的微量实时监测之后，辅以水分、温度传感器、人 工红蓝光源等，再加载计算用的软件，即可构建出现代意义上的光合测定系统。本次实验 所用的测定系统，便由此发展而来。Li-6400 光合测定系统，由
17、美国 生物科技公CORLI 司开发，属于该公司第三代产品，也是目前较好的测定系统。它使用两套红外分析器，一 个作为对照，称之为参比室，一个测量样品，称之为样品室，同时测量两个室的 CO2 浓度 差，即差分法 2。 此外还沿用开路式、测量中的匹配模式、环境控制等以提高结果的可靠程度，并借助第 56 代系统软件，实现数据的实时显示与自动控制。 第 5 页 共 19 页 图 1 开路式示意图 图 2 匹配模式示 第 6 页 共 19 页 图 3 测量模式 图 4 控制二氧化碳浓度下测量意图 三、材料、仪器与试剂 （1）材料：贝利、考力、辽甜 1 号甜高粱幼苗叶片； （2）仪器：LI-6400 光合测
18、定系统； （3）试剂：干燥剂； 四、实验步骤 1.系统预热 （1）仪器连接：将系统从保护箱中取出，装好支架，取出分析器和连接线，先将连接 线的一头和主系统相应插口相连，连接时先找准位置，注意均匀用力，也不用将螺丝拧太 紧，能固定即可，在将另一头和分析器相连，PEAK 管中黑色的与样品室接口相连，白色 的与参比室接口相连，注意区分；另外圆形接口端与分析器相连时，应红点相对，直插直 拔，不用太大劲，连接好了之后，给主机装电池，打开电池盒上方电源开关，仪器在正常 情况下，即开始启动； （2）日常检查： 1)检查温度 第 7 页 共 19 页 检查 h 行三个温度值 Tblock, Tair 和 Tl
19、eaf，是否合理，且彼此相差应该在 1以内； 叶温热电偶的位置是否正确，直接测量叶片温度时，叶温热电偶的结点位置应高于 叶室垫圈约 1mm，保证夹叶片时能与叶片充分接触；如果使用能量平衡方法测量叶片 温度，则叶温热电偶的结点位置应低于叶室垫圈 1mm，确保夹叶片时，接触不到叶片。 2)检查光源和光量子传感器 检查光源是否工作，且工作正常（有光源时，无光源该检查忽略）； 检查 g 行 ParIn_m 和 ParOut_m 传感器是否有响应。 3)检查大气压传感器 检查 g 行 Prss_kPa 值是否合理。一般在海平面大气压值约 100kPa ，海拔 300 米大 气压约为 97 kPa ，海拔
20、 1500 米约 83 kPa 且随天气变化，大气压可能会有 1 到 2 kPa 的变化。 4)检查叶室混合扇 在测量菜单中，按 2，f1，按 O 关闭，或按 F 打开叶室混合扇，将分析器头部放到 耳朵旁边，听分析器头部声音是否随着风扇关闭、打开有变化，如果有变化，表示正 常。 5)检查是否存在气路堵塞 在测量菜单中，按 2，f2，设定流速为 1000，将化学管旋钮拧到完全 bypass，检查 b 行 flow 能否达到 650 以上，如果都能达到，则说明气路没有堵塞；如果发现有达不到 的现象，则分别检查两个化学药品管，方法都是将调解旋钮从 bypass 一侧完全旋到 scrub 一侧，检查流
21、速下降是否大于 20，如果大于 20，,同时在拧化学药品管时，伴随 有较大噪声，则相应药品管存在气路堵塞。 常见堵塞地方是：化学管内过滤嘴；化学管顶部的两个聚乙烯透明管。 6)叶室的漏气检查 要检查是否漏气，需要化学管调到完全吸收位置，然后在叶室周围吹气，如果发现 a 行样品室 CO2 的读数变化大于 2ppm，说明叶室可能有漏气。 常发生漏气的地方：上下叶室泡沫垫圈；上下叶室的 O 形密封圈；排气管；叶室后部 三孔泡沫垫。 7)检查流速零点 关闭泵(测量菜单，按 2，f2，按 N)，然后关闭叶室混合扇（按 2，f1，按 O）； 检查 b 行 Flow 是否在2ppm 之间，如果在，表示正常；
22、如果不在此范围，需进入 校准菜单，进行 Flow meter zero。 注意：完成后，切记要将流速再调节回 500，将混合风扇设置在 Fast 状态。 8)检查 CO2 和 H2O IRGAs 零点 将两个化学管都旋至完全吸收位置，完全闭合叶室且保证是空的； 等待大约 5 分钟，参比室和样品室 CO2 和 H2O 会降到零附近。如果 CO2 读数在 5ppm 以内；H2O 在0.5 毫摩尔每摩尔以内，说明零点正常，不需要校准。如果它 们超过这个范围，且还有下降的趋势，我们建议您再等大约 10min，此时可以检查干 扰零点的其它原因，如化学药品失效、AGC 电压值异常、样品室太脏或叶室漏气等。
23、 排除以上原因后，如果数据稳定后还不能达到要求，需进入校准菜单，进行 IRGAs zero。 9)校准叶温热电偶的零点 拔开紫色插头， 检查 h 行 Tblock 和 Tleaf 温度差值是否在 0.1以内，如果大于 第 8 页 共 19 页 0.1，则需要调节电位调节器进行校准，使得 Tleaf 和 Tblock 之间相等或相差 0.1 以内。用一字型螺丝刀对分析器底部电位调节器进行温度校准，顺时针旋转 Tleaf 升 高，反之降低，直到 Tleaf 基本等于 Tblock。完成后将紫色插头重新插好。 10)检查匹配阀 检查匹配阀是否工作；（注意匹配前将两个化学药品管拧到完全 bypass）
24、 应该在每天开始测量前，进行一次匹配。建议每测量一叶片都先匹配一下，待数据 稳定后再记录，如果做实验时，每次测量都要改变 CO2 浓度，那么每改变一次 CO2 浓度，也需要进行一次匹配。 2. 给定光强下光合速率测定 （1）装好化学药品，连接硬件（如果使用 CF 卡，则插入主机后面固定小槽内）。 （2）开机，配置界面选择 Factory default，连接状态按“Y ”，进入主菜单，预热约 20 分钟。 （3）进行日常检查。 （4）打开叶室，夹好测量的植物叶片。 （5）按 1, f1（Open LogFile）, 选择将数据存入的位置（主机 or CF 卡），建立一个文 件，enter，输入
25、一个 remark，enter。 （6）等待 a 行参数稳定，b 行 CO2 值波动 0、Ci 0、Tr 0）。 （7）按 f1(Log)记录数据。每测定一片叶进行一次 Match。 （8）更换另一叶片，按 f4，添加 remark, 重复 47 步骤，进行测量。 （9）按 f3（Close file），保存数据文件。 （10）用 RS-232 数据线连接电脑和 LI-6400XT，按 Esc 退回主界面，按 f5（Utility Menu），按上下箭头选择“ File Exchange Mode”，在电脑上预先安装 SimFX 软件，双击 打开 LI6400FileEx，点击 File，选择
26、 Prefs，选择 Com 端口，按 Connect，连接成功后，选 择文件传输到指定位置（CF 卡内的数据也可在退出卡后，直接插入电脑读卡器来导出数据） 。 （11）按 Esc，退回主界面，关机。 （12）切记把化学管旋钮旋至中间松弛状态；旋松叶室固定螺丝，保持叶室处于打开状 态。 3. 光合日变化测定 选择一个晴天，换上透明叶室，提前开机预热，在此期间进行日常检查，之后依品种 与处理进行光合日变化测定：将植株移至光下，把叶片置于叶室中，合上叶室，并让阳光 垂直照射进叶室，待稳定之后，即记录数据，每个植株测三个叶片，没个处理测三株，以 此测定上午 9:0011:30，下午 3:005:30
27、阶段光合变化情况。 4. 光响应曲线测定 （1）测定前的准备工作：测定光响应曲线之前，要进行光诱导。在估测的饱和光强下 诱导至稳定的最大净光合速率（ ）。此饱和光强不能太大，否则可能产生光抑制。确maxP 定最适诱导光强和诱导时间，大概 30 分钟左右。 （2）硬件安装与连接：安装红蓝光源；装好化学药品；连接硬件（如果使用 CF 卡， 则 插入主机后面固定小槽内）。 （3）开机，配置界面选择红蓝光源，连接状态按“Y”，进入主菜单，预热约 20 分钟。 （4）按 f4 进入测量菜单；进行日常检查。 第 9 页 共 19 页 （5）在测量界面下，按 2，再按 f3(CO2 Mixer)，按上下箭头
28、键选择 Reference CO2， 按 OK，设定参比室 CO2 浓度为环境 CO2 浓度( 约 400 mol mol-1)，按 enter。（可选择） （6）打开叶室，夹好叶片，闭合叶室。 （7）按 1,f1, Open LogFile, 选择将数据存入的位置（主机 or CF 卡），建立一个文件， enter，输入一个 remark，enter。 （8）按 5，f1(Auto prog)，进入自动测量界面，按上下箭头键选择 LightCurve2，enter 进入，命名文件，enter，添加 remark，enter，出现 Summary SetPts for Qutm 展开后在 Se
29、tPts 处展开设置光强梯度，自高到低设定光强梯度如 1500 1000 500 200 150 100 50 20 0(注意数值间一定空格间隔，上面数值仅供参考) ，enter 后，在 Stability wait 处设置最小等 待时间 Minimum wait time (secs):120 和最大等待时间 Maximum wait time(secs):设定 300，enter，在 Match 设定下将 |CO2|设定为 50，其余值不变，按 F5，start，进入自动 测量，等待测量结束（第 5 行 F1 处的*消失）。 （9）按 1，f3(Close file)保存文件。更换叶片，重
30、复 48 步骤。 （10）用 RS-232 数据线连接电脑和 LI-6400，按 esc 退回主界面，按 f5（Utility Menu）按上下箭头选择“File Exchange Mode”，在电脑上预先安装 SimFX 软件，双击打 开 LI6400FileEx，点击 File，选择 Prefs，选择 Com 端口，按 Connect，连接成功后，选择 文件传输到指定位置（CF 卡内的数据也可在退出卡后，直接插入电脑读卡器来导出数据）。 （11）关机。按 Esc，退回主界面，关闭电源。 五、实验结果 1. 一定光强下的光合测定结果 表 1 盐胁迫下 3 种甜高粱幼苗叶光合作用数值 品种 种
31、 处理 CK1T23T4 辽甜 1 号 贝利 考力 2. 光合日变化规律 3. 光响应曲线 六、注意事项 1. 测定系统属于精密仪器，测量过程周期较长且涉及跟换叶室等操作，需要提前熟悉 并严格按照要求操作，注意多学、多思考； 2. 测量过程中，要留意仪器状态，若出现 为负的，需要查找原因，注意匹配；nF 第 10 页 共 19 页 3. 进行光合响应曲线测定时，需要把握时间，待植株完全处于活化状态时或经过一定 光强的诱导之后，再进行自动化测量，注意叶室闭合位置是否恰当，太紧了会损伤叶片。 参考文献 1 史树德,孙亚卿,魏磊.植物生理学实验指导M. 北京: 中国林业出版社,2011,04:40-
32、56. 2 LI-COR Biosciences.Using the LI-6400/6400XTM.Nebraska:Lincoln,2012,1:1-12. 实验三 盐胁迫下甜高粱幼苗叶片叶绿素含量测定 一、实验目的 1. 通过实验，掌握植物体叶片叶绿素测定的原理及方法； 2. 经过对观测值的整理、分析，得出盐胁迫对叶绿素影响及其差异； 二、实验原理 第 11 页 共 19 页 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸 光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据 Lambert-Beer 定律，某有色溶液的 吸光度 A 与其中溶质浓度 C 和液层厚度
33、 L 成正比，即 ，式中： 比例常数。当aCLAa 溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为 1cm 时， 为该物质的吸光系数。各种有色物质 溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。 如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长 下吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。据此，叶绿素测定有多种方法可供选择：目视 比色法、叶绿素仪活体测定法、分光光度法。用分光光度法测定叶绿体色素混合提取液中 各组分含量时，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度 A，并根据叶绿素 a、b 及类 胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶
34、绿素 a、b 时为了排除类胡萝卜 素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 三、材料、仪器与试剂 （1）材料：贝利、考力、辽甜 1 号甜高粱幼苗叶片； （2）仪器：分光光度计；电子分析天平；研钵；剪刀；滤纸；玻璃棒；容量瓶； （3）试剂：80%丙酮；石英砂；碳酸钙粉末； 四、实验步骤 1. 叶绿素的提取 用打孔器取新鲜甜高粱幼苗叶片 1 ，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），切2cm 成细丝，置于 10 离心管中（内含 5 80%丙酮）,带回实验室后，置于黑暗条件下静mLL 置过夜，即为叶绿素提取液 1。 2. 叶绿素的测定 取光径为 1 的玻璃比色皿，加入叶绿素提取液至离杯
35、口 1 处，以丙酮溶液作为c cm 对照，分别测定该提取液在 646、663 处的吸光度值，并一一记录。n 4. 计算公式 2 根据由 于 20 世纪 40 年代末提出的叶绿素计算公式及后来ArnoID 等的补充，叶绿素含量作如下计算：leLichta646381.2.1C3405b297.bacx CA =叶 绿 素 )/(mgSNV叶 绿 素 式中： 、 叶绿素 的浓度；aCbba、 类胡萝卜素总的浓度；cx 提取液在相应波长处的吸光度值；47063A、 第 12 页 共 19 页 提取液中色素浓度（ ），由样品吸光度值及换算公式求得；CmLg/ 提取液总体积（ ）；V 稀释倍数;N 样品
36、面积（ ）。S2c 五、实验结果 1. 脯氨酸测定结果 表 1 叶绿素含量测定记录 编号 鲜重 面积 64A63aCbcxV 表 2 盐胁迫下 3 种甜高粱幼苗叶绿素的含量 品种 种 处理 CK1T23T4 辽甜 1 号 贝利 考力 六、注意事项 1. 为了保证结果可靠，试剂现配现用，可提前将萃取液置于离心管中，将叶片从植株 上取下之后即放入离心管，密封保存，以较少离体叶片在环境中暴露的时间。 2. 分光光度计在使用前需要预热 1020min，尽量选择较精密的分光光度计，且在进 行测定时，需要将玻璃比色皿清洗干净。 3. 每个处理取三株、每次测定做三组平行，最后结果取均值。 参考文献 1 徐大
37、全.光合作用学M.北京 :科学出版社,2013:90. 2 史树德,孙亚卿,魏磊.植物生理学实验指导M. 北京: 中国林业出版社,2011,04:34-35. 第 13 页 共 19 页 实验四 盐胁迫下甜高粱幼苗叶片脯氨酸含量测定 一、实验目的 第 14 页 共 19 页 1. 通过实验，掌握植物体内脯氨酸测定的原理及方法； 2. 经过对观测值的整理、分析，得出材料胁迫耐受性的差异； 二、实验原理 在逆境条件下（旱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸的含量显著增加，植物体内脯氨 酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种积累的脯氨酸多。因此测定脯 氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外
38、，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶 体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物 组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。 磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于 磺基水杨酸溶液中，不受样品状态的影响，并能减少其它氨基酸的干扰。然后用酸性茚三 酮加热处理后，茚三酮与脯氨酸反应，生成稳定的红色化合物，再用甲苯处理，则色素全 部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在 520nm 波长下测定吸光度，即 可从标准曲线上查出脯氨酸的含量。 三、材料、仪器与试剂 （1）材料：贝利、考力、辽
39、甜 1 号甜高粱幼苗叶片； （2）仪器：离心机，分光光度计；电子分析天平；恒温水浴；研钵；试管；移液管 （1ml、5ml）、试管架；移液管架；洗耳球；剪刀； （3）试剂：茚三酮，冰醋酸，磷酸，磺基水杨酸，脯氨酸，甲苯； （4）溶液配制：2.5%酸性茚三酮显色液：将 1.25 茚三酮溶于 30 冰醋酸及 20gmL 6 磷酸中（70 搅拌溶解），冷却后置于棕色试剂瓶，冷藏，两天内有效；mLol/ 3磺基水杨酸：称取 3 磺基水杨酸，于 100 容量瓶中加纯水定容；10 脯gmLug/ 氨酸标准溶液配制：称取 10 脯氨酸，置于 100 洁净容量瓶中，并用纯水定容。 四、实验步骤 1. 绘制标准曲
40、线 （1）取 6 支试管，编号，按下表配制每管含量为 010g 的脯氨酸标准液，加入 表中试剂后，置于沸水浴中加热 30min。取出冷却，各试管再加入 4ml 甲苯，振荡 30 秒 钟，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液； 管 号试 剂 0 1 2 3 4 5 10gml -1 脯氨酸标准液 （ml） 蒸馏水（ml） 冰醋酸（ml） 2.5酸性茚三酮（ml） 0 2 2 2 0.2 1.8 2 2 0.4 1.6 2 2 0.6 1.4 2 2 0.8 1.2 2 2 1.0 1.0 2 2 每管脯氨酸含量（g） 0 2 4 6 8 10 （2）轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶
41、液为空白对照，在 520mm 波长处测定吸光度（A ）值； （3）以 15 号管脯氨酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。 第 15 页 共 19 页 2. 叶片中脯氨酸的提取 称取不同处理的植物叶片各 0.5g，剪碎之后，分别置于具塞试管中，然后向各管分别 加入 5ml 3的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取 10min（提取过程中要经常摇动），冷却 后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。 3. 叶片中脯氨酸含量测定 吸取 2ml 提取液于带玻塞试管中，加入 2ml 冰醋酸及 3ml 2.5酸性茚三酮试剂，在沸 水浴中加热 40min，溶液即呈红色。冷却后加入 4ml 甲苯，摇
42、荡 30 秒钟，静置片刻，取上 层液至 10ml 离心管中，在 3000r/min 离心 5min。用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液 于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在 520mm 波长处测定吸光度（ A）值，根据标准曲 线计算样品中脯氨酸的浓度，再结合下面的公式，计算样品中具体含量。 4. 计算公式 =脯 氨 酸 )/(guaWVC脯 氨 酸 式中： 提取液中脯氨酸浓度（ ），由样品吸光度值及标准曲线求得；mLug/ 提取液总体积（ ）；V 所吸取样液体积（ ）;a 样品质量（ ）。 五、实验结果 1. 脯氨酸测定结果 表 2 盐胁迫下 3 种甜高粱幼苗叶片脯氨酸含量 品种 种 处理
43、CK1T23T4 辽甜 1 号 贝利 考力 六、注意事项 1. 为了保证结果可靠，试剂现配现用，可提前将萃取液置于离心管中，将叶片从植株 上取下之后即放入离心管，密封保存，以较少离体叶片在环境中暴露的时间。 2. 分光光度计在使用前需要预热 1020min，尽量选择较精密的分光光度计，且在进 行测定时，需要将玻璃比色皿清洗干净。 3. 每个处理取三株、每次测定做三组平行，最后结果取均值。 第 16 页 共 19 页 参考文献 1 史树德,孙亚卿,魏磊.植物生理学实验指导M. 北京: 中国林业出版社,2011,04:142-144. 第 17 页 共 19 页 实验五 盐胁迫下甜高粱幼苗叶片丙二
44、醛含量测定 一、实验目的 1. 通过实验，掌握植物体内丙二醛含量测定的原理及方法； 2. 经过对观测值的整理、分析，得出材料胁迫耐受性的差异； 二、实验原理 丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生 过氧化反应而产生的。它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。测定植物体内丙二醛 含量，通常利用硫代巴比妥酸(TBA)在酸性条件下加热与组织中的丙二醛产生显色反应， 生成红棕色的三甲川（3、5、5三甲基恶唑 2、4二酮），三甲川最大的吸收波长在 532nm。但是测定植物组织中 MDA 时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖 与硫代巴比妥酸显色反应产物的最大
45、吸收波长在 450nm 处，在 532nm 处也有吸收。植物 遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中丙二醛与硫代巴 比妥酸反应产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。此外在 532nm 波长处尚有非特异的背 景吸收的影响也要加以排除。低浓度的铁离子能显著增加硫代巴比妥酸与蔗糖或丙二醛显 色反应物在 532、450nm 处的吸光度值，所以在蔗糖、丙二醛与硫代巴比妥酸显色反应中 需要有一定的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为 100300 ，根据植物1./DWgu 样品量和提取液的体积，加入 的终浓度为 。在 532nm、600nm 和 450nm3Fe1/5.0Lnmol
46、 波长处测定吸光度值，即可计算出丙二醛含量 1。 三、材料、仪器与试剂 （1）材料：贝利、考力、辽甜 1 号甜高粱幼苗叶片； （2）仪器：离心机，分光光度计；电子分析天平；恒温水浴；研钵；试管；移液管 （1ml、5ml）、试管架；移液管架；洗耳球；剪刀； （3）试剂：10三氯乙酸；0.6硫代巴比妥酸（TBA）溶液：称取 0.6 硫代巴g 比妥酸，于 100 容量瓶中用 10% 定容； 石英砂。mLTCA 四、实验步骤 2 1. 叶片中 MDA 提取 称取剪碎的甜高粱叶片 1g，加 2mL10%三氯乙酸和少量石英砂，研磨至匀浆，再加 8mL 三氯乙酸进一步研磨，经 5200r/min 离心 10
47、min。取上清液液备用。 2. 显色反应及数值读取 吸取离心之后的上清液 2mL0.6%TBA（用 10%TCA 配成），混匀物于沸水浴上反应 15min，迅速冷却后再离心，取上清液测定其在 450、532 、600nm 处各自的吸光度值。 3. 含量计算 （ ）=MDACLumol/ 45060532.)(4.6D 叶片 = （ 为提取液体积， 为样品鲜重）)/(glWVCMDAW 第 18 页 共 19 页 五、实验结果 1. MDA 测定结果 表 1 盐胁迫下 3 种甜高粱幼苗叶片丙二醛含量 品种 种 处理 CK1T23T4 辽甜 1 号 贝利 考力 六、注意事项 1. 为了保证结果可靠，试剂现配现用，可提前将萃取液置于离心管中，将叶片从植株 上取下之后即放入离心管，密封保存，以较少离体叶片在环境中暴露的时间。 2. 分光光度计在使用前需要预热 1020min，尽量选择较精密的分光光度计，且在进 行测定时，需要将玻璃比色皿清洗干净。 3. 每个处理取三株、每次测定做三组平行，最后结果取均值。 参考文献 1 史树德,孙亚卿,魏磊.植物生理学实验指导M. 北京: 中国林业出版社,2011,04:126-127. 2 中科院上海植物生理研究所.现代植物生理学实验指南 M.北京: 科学出版社,2004.
