1、1 饲料原料中赭曲霉毒素的快速筛查 胶体金快速定量法 江西省地方标准 编制说明 一、标准制定意义 （一）介绍 赭曲霉毒素 A 是由多种生长在粮食（小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、大米和黍类等）、花生、蔬菜（豆类）等农作物上的曲霉和青霉产生的。动物摄入霉变饲料后，这种毒素也可能出现在猪和母鸡等的肉中。赭曲霉毒素主要损害动物肝脏与肾脏，引起肝脏和肾脏损伤，大量毒素也可能引起动物肠黏膜炎症和坏死。有报道指出，食物中的 OTA 与一种致命的地方性肾脏疾病（ balkanendemicnephropathy）有关，且有致癌、致畸 作用，近年来引起了人类营养学家的重视。正常条件下，小麦和玉米受 OTA 污染
2、的机率较小，约 1% 5%，其含量为0.01 5mg/kg；大麦和燕麦被污染的机率较高，约为 10%，其含量一般在 0.1mg/kg 以下，个别样品高达 27mg/kg。 赭曲霉毒素包括 3 种类型，毒性强弱顺序是： OTAOTCOTB。 OTB是 OTA 的脱氯衍生物，OTC 是 OTA 的乙基酯， OTB 和 OTC 的含量一般较低，毒性较 OTA小。因此，饲料检测时可以主要分析 OTA 含量。 目前，小麦、大麦、玉米等谷类作物中 OTA 的测定方法有薄层色谱法（ TLC）、 酶联免疫吸附法（ ELISA）、气相色谱法（ GC）、高效液相色谱法（ HPLC）、高效液相色谱 -质谱法（ HP
3、LC-MS）。 TLC 法繁琐费时，且灵敏度、特异性较差，提取过程中所需有机溶剂品种多且量大，易污染环境，对人体有较大危害。 ELISA 法测定结果受试剂盒差异、实验温度、仪器灵敏度等条件影响较大。 GC、 GC-MS、 HPLC和 HPLC-MS 法普遍存在着样品前处理过程复杂，灵敏度易受样品的净化、浓缩等步骤的影响，耗时，检测设备昂贵，并要求有专业的技术人员及较长的分析周期。同时，这些检测方法无一例外要求在检测过程中使 用毒素标准溶液，给环境和检测人员的安全造成风险。本标准项目是通过化学合成法制备赭曲霉毒素 A 人工抗原，利用此抗原免疫实验动物制备赭曲霉毒素 A 单克隆抗体，基于此原料基础
4、上开发赭曲霉毒素 A 快速检测试纸条，再通过胶体金读数仪进行大米、玉米、小麦等样品中赭曲霉毒素的定量分析。定量分析便于将检测结果与国家限量对比，有助于监管部门根据粮食的污染水平2 进行粮食分级管理，同时有助于企业内部更好地进行质量控制。本标准可提高粮食样品检测、监测效率，降低成本，保护环境，保障从业人员健康安全。 （二）背景 据联合国粮农组织（ FAO）统 计，全世界每年谷物产量的 25%受到真菌毒素不同程度的污染。随着饲料工业的快速发展，近年来，中国的饲料也受到霉菌污染的严重挑战。自 2006年以来，玉米等饲料原料价格普遍上涨，致使很多饲料企业及养殖户使用低质饲料原料，加上近年来气候的变化，
5、华北、东北地区降雨量增加，进一步加重了饲料原料中真菌毒素的污染。而由于饲料原料和配合饲料中多种真菌毒素同时存在，在食用油等产品及牛奶中真菌毒素污染也比较严重。在世界许多地方，目前真菌毒素已构成重要的食品安全问题。 真菌毒素对人类和动物健康可产生严重的影响，这一认识导致了许多国 家在近几十年来制定了诸多有关食品和饲料中真菌毒素的法规，以保护人类的健康，并保障生产者和贸易商的经济利益。随着全球经济一体化的进程，类似真菌毒素等涉及安全卫生项目的限量标准，越来越多地被利用为贸易保护主义中非关税壁垒的重要手段。因此，为了保证食品安全，保障消费者的健康，为了打破国外的技术壁垒，同时在合理有利的前提下，更多
6、地树立我国的技术性壁垒，开展饲料中真菌毒素的检测并建立标准方法是有效的方法之一。目前国内应用标准检测方法大多为仪器方法，所需仪器设备昂贵，不利于进行广泛推广，并且限制了很多检测单位高效、广泛 地开展检测工作。建立符合中国国情的快速检测方法标准，具有检测快速、简便、灵敏、成本低等优点，为打开市场并占领市场提供了先决条件。 （三）限量标准、检测方法及研究现状 1、限量标准 世界各国均对食品中赭曲霉毒素 A 的含量做出了严格的规定。欧盟关于赭曲霉毒素 A的限量标准分类最为详细，未加 5 工谷物为 g/kg，由未加工的谷物制备的所有产品，包括加工的谷物制品及直接供人食用的食物为 3.0 g/kg，供婴
7、幼儿食用的谷类加工食品和婴儿食品为 0.5 g/kg。我国对食品中赭曲霉毒素 A 的限量标准（ GB 2761-2011） 是：谷物及其制品 5 g/kg；豆类及其制品 5 g/kg。我国对饲料中赭曲霉毒素 A 的限量标准（ GB13078.2-2006）是：配合饲料和玉米 100 g/kg。 表 1 我国饲料中的赭曲霉毒素 A 限量标准 3 产品名称 限量 /( g/kg) 谷物及其加工产品 100 配合饲料 100 2、检测方法及研究现状 真菌毒素的检测方法主要有两种，一是将色谱技术作为基础的物理化学检测方法，包括高效液相色谱法（ HPLC）和气相色谱法（ GC）等，而薄层层析法（ TLC
8、）由于操作过程太复杂，国际上近些年使用这种方法检 测真菌毒素的情况越来越少；二是免疫化学检测法，主要指免疫亲和柱法（ IAC）以及酶联免疫吸附法（ ELISA）等。 GC 可同时检测多种真菌毒素且检测限较低，但仍存在标准曲线线性关系不理想、测定时需要进行衍生化、上一次进样待测物品滞留、重复进样变异系数大使得重现性较差等一系列问题。 HPLC 法虽可精确进行定性定量测定，但是样品前处理较为繁琐、仪器昂贵而成本高，同时需要专门的技术操作人员，因而一般用于大型企业、科研院校和专业检测机构的定量分析。 ELISA 检测黄曲霉毒素，样品前处理步骤简单且可实现定量化，但这种生物学方 法，受环境因素影响大，
9、所用抗体和酶特别容易发生变质，如今市场上的同一物质试剂盒检测结果差异性较大，稳定性还有待提高。 相比较而言，胶体金免疫层析法无需大型仪器、所需辅助试剂少、交叉反应率低、试纸条易于保存且可单份测定，避免了分析步骤繁琐、成本高等缺点，而且因其检测更快速、操作更简单，测试人员无需进行专业培训，所以更适合食品安全快速检测行业的快速检验和基层检测，尤其是野外和偏远地区人员现场应用此项技术十分方便。 （四）制定标准的必要性和意义 1、提高农产品质量的需要 赭曲霉毒素 A 是由产毒真菌产生的代谢物，广泛 存在于粮油食品和饲料中。这些产毒真菌分布于各级食物链，即使是在现今拥有先进的农业技术和食品加工工艺的条件
10、下，在作物种植、收获、储藏和加工过程中，仍然无法避免和防止产毒真菌的危害。随着我国经济快速发展，人民群众物质文化生活水平不断提高，对食品安全的关注进一步提高，迫切需要相应的检测技术，鉴于传统检测方法的专业性要求高和成本昂贵的缺点，赭曲霉毒素 A 快速检测技术的研究及制订相应的检测方法标准是非常必要的。 4 2、实现以人为本，保证广大群众生命健康的需要 赭曲霉毒素 A是曲霉菌属和青霉菌属的某些种产生的二级代谢产物，包 括赭曲霉毒素 A、赭曲霉毒素 B、赭曲霉毒素 C、赭曲霉毒素 D 四种结构类似的化合物，其中分布最广、产毒量最高、毒性最大、对农作物的污染最重、与人类健康关系最密切的是赭曲霉毒素
11、A，普遍存在于饲料、谷物及动物体内，可以导致动物的免疫抑制、肾萎缩、胎儿畸形、流产及死亡，并具有高度的致癌、致畸、致突变的作用，国际癌症研究机构将其定为 2B 类致癌物。 3、适应市场经济和加入 WTO 新形势的需要 我国已经加入 WTO，我国农产品已面临国际和国内两个市场，为我国农产品（劳动密集型）进入国际市场提供了很好的机遇，但国际上十分重视农产品 的安全问题，而农产品易于被真菌污染，可能存在赭曲霉毒素 A 等真菌毒素残留问题，这已成为影响出口创汇的最大制约因素。由于毒素残留超标，引起外国拒收，退货、扣留、索赔、撤消合同等事件经常发生，给我国农产品生产者造成很大损失，并影响了我国农产品的形
12、象。为了从源头保证农产品质量，提高我国农产品的竞争力，研究赭曲霉毒素 A 快速检测技术并制订相应的检测方法标准是非常必要的。 二、标准制定过程 饲料原料中赭曲霉毒素 A 的快速筛查 胶体金免疫层析法标准由江西省兽药饲料监察所、中检环贸生物技术（北京）有限公司 、双胞胎（集团）股份有限公司、江西正邦科技股份有限公司负责起草编写。根据国家有关标准制定和修订工作的要求，标准起草单位在饲料原料中赭曲霉毒素 A 的快速筛查 胶体金免疫层析法的起草编制过程中，主要工作包括以下几个方面： （ 1）详细查阅了国内、国外有关标准和相关专业期刊上发表过的参考文献等技术资料，并对这些资料进行了详细的对比，从方法的先
13、进性、可靠性和实用性等几个方面考虑，选取了几个代表性的参考资料作为标准起草中的主要技术参考文本。 （ 2）及时购置相关的实验仪器、试剂、标准品和其他材料，建立了胶体金免疫层析法的反应体系，摸索不同条件对方法进行最优化，最终确定了最佳的检测方法。 （ 3）开展多种饲料原料胶体金快速检测方法的试验，包括小麦、大米、黄豆、玉米、豆粕、花生粕、 DDGS，这是方法的重要步骤和关键环节。不同样品用同一种方法进行试验和5 验证，确保本检测方法能够灵敏、特异、准确地检测出饲料原料中 OTA 的含量。如：方法的灵敏度，选取多份阴性样品平行测定，以均值加 3 倍标准差的方法确认检测限符合要求；方法的准确率，通过
14、对经验证的阳性样品进行检测，得到本检测方法的标准偏差及变异系数，确保本方法的检测结果可靠；原料中 OTA 残 留。方法的批间稳定性，选取多份确证浓度的阳性样品进行不同批次的平行测定，计算批间变异系数，确保 OTA 毒素测定的批间稳定性。 （ 4）在技术指标完成试验工作之后，严格按照标准的格式，起草编写标准文本内容和编制说明内容。 三、标准制定依据 本标准是根据 GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写、 GB/T 20001.4-2015标准编写规则 第 4 部分：试验方法标准的要求而进行编写的。有关技术内容是在参考国外有关标准及文献的基础上经研究、改进和验证后
15、制定的。 四、标准技术内容和技术 指标的论证 （一）技术原理 本方法应用了竞争疫层析原理。使用一个能够特异性识别某一分子或某分子家族的抗体和配对的抗原，将抗体标记胶体金颗粒，将配对的抗体喷涂到反应膜上做检测线。检测过程中，如果样品中含有待检测物质，则待检测物质首先与胶体金颗粒标记的抗体结合形成复合物，之后沿反应膜向吸水纸方向流动，到达检测线时，因为待检测分子表面的表面决定簇大部分已经被抗体占据，少量与检测线处的抗原结合，形成比较浅的色带，待检测物质 -胶体金颗粒标记的抗体结合形成复合物继续沿反应膜流动，到达质控线后被质控线处的胶体金颗粒抗体所 捕获，形成清晰可见的色带。 反应完成后，使用读数仪
16、读取检测区域和质控区域的颜色强度信号，根据内置标准曲线计算出样品中 OTA 毒素的含量。 （二）适用范围 本标准规定了胶体金法测定饲料原料样品中赭曲霉毒素 A 的条件和详细分析步骤。 本方法适用于小麦、大米和玉米等谷物中赭曲霉毒素 A 毒素快速定量筛查的测定，检测限为 2 g/kg。 （三） 关于样品制备的要求 6 理论上讲样品颗粒的大小与样品的均匀性以及毒素的提取效率有关，当样品细度不足20 目时，真菌毒素的提取效率较低，因此国家标准方法中真菌毒素检测的制样一般都要求制备至少 500g，全部通过 20 目筛，本行业标准直接采用，从测试数据看，能够满足方法需求。 （四）方法精密度及准确度 采用
17、 5g/kg、 10g/kg 和 20 g/kg 三个浓度水平的阳性样品，每个浓度水平测定 10次，重复测定的变异系数在 4%-13%之间 ，平均变异系数为 8.34%，结果见表 2。 表 2 饲料样品中赭曲霉毒素 A 检测数据分析表（浓度： g/kg） 编号 测定结果 参考浓度（ g/kg） 5 10 20 1 5 11 22 2 6 10 23 3 5 10 21 4 6 11 20 5 4 12 22 6 6 10 20 7 5 11 22 8 6 10 21 9 5 12 22 10 5 11 23 平均结果（ g/kg） 5.30 10.80 21.60 标准偏差 0.67 0.79
18、 1.07 变异系数（ %） 12.73 7.30 4.98 （五）检测限 取 20 份阴性样品平行测定，结果均值加 3 倍标准差为 1.71，本方法的检出限为 2g/kg，阴性样品结果见表 3。 表 3 阴性饲料样品赭曲霉毒素 A 测定结果分析表（浓度： g/kg） 样品编号 测定结果 1 1 2 0 3 0 7 4 1 5 0 6 0 7 1 8 0 9 0 10 0 11 0 12 1 13 0 14 0 15 1 16 0 17 1 18 0 19 0 20 0 平均结果（ g/kg） 0.3 标准偏差 0.47 检测限（ g/kg） 1.71 （六）批间稳定性 采用 5 g/kg 左
19、右浓度水平的阳性样品，不得低于 6 个批次，每个批次测定不低于 2次，批内测定取平均值，通过批间变异系数来表达，变异系数应 25%。经多批次平行测定，次方法符合变异系数 要求，批间稳定性良好，结果见表 4。 表 4 饲料样品赭曲霉毒素 A 批间稳定性测定数据分析表（浓度： g/kg） 批次号 测定结果（ g/kg） 批次内平均值（ g/kg） 参考浓度（ g/kg） 批次间平均值（ g/kg） 标准偏差 变异系数 （ %） 1 4 4.5 5 5.17 0.76 14.57 5 2 5 4.5 4 3 5 5.5 6 4 6 6 6 5 5 4.5 4 6 6 6 6 8 （七） HPLC 和
20、胶体金定量检测条结果比对 随机抽取小麦、大米、黄豆、玉米、豆粕、花生粕、 DDGS样品，用本方法和仪器方法分别进行检测。仪器方法参考 GB/T 30955-2014饲料中赭曲霉毒素 A、 B2、 G1、 G2的测定 免疫亲和柱净化 -高效液相色谱，对赭曲霉毒素 A的检测限为 0.2 g/kg，定量限为 1.0 g/kg。本方法的检测限为 10 g/kg。结果见表 5。 表 5 仪器比对测定结果 样品编号 样品类型 HPLC 检测结果（ g/kg） 胶体金定量检测条结果 （ g/kg） 1 小麦 5.87 7 2 0.05 0 3 1.24 2 4 玉米 3.24 5 5 1.11 1 6 10
21、.35 12 7 黄豆 7.89 10 8 3.44 5 9 10.87 12 10 豆粕 56.78 61 11 42.35 45 12 64.27 65 13 花生粕 33.27 35 14 51.44 55 15 72.38 80 16 DDGS 105.67 110 17 89.51 92 18 120.66 123 五、结论 本方法的定量下 限为 2g/kg，具有较高的精密度、准确性和批间稳定性；通过简单的样品前处理， 测试 条点样、孵育器孵育、读数仪读数这几个步骤， 15min 之内就能完成一个样品的测定，方法要求条件低，操作简单。实验结果表明，均能满足饲料原辅料中赭曲霉毒素 A 毒素测定的要求，易于推广应用。
