1、1,第十二章核素示踪原理及实验设计,第一节、核素示踪原理,2,一、核素示踪原理及应用（ Tracer Experiments ),1.核素示踪法: 利用核素作为示踪剂（tracer)而建立起来的一种微量研究方法，用于观察物质动态变化。,3,要点：一般示踪实验均采用核素极其标记物作示踪剂，所以一般认为的示踪实验是指核素示踪实验,观察对象：元素、 化合物、细胞、寄生虫,加上标记：Labeling,引入到待研究系统（整体、离体细胞、无细胞系统）,观察该标记物的去向（部位、数量、时相）,了解被标记物的运动转化规律：吸收、分布、排泄、转运、代谢,4,原理：两个基本点,核素（放射性与稳定核素）极其标记物虽
2、与自然界存在的相对应的同位素和化合物的物理性质不同，却具有相同的化学性质和生物特性。进入机体后,在机体内所发生的化学变化或生物学过程与被示踪的物质相同。,放射性核素衰变射线-测出稳定性核素-质量不同-质量分析器-检出,5,3. 应用及意义：,核素示踪广泛用于基础医学、临床医学、生物学、法医学、药物学和计划生育等等各方面。,6,4.示踪法的特点,核素作为标记的特点：示踪工作对标记基本要求为：制成的标记物必须与被示踪对象有相同的生物学行为-代表性+本身的特征-易检测到标记,化学基团荧光基团酶分子,有各自的特点与用途,但对于示踪实验来说（体内）-会对原分子造成较大的分子结构上的变化-导致结论的不可靠
3、,7,可选用核素进行示踪实验，特点：,灵敏度高-10-14-10-18g水平，（化学： 10-12水平，对微量物质的定量分析有特殊价值。测量方便-衰变不受外力影响，不受杂质干扰，不用提纯待测物-可直接测量。合于生理条件-示踪物剂量可以是生理水平，不干扰破坏机体的生理平衡。可以定位- 器官、细胞、亚细胞水平。,8,稳定核素示踪的特点,无辐射危害不衰变、不分解无化学毒对标记原子的位置及结构可以定位及分析缺点：操作人员的培训、仪器的昂贵、同位素效应。,9,二、示踪剂tracer,是一些有特殊标记的、很容易被测定的核素及其化合物。分为：放射性和稳定核素标记物,10,三、示踪研究的基本类型,物理示踪：所
4、用的放射性标记物不是作为体内某一特定物质的示踪物，而是追踪物，不参与化学反应与代谢-研究其重量及物理变化。,化学示踪：用于追踪某种物质在体内或培养体系内的复杂的生物学、化学行为。示踪标记物：可以是待测物、也可以是待测物的前体物，结构与生物学特性相同或相近。,11,第二节、示踪实验设计,基本程序- 实验的准备阶段 - 正式实验阶段 - 实验总结阶段 - 实验的善后处理阶段,12,实验的准备阶段,对使用的示踪剂、研究对象、探测仪器、实验用具、收集、实验场所、安全防护等条件进行准备-通过预实验检察和完善这些条件-甚至冷实验来掌握与熟悉实验过程，并完善实验设计。为实验成功的基础。,13,正式实验阶段,
5、是实验研究计划与设计实施、完成的阶段-按具体的实验计划进行-作好记录-步骤、结果、意外。,14,实验总结阶段,按照设计的要求认真检查与归纳原始的资料，使其系统化、条理化-清除、减少由于整理数据引入的误差-统计-结论。,15,实验的善后处理阶段,示踪实验不同于一般实验，尤其是放射性示踪实验，产生的各种放射性废物必须妥善处理，要严格按照放射性废物处理的国家规定来执行，严防事故发生。,16,2.示踪实验设计的基本要求,放射性示踪实验的 基本要求稳定性核素示踪实验的 基本要求,17,放射性示踪实验的 基本要求,A.放射性核素的选择：实验要求+核素性质基本原则 辐射类型：衰变核素、-和 半衰期：适当的半
6、衰期，长要满足实验过程短要便于处理要考虑生物半衰期 1/Te=1/Tp+1/Tb如果Tp 与Tb 相差20倍以上时， Te约为其中的较短的半衰期,18,B.放射性核素标记的位置研究物质转运规律-去向-标记原子要牢固，位置不要求。研究某个基团的变化代谢时-标记于特定的基团上。,19,C.示踪剂的要求有足够的放射性核素纯度98%放射化学纯度95%放射性比活度高、无载体,20,D.示踪剂剂量的选择,标记物的放射性比活度放射性核素的 半衰期标记物在被观察系统中被稀释的程度标记物在被观察系统内的利用率标记物在被观察系统内分布、排泄特点实验周期、仪器的探测效率示踪剂的化学毒性（安全剂量）要求：稀释后，样品
7、的脉冲计数率5倍本底 B小动物7.418.5KBq(0.20.5uCi) 可达370KBq（10uCi）离体37KBq（1uCi）,21,例,主要观察组织中标记物的分配约为输入总量的1%，要观察10天，估计在此期间标记物从该组织消失量为最初的90%，取组织为该组织的10%，测量上可知最小可测的放射性=500 DPM，估算所需剂量。,22,10%组织：500DPM*100/10=500090%消失：5000/10%=50000（开始事该组织的总放射性）1%的分配量：50000/1%=5000000 DPM=2.25uCi=83.5KBq,23,F.示踪剂给予途径：口、腹腔、皮下、肌注、静脉滴注、
8、静脉一次性推注G.样品的采集与制备：代表性、污染的防止H.测量方法的选择： NaI 晶体闪烁计数器，32P-G-M管，3H和14C-液闪和核乳胶.,24,稳定核素实验的基本要求,核素选择：2H，13C，15N，18O示踪剂量：剂量大，可达化学剂量丰度：较高的丰度的示踪物,25,二、示踪实验的实验方法,离体实验；从整体分离出来的简单系统：细胞株，无细胞酶系统，短期培养的细胞悬液，切片、器官灌注。用途：揭示物质转化规律，精细的结构与神经递质的释放及摄取的关系，是物质代谢、受体配体研究的首选。,整体实验：将示踪物引入完整的机体内，从体外观察或定期取标本观察标本的去向，以了解物质在体内的运动转化规律。
9、用途：研究物质 的吸收、分布、转运和排泄等或对某些器官的功能研究。能反映机体的实际生理情况作离体实验验证。,26,优点：1.系统简单，示踪物极其转化物浓度不会遇到转运排泄等复杂因素的影响，对结果的分析比较单纯，灵敏度也高。2.实验条件可以人为加以控制，便于进行各种精细的分析性研究缺点：实验条件与整体差别大，得出的结论不一定反映实际情况，要用整体实验验证。,优点：能反映机体的实际生理情况作离体实验验证。缺点：不精细,27,离体实验,恒量标记实验：在实验中加入过量的示踪剂，实际示踪剂消耗量小，在整个实验中，示踪剂浓度变化小。不须考虑示踪剂的浓度变化。DNA合成,脉冲标记实验只允许被研究系统与示踪剂
10、接触短暂时间，随后将示踪剂除去，再继续观察。常用于细胞的 增殖动力学研究，活性肽的代谢研究。,28,整体实验的给药途径,如研究吸收途径，则选择不同途径给予示踪物。一般采用静脉注射（小动物可腹腔注射）又分为一次性快速推注和恒速滴注。,29,静脉注射方式分一次性快速注射和恒速滴注两种。示踪剂的浓度在血液和组织或代谢物中都呈现出时相变化（图121，图122），这是机体内复杂代谢过程综合影响的结果；血液中示踪物的浓度不仅取决于它的吸收，也取决于它在体内的代谢转化和排泄。,图12-1 静脉一次性快速注射放射性示踪剂在血液（）、组织（）、代谢物（）中的时相变化,图12-2 静脉恒速滴注放射性示踪剂在血液（
11、）、组织（）、代 谢物（）中的时相变化,30,整体实验特点,整体实验的结果是一个综合性的结果血浆中示踪物浓度取决于：代谢转化、排泄、体内的反馈组织中的示踪物的浓度取决于组织摄取、代谢和释放的速度，血中示踪物浓度。研究代谢转化速度时，必须同时考虑标记前身物和标记物的比活度，前者对后者有直接的影响。,31,三、示踪实验资料的整理与分析,一般而言，须在确保标记物起到真正的示踪作用，量具与探测仪器精度高，严格控制各种变异因素和测量数据可靠的前提下，才能对示踪实验资料进行统计分析处理。注意：两个计数率的显著性检验 可疑值的舍取 误差传递,32,四、数据表示方法的选择,整个脏器的总放射性活度放射性含量dp
12、m/mg or ml组织或体液比活度dpm/mmol or mg化合物相对比活度：两个解剖部位中同一化合物比活度的比值，两种化合物（前身与产物）的比活度的比值（或丰度）。,33,第三节、双标记示踪实验,原理与用途用同种或不同种的核素标记同种分子不同部位或不同种分子进行示踪实验，追踪不同的标记原子得到所需的信息。,34,含示踪物A的标本中加入示踪物B，活度为DB,匀浆、提取、制样,双标记测量，测得活度DA和DB,标本中示踪物A的活度DA=DA/回收率（%）,回收率（%）=DB/DB,35,用途：在物质代谢中的应用广泛,研究分子内两部分的代谢规律研究同种分子处于不同形态时的运动转化规律（在同一动物
13、个体或试管中进行使 各种动物个体差异减至最小）。不同物质运动转化规律的比较观察,36,双标记示踪实验的设计,标记化合物：一般不要单分子内双标记化合物，而要两种单标记物混和作双标记物的示踪剂，成对的核素有：3H-14C，3H、14C-32P， 32P45Ca,3H、14C、32P-125I，24Na36Cl,55Fe59Fe,125I131I，放射性-稳定同位素一般要求：能量可以区分开,37,示踪剂剂量的配比,两种标记放射性核素发出的能量不同按照两种放射性核素各自的探测效率不同和在体内消失的速度估算所需用量要预实验验证,38,双标记测量,液体闪烁测量-能阈的不同双标记不同的半衰期核素射线种类不同
14、稳定核素,39,第四节、同位素效应Isotope effect,概念：由于同位素质量的不同而引起的物质反应速度的变化称为同位素效应.一般1H、2H、3H同位素效应强，质量差别大。,40,同位素效应的类型,初级同位素效应primary isotope effect：同位素所在断裂而产生的效应，严重。次级同位素效应secondary isotope effect: 同位素所在部位的邻近化学键发生断裂。溶液同位素效应：溶液中某种原子被其同位素取代，引起反应速度下降。H2OD2O,41,生物体系中的同位素效应,整体和离体中均存在同位素效应20-30%D2O养动物-病理变化30-35% D2O养动物-死亡酶的反应速度下降同位素效应在药物设计中用途极大。,
