1、Enzyme,第 三 章 酶enzyme,酶的概念,目前将生物催化剂分为两类酶 、 核酶（脱氧核酶）,酶是一类由活细胞产生的，对其特异底物具有高效催化作用的蛋白质。,酶学研究简史,公元前两千多年，我国已有酿酒记载。一百余年前，Pasteur认为发酵是酵母细胞生命活动的结果。1877年，Kuhne首次提出Enzyme一词。1897年，Buchner兄弟用不含细胞的酵母提取液，实现了发酵。1926年，Sumner首次从刀豆中提纯出脲酶结晶。1982年，Cech首次发现RNA也具有酶的催化活性，提出核酶(ribozyme)的概念。1995年，Jack W.Szostak研究室首先报道了具有DNA连接
2、酶活性DNA片段，称为脱氧核酶(deoxyribozyme)。,第一节酶的分子结构与功能The Molecular Structure and Function of Enzyme,酶的分类：,单体酶(monomeric enzyme)： 由单条肽链构成,仅具有三级结构的酶。寡聚酶(oligomeric enzyme)： 由多个相同或不同亚基以非共价键连接组成的酶。多酶体系（multienzyme system)： 由几种不同功能的酶彼此聚合形成的多酶复合物。多功能酶或串联酶 (multifunctional enzyme or tandem enzyme)： 一些多酶体系在进化过程中由于基因
3、的融合,(multienzyme system)： 由几种不同功能的酶彼此聚合形成的多酶复合物。,多酶体系,一些多酶体系在进化过程中由于基因的融合，多种不同催化功能存在于一条多肽链中，这类酶称为多功能酶。由单肽链构成的，含有若干个酶活性的结构域,多功能酶或串联酶(multifunctional or tandem enzyme)：,一、 酶的分子组成,单纯酶 (simple enzyme)结合酶 (conjugated enzyme),*各部分在催化反应中的作用,酶蛋白决定反应的特异性辅助因子决定反应的种类与性质,金属酶(metalloenzyme)金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丢失。
4、金属激活酶(metal-activated enzyme) 金属离子为酶的活性所必需，但与酶的结合不甚紧密。,金属离子的作用稳定酶的构象； 参与催化反应，传递电子；在酶与底物间起桥梁作用；中和阴离子，降低反应中的静电斥力等。,小分子有机化合物的作用在反应中起运载体的作用，传递电子、质子或其它基团。,小分子有机化合物在催化中的作用,辅助因子分类（按其与酶蛋白结合的紧密程度）,辅酶 (coenzyme):与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去。,辅基 (prosthetic group):与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超滤的方法除去。,辅酶的作用1参与基团的转移:氨基-磷酸吡哆醛(Vit B6
5、)羧基-生物素(biotin)、维生素K一碳单位-四氢叶酸(folic acid)甲基-维生素B12酰基-辅酶A、硫辛酸,辅酶的作用 2质子（氢原子 ）转移:FAD+ FADH2NAD+ NADH + H+NADP+ NADPH + H+,酶的活性中心,二、酶的活性中心,必需基团(essential group)酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，一些与酶活性密切相关的化学基团。,或称活性部位(active site)，指必需基团在一级结构上可能相距遥远，但在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异结合并将底物转化为产物。,酶的活性中心(active center),活性中
6、心内的必需基团,位于活性中心以外，维持酶活性中心应有的空间构象所必需。,活性中心外的必需基团,酶的活性中心常位于酶蛋白分子表面，为含有较多疏水氨基酸残基，形成疏水性“裂缝”或“口袋”，形成了利于酶促反应发生的疏水环境,第二节酶促反应的特点与机理The Characteristic and Mechanism of Enzyme-Catalyzed Reaction,酶与一般催化剂的共同点在反应前后没有质和量的变化；只能催化热力学允许的化学反应；只能加速可逆反应的进程，而不改变反应的平衡点。,（一）酶促反应具有高效性,一、 酶促反应的特点,酶的催化效率通常比非催化反应高1081020倍，比一般催
7、化剂高1071013倍。酶的催化不需要较高的反应温度。酶和一般催化剂加速反应的机理都是降低反应的活化能(activation energy)。酶比一般催化剂更有效地降低反应的活化能。,反应总能量改变,非催化反应活化能,酶促反应 活化能,一般催化剂催化反应的活化能,能量,反 应 过 程,底物,产物,酶促反应活化能的改变,活化能：底物分子从初态转变到活化态所需的能量。,一种酶仅作用于一种或一类化合物，或一定的化学键，催化一定的化学反应并生成一定的产物。酶的这种特性称为酶的特异性或专一性。,* 酶的特异性(specificity),（二）酶促反应具有高度的特异性,分类：,绝对特异性(absolute
8、 specificity)：只能作用于特定结构的底物，进行一种专一的反应，生成一种特定结构的产物 。 相对特异性(relative specificity)：作用于一类化合物或一种化学键。立体结构特异性(stereo specificity)：作用于立体异构体中的一种。旋光异构特异性几何异构特异性,立体异构特异性,旋光异构特异性：例如 ： L-乳酸脱氢酶 丙酮酸 L-乳酸 D-乳酸脱氢酶 丙酮酸 D-乳酸,酵母中的酶D-型葡萄糖 发酵 酵母中的酶L-型葡萄糖 发酵 L-精氨酸酶L-精氨酸 L-鸟氨酸 + 尿素D-精氨酸,立体异构特异性,几何异构特异性 延胡索酸酶 反丁烯二酸 苹果酸 延胡索酸酶
9、 顺丁烯二酸,（三）酶促反应的可调节性,对酶生成与降解量的调节酶催化效力的调节通过改变底物浓度对酶进行调节等,酶促反应受多种因素的调控，以适应机体对不断变化的内外环境和生命活动的需要。其中包括三方面的调节。,二、酶促反应的机理,（一）酶-底物复合物的形成与诱导契合假说,*诱导契合假说(induced-fit hypothesis),酶底物复合物,酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，进而相互结合。这一过程称为酶-底物结合的诱导契合假说 。,（三）与酶的高效率催化有关的机制：,1.邻近效应与定向排列 2.多元催化：酸碱催化 3.表面效应：防止底物与酶之间形成水化膜,1.趋近效应
10、和定向效应,底物在活性中心聚集，局部微环境浓度 催化基团定向催化反应,接受质子：碱 提供质子：酸 酶活性中心的某些基团可作为质子的供体或受体，从而对底物进行酸碱催化 如组氨酸的咪唑基, 解离常数为6.0，在生理pH下酸碱形式均可存在，很活跃 酸碱催化可参与多种反应，如多肽的水解、酯类的水解、磷酸基的转移,2. 多元催化（multielement catalysis）,酶活性中心疏水性“口袋” 防止底物与酶之间形成水化膜 有利底物与酶密切接触,3. 表面效应 (surface effect),第三节 酶促反应动力学Kinetics of Enzyme-Catalyzed Reaction,概念研
11、究各种因素对酶促反应速度的影响，并加以定量的阐述。影响因素包括有酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。, 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。,一、底物浓度对反应速度的影响,单底物、单产物反应酶促反应速度一般在规定的反应条件下，用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示反应速度取其初速度，即底物的消耗量很小（一般在5以内）时的反应速度底物浓度远远大于酶浓度,研究前提,在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速度的影响呈矩形双曲线关系。,当底物浓度较低时,反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。,随着底物浓度的增高,反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。,当底物浓度高达一定
12、程度,反应速度不再增加,达最大速度;反应为零级反应,酶被底物饱和,底物对酶促反应的饱和现象：,（一）米曼氏方程式,中间产物,酶促反应模式中间产物学说,1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米曼氏方程式，简称米氏方程式(Michaelis equation)。,S：底物浓度V：不同S时的反应速度Vmax：最大反应速度(maximum velocity) m：米氏常数(Michaelis constant),当 V= Vmax / 2 时,Km值的推导,KmS,Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。,（二）Km与Vma
13、x的意义,Km值 Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。 意义：a) Km是酶的特征性常数之一； Km 只与酶的性质有关, 与酶的浓度无关b) Km可近似表示酶对底物的亲和力（反比）c) 同一酶对于不同底物有不同的Km值。 确定最合适底物或天然底物,Km最小的底物大多数是此酶的天然底物 如：己糖激酶对葡萄糖的Km 1.5mmol/L 对果糖的Km 28mmol/L 所以葡萄糖为最适底物一种酶对每一种底物都各有一个特定的Km,Vmax定义：Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。,意义：Vmax=K3 E如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算 酶的转换数(turnover
14、 number)，即动力学常数K3。,定义 当酶被底物充分饱和时，单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。意义 可用来比较每单位酶的催化能力。,酶的转换数,（三）m值与max值的测定,1. 双倒数作图法(double reciprocal plot)，又称为 林-贝氏(Lineweaver- Burk)作图法,两边同取倒数,2. Hanes作图法,在林贝氏方程基础上，两边同乘S,S/V=Km/Vmax + S/Vmax,二、酶浓度对反应速度的影响,当SE，酶可被底物饱和的情况下，反应速度与酶浓度成正比。关系式为：V = K3 E,0,V,E,当SE时，Vmax = k3 E,酶浓度对反
15、应速度的影响,双重影响温度升高，酶促反应速度升高；温度升高10oC, 反应速度增加一倍由于酶的本质是蛋白质，温度升高，可引起酶的变性，从而反应速度降低 。,三、温度对反应速度的影响,最适温度 (optimum temperature)：酶促反应速度最快时的环境温度。温血动物：3540Taq DNA聚合酶：7075 可耐受100高温此酶是从水生栖热菌 Thermus Aquaticus（Taq）中分离出的热稳定性DNA聚合酶，用于PCR反应。,低温的作用 :贮存生物制品、菌种等 低温时由于活化分子数目减少，反应速度降低，但温度升高后，酶活性又可恢复。临床上的低温麻醉减少组织细胞的代谢程度，使机体
16、耐受手术时氧和营养物质的缺乏,四、 pH对反应速度的影响,解离状态： 蛋白质的极性基团 辅助因子的荷电状态 底物的解离状态,而不同的解离状态或直接影响酶与底物的结合, 或影响酶的空间结构, 从而改变酶的活力,最适pH (optimum pH)：酶催化活性最大时的环境pH。多数酶：7.0左右胃蛋白酶：1.8肝精氨酸酶：9.8,选择合适的缓冲液保持酶的相对稳定和保持高活性,五、抑制剂对反应速度的影响,酶的抑制剂(inhibitor)凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂。,区别于酶的变性,抑制剂对酶有一定选择性 引起变性的因素对酶没有选择性,抑制作用的类型,不可逆性抑制(ir
17、reversible inhibition),可逆性抑制 (reversible inhibition)：,竞争性抑制 (competitive inhibition)非竞争性抑制 (non-competitive inhibition)反竞争性抑制 (uncompetitive inhibition),(一) 不可逆性抑制作用,* 概念抑制剂通常以共价键与酶活性中心的必需基团相结合，使酶失活。 * 举例有机磷化合物 羟基酶解毒 - - - 解磷定(PAM)重金属离子及砷化合物 巯基酶解毒 - - - 二巯基丙醇(BAL),有机磷化合物,路易士气,失活的酶,羟基酶,失活的酶,酸,巯基酶,失活的
18、酶,酸,BAL,巯基酶,BAL与砷剂结合物,（二） 可逆性抑制作用,* 概念抑制剂通常以非共价键与酶或酶-底物复合物可逆性结合，使酶的活性降低或丧失；抑制剂可用透析、超滤等方法除去。,竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制,* 类型,. 竞争性抑制作用,反应模式,定义抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合物的形成，使酶的活性降低。这种抑制作用称为竞争性抑制作用。,SI：高浓度的底物可解除抑制,特点,无抑制剂, 竞争性I往往是酶的底物结构类似物； 抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结合部位相同 酶的活性中心 抑制作用可以被高浓度的底物减低以致消除； (表观）Km值增大，V
19、m值不变,* 举例,丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶,磺胺类药物的抑菌机制与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶,人体细胞的叶酸由食物获得，不受磺胺类药物的抑制,2. 非竞争性抑制,* 反应模式,I与酶的活性中心外的位点结合,非竞争性抑制的特点： 非竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的分子结构类似； 抑制剂与酶的活性中心外的位点结合； 抑制剂对酶与底物的结合无影响，故底物浓度的改变对抑制程度无影响； 抑制程度取决于抑制剂的浓度 动力学参数：Km值不变，Vm值降低。,. 反竞争性抑制,* 反应模式,抑制剂不能与游离酶结合，但可与ES复合物结合,反竞争性抑制的特点： 反竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的
20、分子结构类似； 抑制剂与底物可同时与酶的不同部位结合； 必须有底物存在，抑制剂才能对酶产生抑制作用；抑制程度随底物浓度的增加而增加； 抑制程度取决与抑制剂的浓度及底物的浓度 动力学参数：Km减小，Vm降低。,各种可逆性抑制作用的比较,动力学参数,表观,Km,K,m,增大,不变,减小,最大速度,V,max,不变,降低,降低,林,-,贝氏作图,斜率,K,m,/,V,max,增大,增大,不变,纵轴截距,1/V,max,不变,增大,增大,横轴截距,-,1/K,m,增大,不变,减小,与,I,结合的组分,E,E,、,ES,ES,作用特征,无抑制剂,竞争性抑制,非竞争性抑制,反竞争性抑制,六、激活剂对反应速
21、度的影响,激活剂(activator):使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质。 必需激活剂 (essential activator) 非必需激活剂 (non-essential activator),七、酶活性测定和酶活性单位,酶的活性是指酶催化化学反应的能力，其衡量的标准是酶促反应速度。,酶促反应速度可在适宜的反应条件下，用单位时间内底物的消耗或产物的生成量来表示。,酶的活性单位是衡量酶活力大小的尺度，它反映在规定条件下，酶促反应在单位时间（s、min或h）内生成一定量（mg、g、mol等）的产物或消耗一定数量的底物所需的酶量。,国际单位(IU)在特定的条件下，每分钟催化1mol底物
22、转化为产物所需的酶量为一个国际单位。,催量单位(katal)催量(kat)是指在特定条件下，每秒钟使mol底物转化为产物所需的酶量。,kat与IU的换算： 1 IU=16.6710-9 kat,第 四 节 酶 的 调 节The Regulation of Enzyme,调节对象 关键酶,一 、酶活性的调节,（一）酶原与酶原的激活,酶原 (zymogen)有些酶在细胞内合成或初分泌时只是酶的无活性前体，此前体物质称为酶原。,酶原的激活在一定条件下，酶原向有活性酶转化的过程。,酶原激活的机理,胰蛋白酶原的激活过程,酶原激活的生理意义,消化道内的蛋白酶原：避免细胞的自身消化，使酶在特定的部位和环境中
23、发挥作用，保证体内代谢正常进行。凝血系统和纤维蛋白溶解酶：有的酶原可以视为酶的储存形式。在需要时，酶原适时地转变成有活性的酶，发挥其催化作用。,（二）变构酶,变构效应剂 (allosteric effector),变构调节 (allosteric regulation),变构酶 (allosteric enzyme),变构部位 (allosteric site),一些代谢物可与某些酶分子活性中心外的某部分可逆地结合，使酶构象改变，从而改变酶的催化活性，此种调节方式称变构调节。,变构酶常为多个亚基构成的寡聚体，具有协同效应,变构激活,变构抑制,变构酶的形曲线,无变构效应剂,变构调节的方式：,变构
24、酶通常为代谢途径的起始关键酶，而变构剂则为代谢途径的终产物。因此，变构剂一般以反馈方式对代谢途径的起始关键酶进行调节，最常见的为负反馈调节。,变构调节的特点：, 酶活性的改变通过酶分子构象的改变而实现； 酶的变构仅涉及非共价键的变化； 调节酶活性的因素为代谢物； 为一非耗能过程； 无放大效应。,（三） 酶的共价修饰调节,共价修饰(covalent modification)在其他酶的催化作用下，某些酶蛋白肽链上的一些基团可与某种化学基团发生可逆的共价结合，从而改变酶的活性，此过程称为共价修饰。,常见类型磷酸化与脱磷酸化（最常见）乙酰化和脱乙酰化甲基化和脱甲基化腺苷化和脱腺苷化SH与SS互变,酶
25、的磷酸化与脱磷酸化,引起酶分子在有活性形式与无活性形式或者高活性与低活性之间进行相互转变,共价修饰调节的特点：, 酶以两种不同修饰和不同活性的形式存在； 有共价键的变化； 一般为耗能过程 受其他调节因素（如激素）的影响 存在放大效应,二、 酶含量的调节,（一）酶蛋白合成的诱导和阻遏诱导作用(induction)：诱导物使酶合成增加的过程阻遏作用(repression)：阻遏物使酶合成减少的过程（二）酶降解的调控,降解：使酶的半寿期发生改变 酶的降解就是蛋白质和氨基酸分解代谢的过程,酶的诱导和阻遏、降解,基因 调节基因的产物，封闭基因 诱导物： 使封闭物失效 阻遏物：增加封闭物活性 转录mRNA
26、 翻译蛋白质,三、 同工酶,* 定义同工酶(isoenzyme)是指催化相同的化学反应，而酶蛋白的分子结构理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。,国际生化学会：由不同基因或者等位基因编码的多肽链由同一基因编码，生成不同的mRNA翻译而来的不包括翻译水平修饰所形成的多分子形式同工酶：通常存在于同一种属或者同一个体的不同组织或者细胞的不同亚细胞结构中,*生理及临床意义在代谢调节上起着重要的作用；用于解释发育过程中阶段特有的代谢特征；同工酶谱的改变有助于对疾病的诊断；同工酶可以作为遗传标志，用于遗传分析研究。,* 举例：乳酸脱氢酶(LDH1 LDH5),心肌梗死和肝病病人血清LDH同工酶谱的变化,1,
27、酶活性,心肌梗死酶谱,正常酶谱,肝病酶谱,2,3,4,5,第五节 酶的命名与分类The Naming and Classification of Enzyme,一、酶的命名1. 习惯命名法推荐名称2. 系统命名法系统名称,一些酶的命名举例,二、酶的分类1.氧化还原酶类(oxidoreductases)2.转移酶类 (transferases )3.水解酶类 (hydrolases)4.裂解酶类 (lyases)5.异构酶类( isomerases)6.合成酶类 (ligases, synthetases),系统命名法： EC:1. 4. 1. 3 EC - enzyme commission
28、1. - 类 （氧化还原酶类） 4. - 亚类 1. - 亚-亚类 3. - 亚-亚类中的排序,第六节酶与医学的关系The Relation of Enzyme and Medicine,（一） 酶与疾病的发生（二） 酶与疾病的诊断（三） 酶与疾病的治疗,一、酶与疾病的关系,二、酶在医学上的其他应用,（一）酶作为试剂用于临床检验和科学研究,1酶法分析 即酶偶联测定法(enzyme coupled assays)，是利用酶作为分析试剂，对一些酶的活性、底物浓度、激活剂、抑制剂等进行定量分析的一种方法。,最简单的酶偶联反应模式：,A B C,Ex,Ei,2酶标记测定法 酶可以代替同位素与某些物质相
29、结合，从而使该物质被酶所标记。通过测定酶的活性来判断被标记物质或与其定量结合的物质的存在和含量。,酶联免疫测定法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),3工具酶 除上述酶偶联测定法外，人们利用酶具有高度特异性的特点，将酶做为工具，在分子水平上对某些生物大分子进行定向的分割与连接。,（二）酶作为药物用于临床治疗,（三）酶的分子工程,1固定化酶 (immobilized enzyme),将水溶性酶经物理或化学方法处理后，成为不溶于水但仍具有酶活性的一种酶的衍生物。 固定化酶在催化反应中以固相状态作用于底物，并保持酶的活性。,2抗体酶,抗原抗体 底物酶 以底物的过渡态类似物为抗原，制备抗体，则这种抗体与底物的结合，可能会引起催化反应，这种具有催化功能的抗体分子称为抗体酶(abzyme),3模拟酶,模拟酶是根据酶的作用原理，利用有机化学合成方法，人工合成的具有底物结合部位和催化部位的非蛋白质有机化合物。,
