1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 重金属类化合物的联合毒性研究 所在学院 专业班级 生物工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 摘要 : 本文主要研究各种重金属对明亮发光菌 T3的单一及联合毒性。测定了 Co、 Cu、 Ba、Ni 这四种重金属对发光菌的单 一毒性，在测定重金属单一毒性的基础上，分别测定了二元重金属复合体系对发光菌的联合毒性，并采用毒性单位法和指数相加法对联合毒性进行了评价。 关键词 : 重金属；明亮发光菌 T3；单一毒性；联合毒性。 II The study of joint toxicity for heavy metal compounds
2、 Abstract: This paper mainly studies single and joint toxicity of all sorts of heavy metal to photobacterium phosphoreum T3. Measure the single toxicity of four heavy metal Cu, Ba, Co, Ni to photobacterium phosphoreum T3, and on the basis of the results, measure the joint toxicity of two kinds of he
3、avy metal to Photobacterium phosphoreum T3. Using toxic unit method and index addition method to evaluate joint toxicity. Keywords: heavy metal; photobacterium phosphoreum T3; single toxicity; joint toxicity 目 录 摘要 . I ABSTRACT . II 1 绪论 . 1 1.1 选题背景及意义 . 1 1.2 EC50 的概念 . 2 1.3 相关研究的最新成果及动 态 . 3 1.3
4、.1 单一毒性研究 . 3 1.3.2 联合毒性研究 . 4 1.4 研究的技术方法难点 . 6 1.4.1 课题研究 内容 . 6 1.4.3 难点 . 6 1.4.4 研究目的 . 6 1.5 研究的创新点 . 6 2 实验部分 . 7 2.1 试剂与仪器 . 7 2.2 实验方法 . 8 2.2.1 发光菌的培养 . 8 2.2.2 毒性测定 . 8 2.3 计算方法 . 9 2.4 实验流程 . 10 3 结果与分析 . 12 3.1 单一毒性的测定 . 12 3.2 联合毒性测定 . 12 3.3 小结 . 15 4 结论 . 16 参考文献 . 17 致 谢 . 错误 !未定义书签
5、。 1 1 绪论 1.1 选题背景及意义 随着现代工农业生产的不断发展，大量有毒有害的有机化学品和重金属的使用，它们同时或先后进入环境，通过各种物理运输途径直接或间接进入水体，并在水体中共存，对水环境构成了复合污染。这此污染物严重地威胁着生态环境和人体健康，其中农药类就是最常见的环境污染物之一。其中，酚类化合物在染料、炸药、农药等生产中具有重要的地位，是重要的化工原料或中间体，而且其作为原生质毒物，属于高毒性物质，对一切生物个体都有毒害作用。酚的 毒性直接影响对水的饮用和水产养殖，还可以强烈地抑制水体其它生物如细菌、海藻和软体动物等的自然生长速度，有时甚至会使它们停止生长，对人体更具有潜在的致
6、癌性。因此酚类化合物对环境的污染一直被人们所关注。 长期以来，我们对毒理学的研究对象大多是单一化学品或重金属，而对多种化合物或重金属共同作用引起的复合污染研究较少。然而实际表明，仅用单一化学品的毒性效应来评价是不够的，因为在多数情况下，两种或多种化学物质共同作用于生物体时，会引起与各物质单独作用时完全不同的毒性效应，即毒理学中所称的联合作用。因此，研究两种或多种 化学物质的联合毒性效应能为环境标准的制定和生态风险评价提供更科学、更可靠的依据，更具实际及应用的意义。其中，重金属污染具有范围广，持续时间长，不易在生物物质循环和能量交换中分解，可在环境中长期存在，只会发生形态和价态变化，并能沿食物链
7、转移等特点，在毒理学的研究中具有重要意义。 重金属污染与其他有机化合物的污染不同。不少有机化合物可以通过自然界本身物理的、化学的或生物的净化，使有害性降低或解除。而重金属具有富集性，很难在环境中降解。目前我国由于在重金属的开采、冶炼、加工过程中，造成不少重金属如铅、汞、镉、钴等 进入大气、水、土壤，引起严重的 环境污染 。如随废水排出的重金属，即使浓度小，也可在藻类和底泥中积累，被鱼和贝类体表吸附，产生食物链浓缩，从而造成公害。 水体 中金属有利或有害不仅取决于金属的种类、理化性质，而且还取决于金属的浓度及存在的价态和形态，即使有益的金属元素浓度超过某一数值也会有剧烈的 毒性 ，使动植物 中毒
8、 ，甚至死亡。 金属有机化合物 (如有机汞、有机铅、有机砷、有机锡等 )比相应的金属有机化合物毒性要强得多；可溶态的金属又比颗粒态金属的毒性要大；六价铬比三价铬毒性要大等等。 重金属在人体内能和 蛋白质 及各种酶发生强烈的相互作用，使它们失去活性，也可能在人体的某些 器官 中富集，如果超过人体所能耐受的限度，会造成人体 急性中毒 、亚急性中毒、慢性中毒等，2 对人体会造成很大的危害，例如，日本发生的水俣病 (汞污染 )和骨痛病 (镉污染 )等 公害病 ，都是由重金属污染引起的。 重金属在大气、水体、土壤、生物体中广泛分布，而底泥往往是重金属的储存库和最后的归宿。当环境变化时，底泥中的重金属形态
9、将发生转化并释放造成污染。重金属不能被 生物降解 ，但具有生物累积 性，可以直接威胁高等 生物包括 人类，有关专家指出，重金属对土壤的污染具有不可逆转性，已受污染土壤没有治理价值，只能调整种植品种来加以回避。因此，底泥重金属污染问题日益受到人们的重视。 重金属污染目前已相当严重，其对环境和生物的危害极大，同时，其易通过食物链而富集，因此，已经引起了世界各国科学家的高度重视，解决这个问题已迫在眉睫。 目前，细菌、藻类、浮游生 物、植物、昆虫和鱼类等多种生物体的试验被用于环境毒性的评定。在这些方法中，发光菌毒性试验因其方便、灵敏、高效而被广泛应用。而且化合物对发光菌的毒性与对其它生物的毒性数据有一
10、定的相关性。因此，该方法对有毒化学品的筛选和评价具有重要意义，也为研究化合物对其它生物的毒性提供了基础数据。 1.2 EC50的概念 半数效应浓度 (EC50)： 指 引起受试对象 50%个体产生一种特定效应的药物剂量。 目前，毒性实验中采用的指示生物主要是水生生物，常见的有线虫、发光菌 (Photobacterium phosphoreum)、大 型蚤 (Daphnia magna)、藻类 (如绿藻 )和大型藻、鱼类 (如链鱼、草鱼、青鱼、金鱼、鲤鱼、呆条鱼和黄姑鱼等 )、蝌蚪、幼虾和夏吸虫等， 也包括土壤动物如蚯蚓。 发光菌法是以发光菌作指示生物的毒性测试方法，其发光强度的变化与毒物浓度呈
11、线性相关 1，可以在较短时间内进行大量化合物的毒性测定。该法具有灵敏、快速、简便和费用低等优点而倍受青睐，在有毒物质的筛选和环境污染生物学评价等方面具有重要意义。采用发光菌法测定水生生物毒性的技术已比较成熟，有关这方面的研究有较多成功的例子 2, 3。 该法具有灵敏、快速、 简便和费用低等优点而倍受青睐，在有毒物质的筛选和环境污染生物学评价等方面具有重要意义。采用发光菌法测定水生生物毒性的技术已比较成熟，有关这方面的研究有较多成功的例子。 Faust等 4,5人首先用 18种具有相似模式的三嗪类化合物进行了对藻类的联合毒性分析 ,接着用 16种具有相异作用模式的生物灭杀剂对藻类进行联合毒性分析
12、 。 3 1.3 相关研究的最新成果及动态 1.3.1 单一毒性研究 重金属单一毒性研究开始的较早，其研究方法比较成熟，也得到了很多的成果。 近年来，杨帆、邹容 6在室内常温静水条件下，采用氯化镉、 硫酸铜、硝酸亚汞 3 种重金属盐类对瓦氏黄颡鱼进行了毒性试验。试验结果表明， 3 种药物的毒性强弱依次为：硝酸亚汞 硫酸铜 氯化镉。宋玉芳等 7在土壤重金属污染对蚯蚓的急性毒性效应研究中，测定了在草甸棕壤条件下，Cu、 Zn、 Pb、 Cd 单一污染对蚯蚓的急性致死及亚致死效应。结果表明， Cu、 Pb 浓度与蚯蚓死亡率显著相关， Cu 浓度与生长抑制率显著相关，其他供试重金属浓度与蚯蚓死亡率和生
13、长抑制率相关性不显著。谭凤霞等 8在研究重金属对稀有绚鲫的毒性作用中发现，稀有绚鲫细胞系 RMF 胞对 4 种重金属毒性的敏感性均表现出随着传 代代数的增大而下降的趋势，但 20 代之内未发现显著性差异(P0.05)。 李伟强等 9测定了 Hg2+、 Cd2+、 Cu2+、 Pb2+单一重金属胁迫对拟南芥种子发芽和幼苗生长的影响。结果表明，重金属对幼苗生长的毒性大于对种子发芽的毒性，以抑制种子发芽的 IC50 为指标， 4 种重金属的毒性顺序为 Hg2+Cd2+Pb2+Cu2+ ，以幼苗生长为指标，则毒性顺序为：Cu2+Hg2+Cd2+Pb2+，并随着胁迫时间延长种子萌发率下降。此外，不同重金
14、属在不同发芽时段对种子的毒性也不尽相同， Cd2+的毒性在种子吸水 后的 0 12 h 大于 12 24 h，而 Hg2+毒性在 12 24 h大于 0 12 h，其中，种皮对减轻重金属毒性起着十分重要的作用。王胜强等 10用泥鳅进行长期暴露试验来评价河流底泥重金属的毒性，实验结果表明，底泥重金属的污染程度增加，死亡率增加，血红细胞变异程度加大。 李娟英等 11采用发光细菌毒性、活性污泥脱氢酶毒性、硝化抑制毒性 3 种方法测定 Hg、 Cd、Zn、 Pb 这 4 种重金属对活性污泥微生物的毒性。结果表明，发光细菌毒性测定方法的灵敏度最高，测得的重金属半数有效浓度 (EC50)最低， 4 种重金
15、属对发光细 菌发光强度的抑制程度由大到小顺序依次为 HgCdZnPb；活性污泥脱氢酶毒性和硝化抑制毒性的测定结果与发光细菌毒性测定结果相比，灵敏度相对较低，测得的活性污泥脱氢酶活性的抑制程度由大到小顺序依次为 CdHgZnPb。为了更准确的判定重金属对活性污泥微生物的毒性影响，至少应取不同的重金属毒性终点指示指标做一组毒性实验，而不能以发光细菌毒性测定结果作为唯一的判定依据，这可能会过分夸大重金属对污水处理工艺的冲击能力，导致污水处理成本无谓增加。 杨丽华等 12采用静水法生物测试研究了铜、锌、镉和铬对丰产鲫 幼鱼的急性毒性，结果表明，铜对鲫鱼为剧毒物质，镉为中毒物质，锌和铬为低毒物质， 4
16、种重金属毒性大小顺序依次为4 CuCdZnCr。铜对鲫鱼的安全质量浓度略低于渔业水域水质标准，锌、镉和铬的安全质量浓度远远高于标准。张才学等 13研究了铜、锌、镉、铅离子对壶状臂尾轮虫的急性毒性影响，实验结果表明，其对壶状臂尾轮虫的急性毒性的大小顺序为 Cu2+Zn2+Cd2+Pb2+。许章程 14研究了 Hg2+、 Cu2+、Zn2+、 Cd2+4 种重金属对海洋单胞藻钙质角毛藻的毒性效应，结果表明，不同重金属对单胞藻的毒 性效应有所不同，其毒性为 Hg2+Cu2+Zn2+Cd2+。 1.3.2 联合毒性研究 早在上世纪 70 年代末期，人们就意识到混合物的联合污染问题。研究表明，混合物中，
17、即使化合物的浓度水平较低 (0.02LC50)，它们的毒效也是很大的 15。因此，化学混合物的水质标准受到关注，环境工作者相继展开多方面的联合毒性研究，并按照不同的划分方法，对各组物质的联合作用进行分类及评价。 （ 1）不同化合物间联合作用表征和联合效应研究。由于重金属的结构相对简单，因此在重金属之间的联合作用 16-17方面的研究相对兴 起较早，得到的结论也较多、较成熟。在同系列有机物间的联合毒性 18方面，由于同系列化合物的结构相似，它们对生物体的单一作用机制也相近，所以，不论反应型还是非反应型毒物，只要其作用机制相同，联合毒性往往是相加或是拮抗。而在不同有机物之间的联合作用 19-20方
18、面，由于有机化合物的种类较繁多、差异较大，因此，涉及到不同类别有机物的联合毒性效应往往是很复杂的。 （ 2）不同化合物联合毒作用机理方面的研究。这部分研究相对比较困难，进展缓慢，但是经过多年的不懈努力，环境工作者利用各种技术手段还是取得了不小的成果。其 中，重金属联合作用机理的探讨是比较成熟的。研究者发现：毒物对生物的毒性一方面取决于受试生物的敏感性，另一方面也取决于该毒物的浓度及其生物可利用性；金属化合物的阴离子不同，其生物可利用性也有差异，因此导致相同的重金属离子对同一受试生物的毒性也可能有差异。大部分的常规联合毒性分类只是提出化合物的潜在毒性，最终的毒性分级还要结合生物降解和生物蓄积性。
19、这一点是在以往的研究工作中并未涉及、在以后工作中需注意的。 （ 3）联合毒性研究进展。余江、杨宇峰 21从生理生化特性及抗氧化防御等方面，研究龙须菜对镉 (Cd)和邻甲 酸二甲酯 (DMP)联合作用 (以下用 Cd DMP 表示 )的胁迫响应。结果显示，龙须菜生长受 Cd DMP联合质量浓度和暴露时间的影响。当 Cd 和 DMP质量浓度分别小于 1.5 mg L和 O.2 mg L 时，叶绿素 (Chl.a)、藻红素 (PE)及可溶性蛋白的质量分数与对照组比较无显著性差异 (P0.05)，硝酸还 (NR)、过氧化物酶 (POD)及过氧化氢酶 (CAT)活性短时间内以诱导为主；当 Cd 和 DM
20、P 质量浓别超过 1 5 mg L 和 O 2 mg L，尤其是 Cd 和 DMP 的质量浓度分别大于 3 0 mg L 和 O 4 mg5 L 时 ， Chl.a 和 PE 质量分数随 Cd DMP 质量浓度的升高和暴露时间的延长呈明显下降趋势(P0.001)，而 MDA 呈明升趋势， NR、 POD 和 CAT 活性受到显著抑制，龙须菜生长受到明显抑制，藻体表现出发黄发白等表状。王志铮等 22以彩虹明樱蛤养殖壳高优势组 (平均壳高为 17.35 1.01mm)为实验动物进行 4 种重金属离子 Hg2+、 Cr6+、 Cu2+、 Zn2+对彩虹明樱蛤的加和等毒性强度联合毒性试验，结果表明这些
21、离子两两组合在加和等毒性强度下对彩虹明樱蛤 96h 联合急性毒性所呈现的致毒特征与离子间毒性强度匹配情形 密切相关。 邹佩贞等 23在水温 24 26条件下，采用半静止式生物毒性实验法，分析 Cu2+、 Cd2+、 Pb2+、Zn2+对光倒刺鲃胚胎发育的联合毒性效应。结果表明，在各种不同浓度的重金属离子溶液实验组中胚胎的孵化率均较低，与对照组差异极显著 (P0.01)；各种重金属在胚胎发育过程中引起各种畸形；Cu2+与 Cd2+对光倒刺钯胚胎的联合毒性为拮抗作用。陈桂葵等 24以静水生物测试法研究了氯酸钾和重金属砷、镉对蝌蚪的联合毒性，试验结果表明， KClO3 与 Cd2+、 KCl03 与
22、 As3+共存时的联合毒性为协同作 用，而 Cd2+与 As3+的联合毒性表现为拮抗作用。王莹等 25水螅为实验生物，采用相加指数法研究了铅、镉和锌 3 种重全属离子复合污染物的联合毒性，结果表明，铅和锌共存时的联合毒性为拮抗作用，而镉和锌，镉和铅共存时主要表现为毒性剧增的协同作用。铅、镉和锌三者共存时的联合毒性较为复杂，三者浓度比 1： 1： 1 时表现为协同作用，而毒性比 1： 1： 1 时表现曲拮抗作用。 江敏等 26研究了 Cu、 Zn、 Cr、 Cd 四种重金属离于对罗氏沼虾仔虾的联合毒性作用，结果表明，Cu2+和 Zn2+、 Zn2+和 Cd2+对罗氏错虾仔虾的联合 作用表现为拮抗
23、， Cu2+和 Cd2+、 Cu2+和 Cr6+、 Zn2+和 Cr( )则为协同作用。欧小兵等 27研究了重金属铜 (Cu2+)、镉 (Cd2+)对水螅的联合毒性作用，探索水螅对两者混合的毒性效应。结果表明，水螅对两种重金属的毒性反应既快速又敏感，等毒性配比的两种重金属混合液对水螅的毒性大于单一毒性，为协同作用。汤保华等 28研究了五溴联苯醚 (Penta BDE)与重金属镉 (Cd)、铜 (Cu)对水生甲壳类动物大型蚤 Daphnia magna 的 48 h 存活以及 21d 繁殖的联合毒性影响，结果表明在联合毒性中 ， Cu 和 Cd 的毒性作用大于 Pe BDE。张青田和胡桂坤 29
24、研究了 Hg2+、 Pb2+、 Cu2+、 Mn2+和 Cd2+5 种重金属离子对俄罗斯卤虫的毒性效应。结果表明， Pb2+和 Cu2+表现出协同作用， Hg2+与 Cd2+、 Cu2+和 Cd2+、 Hg2+和 Cu2+表现出拮抗作用，同时 Pb2+和 Mn2+也存在交互作用。 邓铁柱等 30研究了乙草胺与 Cu， Zn(以毒性单位配比为 l： 1， 1： 4 和 4： 1 以及 l： 1： 1 构成的二元或三元混合体系 )对发光菌和斑马鱼胚胎的联合毒性，结果表明，同种物质混合毒性配比不同时，对生物的联 合毒性作用不完全相同；不同的混合体系对发光苗和斑马鱼胚胎表现出不同的联合毒性效应，乙草胺与重金属对发光苗的联合毒性主要以拈抗为主，对斑马鱼胚胎的联合毒性则主要以协同为主，说明受试生物不同，其对化合物的敏感性不同。王丽平等 31在实验室条件下研究了多环芳
