1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 灵菌红素合成酶基因的克隆 所在学院 专业班级 生物工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 摘要 : 灵菌红素 (prodigiosins， PG)是一些放线菌、沙雷氏菌及其它细菌产生的具有重要生物活性的次级代谢产物 。 本研究通过 PCR 扩增、 T-A 克隆测序分析 Serratia jx.1 的功能基因 pigC，与 GenBank 中其它物种相应基因核苷酸序列、氨基酸序列进行了比对分析，取得了一系列有价值的研究成果： pigC 基因全序列长为 2641b，与来源于 Serratia marcescens 274 菌株中 p
2、igC 基因，在核苷酸水平上同源性高达 98.9%，但氨基酸水平上的同源性达 92.1%， 并且建 立了 该蛋白系统进化树 。 另外，将扩增的目的基因与 pUCm-T 载体连接重组转入 E.coli Top10 中， 得到了稳定表达 。 关键词 : 灵 菌红素；沙雷氏菌； PigC 基因 ； PCR 扩增；进化树 II Abstract: Prodigiosin is produced by a number of Actinomycetes,Serratia and other bacteria as secondary metabolites with important biologic
3、al activities.The PigC gene from Serratia was cloned by the PCR method and T-A method.Then PigC gene was sequenced and analyzed,and blastned with the other species in the GenBank at the nucleoside acid and amino acid levels.The following results are achieved:the lenghth of the PigC gene in Serratia
4、jx.1 was 2641bp.The comparison of these fragment sequences with those of others through blastn of GeneBank,the results indicated that the homology rate of nucleoside acid arrays of the pigC with Serratia marcescens 274 are 98.9 ,while the homology rate of AA arrays are 92.1 .And the phylogenetic evo
5、lution tree is constructed. In addition , the PigC gene was inserted between the BamH1和 Hind III.It was confirmed that the PigC gene from Serratia was integrated into the chromosomal DNA of T. reesei by the PCR test. Keywords: prodigiosins; Serratia; PigC; PCR; phylogenetic tree 目 录 摘要 : .I Abstract
6、. . II 1 绪论 . 1 1.1 灵菌红素的基本性质 . 1 1.2 选题的背景及意义 . 错误 !未定义书签。 2 方法与材料 . 3 2.1 实验材料 . 3 2.1.2 主要仪器与试剂 . 3 2.1.3 培养基 . 3 2.2 实验 方法 . 3 2.2.1 培养 . 错误 !未定义书签。 2.2.2 DNA 的提取 . 3 2.2.3 PigC 基因的克隆 . 5 2.2.4 大肠杆菌感受态的制备 . 5 2.2.5 目的基因与 T-载体的连接 . 6 2.2.6 重组质粒的转化 . 6 2.2.7 转化子的蓝白筛选 . 6 2.2.8 转化子的 PCR 验证 . 6 2.2.
7、9 PigC 基因的测序 . 7 3 结果与分析 . 8 3.1 粘质沙雷氏菌株 DNA 的提取 . 8 3.2 PigC 基因的克隆 PigC 基因的扩增及序列分析 . 8 3.3 大肠杆菌感受态的制备 . 10 3.4 转化子的蓝白筛选 . 错误 !未定义书签。 3.5 转化子的 PCR 验证 . 错误 !未定义书签。 3.6 PigC 基因的测序 . 错误 !未定义书签。 3.7 系统进化树的建立 . 13 3.8 讨论 . 14 4 结论 . 15 参考文献 . 错误 !未定义书签。 致 谢 . 错误 !未定义书签。 1 1 绪论 1.1 灵菌红素的基本性质 灵菌红素（ prodigi
8、osins,PG)又名灵菌素、灵杆菌素，分子式为 C20H25N30 (M=323.1968)，是一类天然红色素的总称，通常都有 3 个吡咯环组成的甲氧基吡咯骨架结构， 1929 年由 Amak 等研究 Serratia 生长时发现，包括 prodigiosin ， prodigiosin25-C ， metacycloprodigiosi （ nMP ）desmethoxyprodigiosin 和 uncedylprodigiosin（ UP）等，是由一些放线菌、沙雷氏菌及其它细菌产生的次级代谢产物 1,2，灵菌红素通常呈暗红色，具有绿色反光，熔点 151-152 。在碱性或中性溶液中呈橙
9、黄色，酸性溶液中呈红色。在甲醇溶液中，酸性条件下在 540 nm 处有特征吸收，碱性条件下在 466 nm 处有特征吸收。其为脂溶性色素，易溶于甲醇，氯仿，苯和丙酮，不溶于水。在极性较强的酸性和碱性水溶液中微溶，在极性较弱的有机溶剂如乙醚或石油醚中微溶或不溶。灵菌红素对温度稳定，但受 pH 的影响较大，酸性环境中能保持较长的时间，碱性条件下则损失较大 3。 Al3+， Ca2+， K+， Ba2+ 等金属离子对灵菌红素的稳定性影响不大， Zn2+有使灵菌红素增色的作用， Mg2+和 Mn2+ 对灵菌红素有一定的破坏作用， Pb2+可以络合灵菌红素，使之成为沉淀 4。白光和蓝光使灵菌红素发生光解
10、，在红光和远红光下灵菌红素则不会降解 5。 灵菌红素具有多种生物学活性，如自身免疫抑制 :可用来抑制迟发型超敏反性和器官移植后的宿主排斥反应；抗多种肿瘤，癌细胞等；并具有抗细菌，抗疟疾，抗真菌和抗原生动物等活性。 灵菌红素化学结构式如图 1 所示。 图 1 灵菌红素化学结构式 1.2 选题的背景及意义 灵菌红素 ( Prodigiosins)是可是一类含有 3 个吡咯环组成的甲氧基吡咯骨架结构的化合物，由沙雷氏菌、放线菌及多种海洋细菌（包括 Hahella chejuensis KCTC2396 和假单胞菌）产生的一种天然色素 6，其中以 Serratia 属微生物生物合成灵菌红素的报道居多。
11、 灵菌红素具有多种生物学活性， 如 抗细菌、抗真菌、抗疟疾、抗原生动物、 抗癌 7、 免疫抑制活性 8,9和快速杀死导致赤潮 的大部分浮游生物 10 等重要生物活性 ,因此它在医药、环境治理、 食品添加剂、纺织染2 料 11和农业病虫害防治 12 等方面具有广阔的应用前景和巨大的研发价值。目前已有通过化学合成灵菌红素的报道，但由于化学合成工艺的复杂性等多种因素的限制，至今尚未能进行大规模的生产，灵菌红素这一具有极高应用价值的活性成分各方面的研究及应用都受到极大的限制。另一方面研究发现沙雷氏菌的发酵成本较高以及灵菌红素本身对其生产菌株具有反馈抑制作用，导致灵菌红素的发酵产量不高。为了提高灵菌红素
12、缩合酶的活力并能工业化生产，我 们将从基因克隆表达方面进行研究，将 PigC 基因在大肠杆菌、酵母中进行表达，以利于构建高产灵菌红素的生产菌株。 20世纪 80年代以来，人们开始从基因水平研究 PG的生物合成途径及其调节， 1983年 Feitelson等 13克隆了天蓝色链霉菌与 PG 合成相关的基因簇， Thomason 等 14则首次将分离得到的 Serratia PG 生物合成基因转入欧文氏菌（ Erwinla carotovora）质粒，成功表达并得到了 PG。 1-二羟吡咯 -5-羧酸还原酶催化合成脯氨酸的最后一步，该酶由 proC 基因编码。对链霉菌来说 ，脯氨酸是合成灵菌红素的
13、前驱物质。 Barona-Gmez 等 15研究发现多拷贝 proC 基因可使链霉菌A3(2) 产生灵菌红素，但是删除该基因却不会引起脯氨酸缺陷型的突变。 streptorubin B (cyclic)和十一烷基灵菌红素的合成在动力学上有着一定地联系。 Jeffery T. Davis16研究发现灵菌红素具有可作为单质子配体与阴离子结合，包括 Cl-和 HCO3-。它可以穿过磷脂双分子层，具有很强跨膜阴离子载体功能，可成为 HCl 的协同转运体 随着生物操作技术的发展和对 PG 的深入研究，人们将 更加清晰地认识 PG 的产生和作用机制，大量生产制备 PG，用于替代在癌症及免疫治疗中对人体有害
14、作用的化学药物，造福于人类。 本实验主要是将编码灵菌红素的基因进行体外扩增，并测定其序列 ，建立其系统进化树 。为其构建产灵菌红素工程菌，进而工业化生产奠定基础。 3 2 方法与材料 2.1 实验材料 2.1.1 菌株和质粒 大肠杆菌 ( Escherichia coli Top10) 、黏质沙雷氏菌 ( Serratia jx.1)为本实验室保存菌种。 质粒 pET29a 来源于本实验室。 质粒 PUC-T 载体购买 自生工生物（上海）有限公司。 2.1.2 主要仪器与试剂 HD-930 组合式全温度震荡培养箱 （大仓市博莱特实验仪器厂）； VS-15000CFN II 型小型高速离心机（
15、上海民仪电子有限公司 ）； VS-1300 型洁净工作台（苏州时速为净化设备有限公司）； PHS-3C 型精密 pH 计（上海安亨昌吉 149 号雷磁仪器厂）； AL-204 型电子天平（梅特勒 -托利多仪器上海有限公司）； DSX-280A 型不锈钢手提式灭菌器（上海申安医疗器械厂）； LRH-250A 型生化培养箱 (广东省医疗器械厂）。 扩增仪（ eppendorf 公司） Tanon 电泳仪（上海天龙科技有限公司） LG2020 凝胶成像系统（上海新仪微波化学科技有限公司） 本实验所用的乙醇、氯仿、异戊醇、 Tris、硼酸等均为分析纯； PN5247 蛋白胨、牛肉浸膏、酵母粉、琼脂粉等
16、均为生化试剂。 2.1.3 培养基 17 发酵培养基 (g/L)：蛋白胨 13.0, 酵母粉 20.0, NaCl 5.0,， pH 自然 。 LB 培养基 (g/L)： 酵母粉 5.0，蛋白胨 10.0， NaCl 10.0， pH 7.0。 用于平板培养时补加琼脂 20。 2.2 实验 方法 2.2.1 培养： 活化后的 目的 菌 株 接种于 50ml 发酵 培养基中， 37 摇床（ 200rpm）培养过液。 2.2.2 DNA 的提取 方法一 18： （ 1） 取 1ml 培养物于 1.5ml EP 管中，室温 5000rpm 离心 2min， 再次离心， 重悬 菌体 于0.5ml TE
17、 中。 4 （ 2） 加入 50l 20mg/ml 的溶菌酶 和 50l 10g/ml RNAase， 混匀，于 37保温 1h。 50l 20mg/ml 的蛋白酶 K 于 37保温 1h。 （ 3） 加等体积的酚 /氯仿 /异戊醇混匀， 10000rpm 离心 5min 将上清转入一 新管中 。 （ 4）加入等体积的 氯仿 /异戊醇 ，混匀， 10000rpm 离心 5min 将上清转入一新管中（注意不要将杂蛋白絮状物吸入） 。 （ 5） 加入 1/5 体积的 3mol/L 醋酸钠（ pH5.2）， 2 倍体积的无水乙醇，旋转离心管， 轻轻旋转小指管，可见珠状絮死，即为染色体丝，用玻璃棒挑出
18、或用吸管小心吸入另一新管中。 （ 6） 沉淀用 70%的乙醇洗涤 2 次，室温下晾干，溶于 0.1ml TE 中 。 方法二： （ 1） 取 1ml 细菌培养液， 5000rpm， 10min，用 TE 缓冲液洗涤后，再离心，菌体重悬于1mlTE 溶液。 （ 2） 加入 50mg/ml 溶菌酶溶液 2l（终浓度 100g/ml）， 37 保温 20-30min。 （ 3） 加入 RNAase(10g/ml)2.5l, 至终浓度为 25g/ml,然后加入 10%SDS 溶液 0.125ml，37 保温 30min。 （ 4） 加入蛋白酶 K（ 20g/ml） 2.5l至终浓度为 50g/ml，
19、37 保温 60-90min。 （ 5） 加入等体积的苯酚 /氯仿 /异戊醇（ 25： 24： 1）混匀， 8000rpm，离心 5min，取上清液转入另一离心管中，此步骤重复 3 次 或 3 次以上 。 （ 6） 上清液中加入 1/5 体积的 3mol/L 醋酸钠（ pH5.2）， 2 倍体积的无水乙醇，旋转离心管，沉淀 DNA， （ 7） 70%乙醇洗涤一次，室温干燥， 后 使其易溶。 （ 8） 加入 0.5mlTE 或 ddH2O 溶解 DNA，确定 DNA 含量和纯度。 方法三 19： （ 1） 取 1ml 培养物于 1.5ml EP 管中，室温 8000rpm 离心 5min，弃上清
20、，沉淀重新悬浮于 1ml TE（ pH8.0）中（用 ddH2O 也行 )。 （ 2） 加入 2mol/L NaCl 50l， 10%SDS 110l， 20mg/ml 的蛋白酶 K 3l， 50 作用 3h 或37 过夜。（此时菌液应为透明粘稠 液体） （ 3） 菌液均分到两个 1.5ml EP 管，加等体积的酚 氯仿 异戊醇 (25 24 1)，混匀，室温放置 5-10min。 12000rpm 离心 10min。抽提两次 或两次以上 。（上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去） 5 （ 4） 加 0.6 倍体积的异丙醇，混匀，室温放置 10min。 1 2000rpm 离心 10mi
21、n。 （ 5） 沉淀用 75%的乙醇洗涤。 （ 6） 抽（凉）干后，溶于 50 mlTE 溶液或 50l ddH2O 中，取 2-5l电泳。作 PCR 模板用 。 2.2.3 PigC 基因的克隆 20 通过核酸数据库的查阅，设计合适的扩增引物 ：根据 GenBank 上已知的粘质沙雷氏菌的基因序列，设计两组引物，引物由上海生工公司合成。以 cDNA 为模板 , 根据已知的 PigC 基因序列设计 两组 PCR 引物。 引物组 1：上游引物 5-1: GGGAATTCGTGGAGGTGGCGGG ; 下游引物 5-3: TAAAGCTTGCCGTGCTGTGTCG。 引物组 2：上游引物 5-
22、2: TGGATCCGAGGTGATGTCATGA; 下游引物 5-3: TAAAGCTTGCCGTGCTGTGTCG。 本实验 PCR 扩增反应体系 设计见 表 1 和表二。 PCR 扩增条件 :94 预变性 5 min， 94 变性1min， 53 退火 45s， 72 延伸 3min， 30 个循环，最后 72 延伸 10min。 扩增体系在实验过程中进一步优化。 表 1 PCR 扩增 PigC 基因 反应体系一 试剂 用量 10xPCR buffer- MgSO4 2.5uL 10x dNTP（ 10mM） 2.5uL 正向引物（ 10mM） 0.5uL 反向引物（ 10mM） 0.5uL DNA 模板 1.0uL pfu 酶 (u/ul) 0.5uL 无菌水 17.5uL
