1、毕业论文 开题报告 生物工程 天然色素生产菌的诱变选育 一、 选题的背景、意义 灵菌红素族 (Prodigiosins,PG)是一个天然红色素家族的总称 , 包括 Prodigiosin , Prodi2giosin 25-C， Metacycloprodigiosin,Uncedylprodigiosin 等 , 可以由多种放线菌和细菌产生。这一族色素通常都具有甲氧基吡咯的骨架结构，具有一定的免疫抑制性质。近年，研究人员的注意力都集中在由沙雷氏菌产生的灵菌红素潜在的临床应用上面。灵菌红素(Prodigiosin)是一种很有 潜力的抗肿瘤药物 , 灵菌红素对人结肠腺癌细胞 DLD-1 与 SW
2、-620 及人胃癌细胞株 HGT-1 的实验均证实其对这些肿瘤细胞有诱导凋亡作用。美国国立癌症研究所 (NSI) 证实灵菌红素在平均 IC50为 2.1 mol/L时对 57种不同的人癌细胞有抗性作用 ,在相同的作用剂量下 , 对正常细胞无任何毒害作用。 20 世纪 60 年代早期， Rapoport 等首先描述了 PG 化学合成的全过程，但比较复杂和困难。 1996 年 DAlessio 等 1提出了新的制备 PG 类似物的方案，先将 C 环和 B 环相连然后再和 A 环结合（以往模拟 生物合成路线是先将 B 环和 A 环相连）即得 PG 前体物质，步骤简单，合成效率明显提高，但不能用来合成
3、天然的十二烷基 PG。 Dairi 等 2利用市售商品4-methoxy-3-Pyrrotin-2-one 经 两 步 反 应 得 到 了 PG 前 体 物 质 4-methoxy-2,2 -bipyrrole-5-carboxatdehyde,然后将不同的吡咯及其派生物与其相连接得到了不同的 PG 类似物。 利用化学合成法大量制备 PG 一直未能实施，人们寄希望于微生物发酵生产。国内外对产 PG 微生物的研究主要集中在陆地微生物沙雷菌上。故非常有必要运用 诱变育种技术筛选出高产灵菌红素的菌株。 二、相关研究的最新成果及动态 王学东 3对野生黏质沙雷菌株进行紫外诱变处理，筛选获得的链霉素抗性菌
4、株摇瓶产量达到 120 mg/L，发酵产量可达 160 mg/L。 Tao 等 4紫外诱变获得了一株沙雷菌株 B6，以葡萄糖为初始碳源，流加甘油为 PG 合成诱导物，所开发的流加发酵工艺不仅可防止菌体过早自溶，而且可部分消除 PG 产物的抑制作用，将 PG 的合成能力提高了 7.8 倍，达 583mg/L。 Wei 等 5， 6以改进 LB 培养基（ MLB，提高胰蛋白胨和酵母膏的浓度并去除 了 NaCl）发酵沙雷菌生产 PG，约比 LB 增产 3 倍，达 152mg/L；在培养基中添加 2%6% 的植物油，如豆油、棕榈油、葵花子油等可促进 PG 的合成，最高达 790mg/L，表明 PG 合
5、成与胞外生物表面活性剂的存在有关。在 YE 培养基中添加含吡咯环的脯氨酸、组氨酸和天冬氨酸可显著促进 UP 的合成。当添加 10g/L 的脯氨酸时，产量可达 2.5g/L。 Cang 等 7从土壤中分离获得一株沙雷菌 S389，以乙醇为唯一碳源， PG 产量最高可达2.95 g/L。 Giri 等 在黏质沙雷菌的培养基中分别添加花生籽粉、芝麻 粉、咖啡粉，均能显著增加 P G 产量，其中以添加花生籽粉最为显著，达 到 38.75 g/L。 三、课题的研究内容及拟采取研究方法（技术路线）、难点及预期达到的目标 研究内容： 1、通过考察致死率和正突变率，确定较好的诱变方法； 2、在诱变方法确定的条
6、件下，优化诱变的具体条件； 3、分别进行多轮的初筛和复筛，选出高产灵菌红素的菌株； 4、对该菌的发酵培养条件进行初步优化。 研究方法： 菌种纯化 :平皿划线法。 制备单细胞悬液 菌种诱变处理 筛选符合目的的菌株 摇瓶培养 灵菌红素产量含量及遗传稳定性测定 研究难点： 诱变选育中比较难的主要是诱变方案的确定及适宜的诱变剂量，同时诱变本身的局限性给实验选育理想的菌株带来了困难。 预习达到的目标： 选育得到高产灵菌红素生产菌株，并能稳定遗传。 四、论文详细工作进度和安排 2010 年 10 月 23 日 -10 月 30 日：查阅文献资料，确定实验方案。 2010 年 11 月 1 日 -12 月
7、18 日： 继续查阅文献资料，同时做好实验的器材药品的准备工作。 2011 年 3 月 19 日 -3 月 24 日： 准备开题答辩。 2011 年 3 月 26 日 -4 月 20 日：确定较 好的诱变方法，并优化诱变方法的具体条件。 进行多轮的初筛和复筛，选出高产灵菌红素的菌株。 2011 年 4 月 20 日 -5 月 19 日： 针对筛选的高产菌株进行发酵条件优化，对实验做出初步的总结与归纳。 2011 年 5 月 20 日 -6 月 5 日： 完成毕业论文及答辩。 五、主要参考文献 1DAlessio R,Rossi A.Short synthesis of undecylprodi
8、giosin,anew route to 2,2-bipyrrolyi-pyrromethene systemsJ.Synlett,1996, 6: 513 514. 2 Dairi K, Tripathy S, Attardo G, et al. Two-step synthesis of the bipyrrole precursor of prodigiosinsJ.Tetranehed Lett, 2006,47: 2605- 2606. 3 王学东 . 灵菌红素发酵与分离过程优化及其诱导癌细胞凋亡作用的研究 D. 华东理工大学博士论文， 2004-12. 4 Tao J, Wang
9、X D, Shen Y L, et al. Strategy for the improvement of prodigiosin production by a serratia marcescens mutant through fed-batch fermentationJ.World J Microbiol Biotechnol, 2005, 21: 969-972. 5 Wei Y H, Yu W J, Chen W C. Enhanced undecylprodigiosin production from serratia marcescens SS-1 by medium fo
10、rmulation and amino-acid supplementationJ.J Biosci Bioeng, 2005, 100(4): 466-471. 6 Wei Y H， Chen W C. Enhanced production of prodigiosin like pigment from Serratia marcescens SM_R by medium improvement and oil-supplementation strategiesJ. J Biosci Bioeng, 2005, 99(6): 616-622. 7 Cang S, Sanada M, Johdo O, et al. High production of prodigiosin by Serratia marcescens grown on ethanol.J. Biotech Lett, 2000, 22: 1761-1765.
