1、毕业论文 开题报告 生物工程 天然红色素抑菌活性研究 一、选题的背景、意义 灵菌红素 ( Prodigiosins)是可是一类 含有 3个吡咯环组成的甲氧基吡咯骨架结构的化合物，由沙雷氏菌、放线菌及多种海洋细菌（包括 Hahella chejuensis KCTC2396 和假单胞菌）产生的一种天然色素 1 Microbiology,Dec2006:887-899.，其中以 Serratia 属微生物生物合成灵菌红素的报道居多。由于具有抗细菌、 抗疟疾、抗真菌、 抗原生动物、 抗癌 2、 免疫抑制活性 3,4 和快速杀死导致赤潮的大部分浮游生物 5 等重要生物活性 ,因此它在医药、 食品添加剂
2、、 环境治理、 纺织染料 6 和农业病虫害防治 7 等方面具有广阔的应用前景和巨大的研发价值。用化学合成法大量制备 PG 一直未能实施，人们寄希望于微生物发酵生产。 随着畜牧业规模化、商业化的发展，兽药及饲料添加剂在畜牧业生产中广泛运用，在促进了养殖业生产发展的同时，也带来很大的负面影响。动物的高密度饲养带来的环境污染，饲料添加剂带给动物产品的体内残留量过高而导致人类疾病的危险性增大，特别是一些要求限制的促生长激素和 有毒物质的添加更引起消费者的恐慌。有些对人的健康产生直接危害，细菌的耐药性给抗生素及其他药品的现代化学疗法带来了极大的困难，还造成环境污染，对动物健康产生危害而影响畜牧业发展 ，
3、因禽兽产品安全问题而影响出口贸易等。开发高效、无残留、无公害的安全饲料添加剂是社会发展的要求和必然结果。近年来，国内外广大学者对安全饲料添加剂的开发和应用进行了大量的研究，相继开发出了大量产品，如酶制剂、微生态制剂、功能性寡糖、酸化剂和中草药制剂等 8,9,10,11,。 （ 1）茶皂素，其作为畜禽饲料添加剂，能明显提高机体的免疫功 能，增强抗病能力；但糖萜素有明显的溶血毒性，不能添加到鱼类饲料和养殖池塘中。 （ 2）微生态制剂，以活体形式在动物消化道中与病原菌进行竞争抑制，增强动物机体的免疫功能，并直接参与胃肠道微生物的平衡，加快达到胃肠道功能的正常化，产品没有抗药性和药物残留。但目前适宜的
4、菌种较少，且较易失活，耐 pH 较差 难以与微生物竞争时处于优势地位 12。 （ 3）酶制剂，酶制剂研究中最为重要的问题是在生产及其处理过程中如何保持酶的稳定性和饲喂 效果。 （ 4）酸化剂，利用几种特定的有机酸和无机酸制成复合酸化剂，能迅速降低 pH 值 ，保持良好的缓冲值和生物性能。 但其只能减少抗生素的使用而不能替代。 （ 5）寡聚糖，促进动物后肠有益菌的增殖，提高动物健康水平的微生态调节剂功能；通过促进有害菌的排泄、免疫佐剂和激活动物特异性免疫等途径，提高其整体免疫功能，防治疾病发生。但寡糖本身成本较高，生产效率较低， 且属于非消化糖类不能添加过量。 （ 6）中草药制剂，从天然植物提取
5、，主要成分有多糖、植物黄酮、植物类黄酮 (多酚类 )、以绿原酸为代表的植物有机酸和寡糖。具多种功能如提高兽类生长速度，免疫活性等无毒副作用，安全性较高 。但目前一些中草药饲料添加 剂在开发应用中还存在产品添加量大、有效成分不明、作用机理不清、作用效果不稳定、剂型单一、缺乏毒理安全方面的研究，原料和产品质量控制标准不完备等问题 13。 二、相关研究的最新进展与动态 随着研究的进展，多种绿色饲料添加剂逐渐丰富并替代以往的抗生素，但是在各方面也还是存在很多问题。而灵菌红素作为无公害天然抗生素，抗病原（微生物或寄生虫）活性强，不干扰肠道正常菌群的微生态平衡，促进畜禽增重以及提高饲料转化率效果显著； 化
6、学性质稳定，不残留或极少残留于畜产品中；细菌或寄生虫不易对其产生耐药性，与其他抗生素不产生 交叉耐药性；毒性低，安全范围大，对人畜无害，无致畸、致癌、致突变等副作用； 对饲料的适口性无不良影响。易于进行工业化生产等优点，是一种现代新型饲料添加剂，具有广阔的发展前景。 在纺织业方面，现如今，随着人们生活水平的提高，人们对安全，健康，绿色的产品需求日益扩大，为了满足社会需求，特别是内衣，汗衫，袜子等生产能够抗菌的纺织物是将来发展的一大趋势 14。天然抗菌剂作为无公害无污染的新型抗菌剂，具有广阔的开发前景。天然抗菌剂来源于植物、动物、昆虫和微生物。如动物类天然抗菌剂壳聚糖，昆虫体内的抗菌蛋白质，微生
7、物 中产生的一些色素等次级代谢产物 【 15】 植物源抗菌剂芦荟，茶叶，石榴皮还有黄芩、姜黄、苏紫、桑葚等既可以用于纺织品的染色 ,又同时兼有的抗菌性 【 16】 。随着人们生态环保意识的加强，应用天然抗菌化合物来生产抗菌纺织品得到进 -步发展，红色素作为微生物产生的天然色素，不仅在纺织工业中可以作为染料，同时也是比较理想的天然抗菌剂，具有稳定性好，安全性高，抑菌能力强，生产方便等特点。其作为一种天然色素，作为染料应用于纺织业的同时，还可以起到不错的抑菌效果，正是符合了纺织业中开发顺应社会需求的纺织品用天然抗菌剂的要求。如果 我们合理科学的将灵菌红素应用于纺织业中现有资源，那么我们在抗菌整理方
8、面则可以向前迈出坚实的一步。 三、课题的研究内容及拟采取的研究方法（技术路线）、难点及预期达到的目标 3.1 研究内容： 本课题所要研究探讨的是红色素作为饲料添加剂其抑菌效果如何，与生产上用的抗生素比较有何优势。及测定灵菌红素对一些常见的细菌真菌的最小抑菌浓度，杀菌浓度。 3.2 采取的研究方法、技术路线： 利用金黄色葡萄球菌，大肠杆菌等作为指示菌，采取倍数稀释法确定其最小抑菌浓度MIC。采用平皿扩散法（纸片抑菌实验），定性确定其抑菌效 果。 3.3 课题的研究难点： 灵菌红素作为应用于畜牧业的一种新型的饲料添加剂，现今国内外对其研究还较少，所能借鉴的经验较少。实验不稳定因素较多。 3.4 实
9、验方案 17-24： 1 材料准备 1 1 样品 灵菌红素（实验室粘质沙雷氏菌产），大蒜素，杆菌肽锌，硫酸抗敌素，噎烯酮 1 2 菌种 大肠杆菌 （ Escherichia coli） 、金黄色葡萄球 （ Staphylococcus aureus）菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、黑曲霉 1 1 3 培养基 LB 培养基， PDA 培养基 1 1 4 试剂 酵母膏、 蛋白胨、琼脂、乙醇、氯化钠、氢氧化钠、盐酸、土豆、葡萄糖、蔗糖 1 1 5 仪器 分液漏斗、真空干燥箱、高压灭菌锅、三角瓶、试管、棉塞、过滤器、针筒、培养皿、恒温控制箱、超净工作台等。 1 2 方法 1 2 1 灵菌红素的制备 1 2
10、2 指示菌菌悬液的制备 牛肉膏蛋白胨培养基适合大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的生长；将供试菌种接种于相应的琼脂平皿固体培养基上。 37 恒温箱中培养 18 24h。用接种环分别挑取单菌落于装 15ml培养基的锥形瓶内。震荡培养 18-24h 作为指示菌待用。 1 2 3 抑菌圈的测定 灵菌红素抑菌 圈的测定采用琼脂平皿扩散滤纸片法。在超净工作台上用无菌吸管吸取0.1ml 菌悬液于相应的营养平板上，用涂布棒将菌液涂布均匀。将已浸过药液（灵菌红素，大蒜素，短菌肽锌，硫酸抗敌素）的干燥药敏滤纸片（直径 5mm）贴在含菌培养皿上，每皿贴每种纸片一片（用乙醇作为对照），每种药液做三次，每种菌做三次重复。将培养
11、皿置于 37 恒温箱中培养 24h，采用十字交叉法测定含药滤纸片的抑菌圈直径大小，取平均值，比较抑菌浓度。 菌落直径 (mm) =测量菌落直径平均值 -5.0 抑制率 (% )=(对照菌落直径 -处理菌落直径 )/处理菌落直 径 100 1 2 4 最小抑菌浓度的测定 用液体二倍稀释法测定各极性段的最小抑菌浓度（ Mininum Inhibitory Concentration MIC）即配置细菌液体培养基按每管 5ml 分装试管，再加入不同量的药液，形成浓度梯度的培养基。接种相同量（ 0.1ml）的指示菌液，于 37 恒温震荡培养箱中培养 24h,另取不加任何药液的培养基做为空白对照。采用微
12、生物比浊法比较各种抗生素抑菌活性，以无菌液的培养基作为空白，测定 OD600 下吸光度。在以培养基中完全没有细菌生长时的最低浓度为MIC。 1 2 5 最小杀 菌浓度的测定 从各段药物的 MIC 和高于 MIC 的试管中吸取 0.1ml 培养物转接于相应的培养基上 37培养 48h，观察菌落的生长情况，无菌落生长的最小浓度即为该药物对该菌株的最小杀菌浓度（ MBC）。 3.5 预期目标 ： 测定灵菌红素对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌等的最小抑菌浓度，杀菌浓度，及对某些真菌抑菌效果。 四、论文进度与安排 2010 年 10 月 23 日 -10 月 30 日：查阅文献资料，确定实验方案。 2010
13、年 11 月 1 日 -12 月 18 日： 继续查阅文献资料，同时做好实验室的器材药品的准备工作。 2011 年 3 月 19 日 -3 月 24 日： 准备开题答辩。 2011 年 3 月 26 日 -4 月 20 日：定性研究灵菌红素抗菌性能。 2011 年 4 月 20 日 -5 月 19 日：定量研究灵菌红素抗菌性能。 2011 年 5 月 20 日 -6 月 5 日： 完成毕业论文及答辩。 五、参考文献 1 Neil R. Williamson,Peter C.Finian J.Leeper P.C.Salmond.The biosynthesis and regulati- on
14、 of bacterial prodigininesJ.Nature Review 2 Williamson N R, Fineran P C, Grist wood T, et al. Anticancer and immunosuppressive prope- rties of bacterial p rodiginines J . FutureMicrobiol, 2007, 2 (6) : 605-618 . 3 Pandey R, Chander R, Sainis K B. Prodigiosins: a novelfamily of immunosupp ressants wi
15、th anti-cancer activity J . Indian J Biochem Biophys, 2007, 44 (5): 295-302 . 4 Alessi o R, Bargi ottiA, CarliniO, et al. Synthesis and immunosupp ressive activity of novel prodigiosin derivatives J . J Med Chem, 2000, 43: 2557- 2565 . 5 Jeong H, Yi m J H, Lee C, et al . Genomic blueprint of Hahella
16、 chejuensis, a marine microbe producing an algicidal agent J . Nucleic Acids Res, 2005, 33 (22) : 7066-7073 . 6 Alihosseini F, Ju K S, Lango J , et al . Antibacterial colorants: characterizati on of p r odigin- ines and their applications on textile materials J . Biotechnol Prog, 2008, 24 ( 3 ) :742
17、-747 . 7 Someya N, Nakaji m M, Watanabe K, et al . I nfluence of bacteria is olated fr om rice plants and rhizos pheres on antibiotic producti on by the antagonistic bacterium Serratia marcescens strain B2 J . J Gen Plant Pathol, 2003, 69:342-347 . 8 杨再 ,陈佳铭等 .天然植物添加剂的研发动态 J.兽药与饲料添加剂 .2006,11(6):12-
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19、抑菌整理技术进展的回顾 J.印染助剂 .2006,23(1):1-7. 15 吴惠英 ,段亚峰 .抗菌技术在纺织工业中的应用 J.针织工业 .2006(5):33-38. 16 周莹 ,王进美 .植物源抗菌剂在纺织工业中的应用及前景 J.现代纺织技术 .2008(6):72-74. 17 干信 ,吴士筠 ,高雯琪 .花椒挥发油抑菌作用研究 J.食品科学 .2009,30(21):128-130. 18 高玉荣 ,贾士儒 ,谭之磊 .新型广谱米酒乳杆菌素对金黄色葡萄球菌的抑菌作用研究 J,中国食品添加剂 .2009,4(2):50-53. 19 王海云 , 周涛 . 香辛料 提取物对肉制品中常见
20、致病菌的抑菌作用 J. 食品科学 .2009,30(21):148-151. 20 林娜 ,尹礼国 ,陈超众 ,魏琴 ,李华兰 .臭牡丹根提取物的抑菌效果研究 J.安徽农业科学 .2009,37(32):15884-15886. 21 汪仁莉 ,张珠明 ,何生虎 .牛心朴子体外抑菌作用的研究 J.安徽农业科学 .2009,37(31)：15233-15235. 22 肖建光 .常维山联合用药对禽源沙门氏菌的体外抑菌试验 J.家禽科学 .2009(11):33-36. 23 孙春龙 ,杜文 ,李洪 庆 .苗药冷水花提取物的抑菌作用 J.山地农业生物学报 .2009,28(5): 468-470. 24 孙桂琳 ,刘小平等 .大蒜生理活性物质对几种植物病原真菌的体外抑菌活性 J.新疆农业科学 .2008,45(6):1012-101.
