1、 1 毕业论文 文献综述 生物工程 水稻愈伤组织的诱导及应用 一 、 前言部分 1.1 关于水稻愈伤组织的简介 水稻是人们重要的食粮之一，由于其基因组小，通过组织培养易获得再生植株等特点而在基因克隆、基因功能验证以及遗传转化等研究方面成为模式植物生长和分裂旺盛的胚性愈伤组织细胞培养是获得转基因植物的最好来源因此，建立一个高效 再生体系是实现基因转化的先决条件 1近年来，研究者先后从水稻各部位诱导出愈伤组织和再生植株虽然，幼穗、幼胚、花粉粒、花药愈伤组织诱导率高，愈伤组织质量好而受到青睐被广泛用于水稻的遗传转化 、品种培育中 2-3但上述材料多受季节限制，取材不便，阻碍了水稻组织培养的进一步发展
2、 1.2 组织培养 所谓的植物组织培养是指在无菌和人工控制的环境条件下，利用适当的培养基对离体的植物器官组织细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株 的技术 4。 其研究的类型主要包括组织培养、器官培养、细胞培养、及原生质体培养。随着研究 T作的深入进展，上述 5个方面的研究理 论和技术体系逐渐得到完善促使植物组织培养的应用范围日益广阔延伸。组织培养作为一种育种技术在水稻等重要粮食作物已广泛应用，并培育出一大批优良品种 ，自 1965年我国开展水稻细胞培养研究后，研究者以水稻幼穗、幼胚、花粉粒和花药为材料进行组织培养研究，取得了较大的进展，尤其是建立起来的水稻胚性悬浮细胞系可作为基闪枪的
3、理想受体，在水稻的遗传转化，品种培育巾具有重要作用。 再如细胞次生代谢物的生产，即通过细胞培养可得到大量合成的植物次生化合物，如生物碱、抗菌剂、利血平、橡胶、类同醇、糖类衍生物、天然色素等很多物质。远源杂种植物的产生，是指由受精后障碍导致远缘杂交的植物不孕，使得植物的种间和远缘杂交常难以成功。采用胚的早期离体培养可以使杂种胚正常发育，产生远缘 杂交后代，从而育成新物种。植物的快速繁殖，是指利用植物组织培养技术对外植体进行离体培养，使其短期内获得遗传性一致的大量再生植株的方法。植物快速繁殖是植物组织培养技术在农业生产中应用最广泛，产生经济效益最大的研究领域，涉及的植物种类繁多，技术日益成熟并程序
4、化，繁殖速度突破了植物自然繁殖的界限，成就了工厂育苗的2 梦想。 植物种质资源的离体保存，即从 20世纪 60年代开始，人们利用细胞和组织培养再生植株的技术，进行了离体保存种质的研究。种质资源离体保存是指对离体培养的小植株、器官、组织、细胞或原生质体等材料，采用限制 、延缓或停止其生长的处理使之保存，在需要时可重新恢复其生长，并再生植株的方法。为了创造新的种质资源，组织培养及基因工程技术被广泛用于水稻育种研究，并取得了显著成果，如现代生物技术育种过程中常作为外源基因的受体的愈伤组织，其质量的好坏及其分化植株能力的高低直接影响着水稻基因工程的进展和水稻种质资源的创新。在改善愈伤组织质量和提高植株
5、再生能力方面，科学工作者也进行了大量研究并得到了一定的成果 5。目前水稻的组织培养已在单倍体育种、诱变育种、体细胞杂交及遗传转化等方面得到应用。 二 、 主题部分 2.1 愈伤组织 的形成 从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。起动期是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态。起动期是通过一些刺激因素 (如机械损伤、改变光照强度、增加氧等 )和激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸的合成。机械损伤能诱导植物体细胞开始分裂，如伤口上会出现愈伤组织。在植物组织培养中沿用了愈伤组织这一名词，但
6、是植物组织培养中诱导外植体细胞分裂形成的愈伤组织，大都不是损伤的结果。外源的生长素类物质对诱导细胞 开始分裂效果很好，因此生长素类物质在植物组织培养中得到广泛应用，常用的有 2， 4-二氯苯氧乙酸、 萘乙酸 、吲哚乙酸 和细胞分裂素等。 分裂期是指外植体细胞 经过诱导以后脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。处于分裂期的愈伤组织的特点是：细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。 外植体的脱分化因植物种类、器官来源及其生理状况的不同而有很大差别。例如， 烟草 、 胡萝卜 等植物的脱分 化比较容易，禾本科植物的脱分化比较难；花的脱分化比较容易，茎、叶的脱分化比较难；幼嫩组织的脱分化比较容易，成熟的老组织
7、脱分化比较难。 2.2 水稻愈伤组织的诱导 水稻成熟胚愈伤组织诱导中普遍采用的基本培养基主要有 MS、 N6 和 B5 等培养基。培养温度一般为 2228 ， 25 左右最佳；光照强度为 1 5002 000 Lx，可以选用日光灯或白炽灯，光照时间1012 h 或全黑暗培养均可， 1030 d 可诱导出愈伤组织。 在水稻成熟胚的愈伤组织诱导过程中，为了保持愈伤组织的高速生长，常用到生长素类和细胞3 分裂素类物质。其中 2,4-D 是禾谷类作物愈伤组织诱导中唯一不可缺少的激素种类，其作用的适宜浓度范围为 0.55.0 mg/L，也有例外。在附加有 6.0 mg/L 2,4-D和 0.5 mg/L
8、 KT 的 MS 培养基上诱导出了大量小麦幼胚胚性愈伤组织。在培养基中添加一定浓度的 ABA，对抑制胚芽和根的生长有明显效果，且能显著提高成熟胚愈伤组织的诱导率， ABA 浓度为 2mg/L 时诱导率最高。当 ABA 浓度大于5mg/L 后，其愈伤诱导率开始下降 通常通过成熟胚诱导的初生愈伤组织并不适于悬浮细胞培养，一般需要 36 周的继代培养，改良愈伤组织的形态。为了获得松脆，小颗粒和快速生长愈伤组织细胞，也可以采用相对较短的继代周期或将大块愈伤组织夹碎摊平等物理手段。固体继代次数对细胞悬浮系的建立至关重要。有研究表明，愈伤组织在固体培养基上继代 7 次后形成的悬浮系与继 2 次后形成的悬浮
9、系相比，前者明显好于后者，适当地增加继代次数有利于愈伤组织细胞形态的改变。 2.3 提高水稻愈伤组织植株再生能力的几种方法 在农作物育种工作中，除了传统的自然选育外，创造变异是作物育种的一个必要步骤。离体培养使植物细胞产生变异，这种变异由澳大利 亚学者 Larkin和 Scowcroft于 1981年定名为体细胞无性系变异。目前，应用体细胞无性系变异进行水稻育种的工作在国内已取得了许多重要成果 6-8 在目前对细胞无性系还难以进行定向诱变的情况下，创造尽可能多的变异以供选择是细胞无性系变异育种的首要任务。在细胞离体培养中创造更多的变异有两种主要方式，第 1种是在开始时就采用大量的外植体材料诱导
10、愈伤组织的形成，再经过 1-2次的继代增殖培养后诱导愈伤组织产生大量的植株；第 2种方式是在开始时只采用少量的外植体材料进行愈伤组织的诱导培养，但愈伤组织在经过多次的增 殖继代培养后才进行诱导植株再生的培养。从现有的对细胞无性系变异规律不多的了解中，我们认为，这两种方式产生的无性系再生植株群体是有差别的。可能的情况是，相对于第 2种创造变异的方式，在第 1种方式产生的群体中，不仅总体的变异频率低，而且变异谱也较狭窄，相同或相近似的变异个体出现频度高。显然，第 2种方式更有利于育种选择。但是，采用第 2种方法往往由于长期继代培养的愈伤组织植株再生能力的显著下降而难以得到大量的再生植株，刻意延长培
11、养时间以创造变异的策略往往由于组培技术的限制而无法实施。 为了解决细胞在培养过程中植株再生 能力逐渐降低的问题，使离体细胞在培养后期产生的变异也能够通过植株再生而在育种中得到应用，不少科学家对培养方法进行了改造和创新，并取得了一定进展。但是，由于采用的实验材料各不相同，这些实验结果之间没有可比性而缺乏普遍的指导意义。本研究选用文献报道的脱水处理 9、添加亚精氨 10、添加山梨醇或甘露醇 11、两步分化法 12、几种方法，对相同实验材料进行培养比较，以寻求相对高效和可靠的植株再生培养方法。 4 2.4 愈伤组织培养的应用 愈伤组织培养作为一种最常培养形式，除茎尖分生组织培养和一部分器官培养以 外
12、，其他几种培养形式最终都要愈伤组织才能产生再生植株，而且，愈伤组织还常常是悬浮培养的细胞和原生质体的。因此，愈伤组织培养具有多种用途。一方面可研究植物生长发育及分化的机制、遗传变异规律，对植物遗传育种具有特殊意义；另一方面可用于大规模工厂化生产有用化合物，或用于细胞培养筛选工业、农业、医药生产上有用的无性系，或用于原生质体培养中的原生质体来源等。实践证明，愈伤组织培养不仅是一种植物快繁的新手段，同时也是植物改良，种质保存和有用化合物生产的理想途径。 2.5 目前水稻组织培养中存在的问题 在水稻组织培养方 面，我国科学家已克服了一道道难关，但在发展中还存在一系列问题，有待进一步探索。例如在目前的
13、技术水平下，对水稻细胞无性系还雉以进行定向诱变，直至目前还没弄清体细胞无性系变异的规律，给细胞无性系变异育种带来一定的困难 13。 水稻的愈伤组织是进行遗传转化改良水稻品质的重要方法之一。但是长期继代培养引起愈伤组织再生能力衰退是一个已被很多学者所认识和重视的问题，针对其衰退的原因也有比较深入的生理生化研究 14-17，但笔者认为它仍是一个有待进一步研究攻关解决的问题。 在水稻的组织培养和器官培养中花药离体培养作为 一种新的育种手段，在水稻育种中得到应用。我国是世界上首先将水稻花培品种应用于生产的国家，现已育成一批优质高抗的水稻优良品种，并取得了较好的经济效益和社会效益。花药培养诱导出的单倍体
14、，表现出双亲性状的各种重组类型，通过自然加倍或人工加倍，可以在当代获得稳定得纯合二倍体，大大加快了育种速度。但在实际操作中，由于受培养基组分、材料的差异性以及培养环境的影响，往往获得的再生植株群体较小，使选择受到较大的限制 18。并且水稻花药培养会产生大量的白化苗，有的甚至达 80一 90，成为花药培养研究和育种的重要障碍，以上 诸多原因都是水稻的组织和器官在离体培养的情况下，建立禾本科植物再生体系以及转基因育种中存在的问题。 参考文献 1杨跃生 , 简玉瑜 . 影响水稻愈伤组织再生植株数量和质量的因素 J. 农业生物技术学报 , 1996, 4(2):124-127. 2赵成章 . 水稻体细
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