1、 1 毕业论文 文献综述 生物工程 微生物诱变育种的方法 摘要： 微生物诱变育种的方法有很多种，如自然随机筛选和诱变育种，而诱变育种中有可以分为很多种方法，如物理诱变、化学诱变和复合诱变。物理方法里包括紫外线、微波、激光、电离辐射和离子注入；化学方法包括烷化剂、亚硝基胍、碱类化合物、无机化合物和其他的；复合诱变包括空间诱变和太空辐射。 关键字： 诱变育种 物理诱变 化学诱变 复合诱变 微生物与酿造工业、食品工业、生物制品工业等的关系非常密切，其菌株的优良与否直接关系到多种工业产品的好坏，甚至影响人们的日常生活质量，所以 培育优质、高产的微生物菌株十分必要。微生物的诱变育种，是以人工诱变手段诱发
2、微生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选，从多种多样的变异菌体中筛选出产量高、性状优良的突变株，并且找出发挥这个突变株最佳培养基和培养条件，使其在最适的环境条件下合成有效产物。作为途径之一的诱变育种一直被广泛应用。诱变筛选方法相对简便，是菌种选育的基本、常规和经典方法。特别是对遗传背景不很清楚的对象，诱变育种更是必不可少。近年来，随着新诱变因子的不断发现和筛选体系的进一步完善，微生物诱变育种有了长足的发展。 1 微生物诱变育种的 目的及作用 微生物育种的目的就是要把生物合成的代谢途径朝人们所希望的方向加以引导，或者促使细胞内发生基因的重新组合优化遗传性状，人为地使某些代谢产物过量积累，获得
3、所需要的高产、优质和低耗的菌种。 从自然界分离的野生菌种，不论是在产量上还是在质量上，均难适合丁业化生产的要求。理想的丁业化菌种必须具备遗传性状稳定、纯净无污染、能产生许多繁殖单位、生长迅速、能于短时间内生产所要的产物、可以长期保存、能经诱变产生变异和遗传、生产能力具有再现性、具有高产量和高收率等特性。微生物发酵工业中，诱变育种主要有以下作用：提高 有效产物的产量；改善菌种特性，提高产品质量；简化工艺条件；开发新品种，产生新物质；用于研究推测产物的生物合成途径；与其他育种方法相结合。 1-2 2 菌种选育的方法 2 2 1 自然随机筛选 不经人工处理，利用微生物在一定条件下可产生自发突变的原理
4、，通过分离筛选排除衰退菌落，从中选择维持原有生产水平的菌株的方法，称为自然随机选育。自然突变由 2种原因引起：多因素低剂量效应和互变异构效应。自然突变可能会产生 2种不同的结果，一种是菌种退化而导致目标产量或质量下降；另一种是对生产有益的突变。利用自发突变可以分离高 生产能力的菌种再用于生产，同时也可以利用自发突变而出现的菌种性状的变化，去选育优良的菌株。也可以用来选育高产菌株，但微生物自发突变频率很低 (10-8 10-6)，正变频率更低。通过自然选育提高菌种生产能力、筛选高产菌株的效率较低，效果不明显。因此，在生产实践中，自然选育的主要目的是用来纯化、复壮和稳定菌种。 2 2 诱变育种 凡
5、能诱发生物基因突变，并且突变频率远远超过自发突变率的物理因子或化学物质，称为诱变剂 (Muta-gen)。主要包括物理诱变剂和化学诱变剂，现在还有生物诱变剂。诱变剂是自 1927年用 X射线诱发果蝇遗传性状变异而引起科学工作者注意的，此后陆续发现了许多物理因子与化学物质都具有诱发基因突变的作用。近年来，随着基因工程技术的不断发展，蛋白质工程中点突变的重要技术 基因诱变在菌种选育中得以应用，使生物诱变剂也受到很大重视，并取得了可喜发展。现根据诱变剂的不同，介绍诱变育种方法的研究进展。 2 2 1 物理诱变 物理诱变有紫外线、激光、微波、 X射线、射线、射线、射线和快中子等，其中对微生物诱变效果较
6、好、应用较广泛的有紫外线、微波、 X射线和射线。 2 2 1 1 紫外线 紫外诱变技术是 诱变优良菌株的常规育种方法。由于其设备简单，诱变效率高，操作安全简便等特点而被广泛应用。 DNA和 RNA的嘌呤和嘧啶有很强的紫外光吸收能力，最大的吸收峰在 260nm。紫外辐射能作用于 DNA，因此在 260nm的紫外辐射是最有效的致死剂。紫外线被吸收后引起突变的原因，一般认为是：有的是 DNA与蛋白质交联 3，有的是胞嘧啶与尿嘧啶之间的水合作用，有的是DNA分子内或分子间发生交联反应，如使 DNA分子中相邻的嘧啶碱基形成嘧啶二聚体，二聚体的出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间
7、的正常配对，从 而有可能引起突变或死亡，同时二聚体的形成还会妨碍双链的解开，因而影响 DNA的正常复制和转录，从而使子代 DNA形成缺口，碱基错误插入该缺口，造成新链的碱基序列与母链不同而引起突变。紫外辐射还可以引起转换、颠换、移码突变或缺失等 4。其中形成嘧啶二聚体是产生突变的主要原因，嘧啶二聚体不仅可以由单链上相邻的两个胸腺嘧啶反应后形成，也可以由双链相应的两个胸腺嘧啶之间产3 生。此外，紫外诱变在核酸中往往造成比较单一的损伤，所以在 DNA的损伤与修复研究中也有一定的意义 5。 2 2 2 1 微波 微波作为一种 高频电磁波，能刺激水、蛋白质、核苷酸、脂肪和碳水化合物等极性分子快速震动。
8、在 2450MHz频率作用下，水分子能在 ls内来回震动 24.5 108次。这种震动能引起摩擦，因此可以使得单孢子悬液内 DNA分子间强烈摩擦，孢内 DNA分子氢键和碱基堆积化学力受损，使得 DNA结构发生变化，从而发生遗传变异；微波具有传导作用和极强的穿透力，在引起细胞壁分子间强烈震动和摩擦时，改变其通透性，使细胞内含物迅速向胞外渗透 6。在试验中，究竟是微波辐射直接作用于微生物 DNA引起变异，还是其穿透力使细胞壁通透性增加，导致核质变换而 引起突变，目前尚不明了，有待进一步研究。 一般认为诱变致死率只与诱变剂量有关，而在微波诱变发现中孢子悬液水浴辐照处理 180s致死率达 95以上 7
9、，由此认为致死率不仅受辐照剂量的影响，而且受瞬时强烈热效应的影响，直接辐射处理时，微波引起分子间强烈震动和摩擦产生热能，导致微生物在未接受到足够损伤造成突变的照射量之前，由于蛋白质变性，酶失活，孢子死亡，致死率增大。这种瞬时强烈热效应的影响以被一些实验证明。 2 2 1 3 激光 激光是一种光量子流，又称光微粒。激光辐射可以通过产生光、热、压力和电磁场 效应的综合应用，直接或间接地影响有机体，引起细胞染色体畸变效应、酶的激活或钝化，以及细胞分裂和细胞代谢活动的改变。光量子对细胞内含物中的任何物质一旦发生作用，都可能导致生物有机体在细胞学和遗传学特性上发生变异。不同种类的激光辐射生物有机体，所表
10、现出的细胞学和遗传学变化也不同旧 8 。 2 2 1 4 电离辐射 X射线和射线都是高能电磁波，具有很强的穿透能力，只要强度适当可以使生物分子发生电离，从而使生物体遭受破坏性损伤，直接或间接地改变 DNA结构。其直接效应是脱氧核酸的碱基发生氧化，或脱氧核糖 的化学键和糖一磷酸相连接的化学健， DNA的单链或双链键断裂。间接效应是电离辐射使水或有机分子产生自由基，这些自由基与细胞中的溶质分子起作用，发生化学变化，作用于 DNA分子而引起缺失和损伤。亚细胞结构损伤引起酶的释放，代谢方向性和协调性的破坏促使原初损伤进一步扩展 9。此外，电离辐射还能引起染色体畸变，发生染色体断裂，形成染色体结构的缺失
11、、易位和倒位等。 2 2 1 5 离子注入 4 离子注人是 20世纪 80年代初兴起的一项高新技术，主要用于金属材料表面的改性。 1986年以来逐渐用于农作物育种。近年来在微生物育 种中逐渐引入该技术 10。 离子注入技法是利用离子注入设备生产高能离子束 (40-60 kev)并注入生物体引起遗传物质的永久改变。离子注入诱变育种的特点，表明了其是一种物理效应、化学效应，是集化学诱变、物理诱变为一体的综合诱变方法 11。但是生物效应是个连续变化的过程，很难截然分开，离子注入的同时向受照射机体内输入能量、离子和电荷，其原初过程极为复杂且有特异性 12。 离子注入对生物体的作用是集动量传递、能量、质
12、量沉积和电荷的中和与交换于一体的联合作用的观点 13-16。其中，能量沉积起到主要的作用 。能量沉积指注入的离子与生物体大分子发生一系列碰撞并逐步失去能量，而生物大分子逐步获得能量进而发生键断裂、原子被击出位、生物大分子留下断键或缺陷的过程；质量沉积指注入的离子与生物大分子形成新的分子：动量传递会在分子中产生级联损伤；电荷交换会引起生物分子电子转移造成损伤，从而使生物体产生死亡、自由基间接损伤、染色体重复、易位、倒位或使 DNA分子断裂、碱基缺失等多种生物学效应 17-19。 2 2 2 化学诱变 在微生物诱变中，有诱变作用的化学物质很多，主要有烷化剂、亚硝基胍、硫酸二乙醋、氮芥盐酸盐、 5-
13、溴 脲嘧啶等，这些化学诱变剂对细胞都具有强烈的毒性，一般不能被微生物所利用，作用后使微生物发生变异而起到诱变育种的作用。化学诱变剂往往具有专一性，一种诱变剂对基因的某部位发生作用，对其余部位则影响很少。由于突变多为基因突变，并且主要是碱基的改变，其中尤以转换为多数，因此各种具有诱发作用的化学物质和碱基接触时能起化学反应，然后通过 DNA的复制使碱基发生改变。化学诱变剂对 DNA分子的这种特异效应，不仅有利于控制诱变育种，并且可以用于揭示突变过程遗传物质的变化及研究诱变与致癌的关系。 2 2 2 1 烷化剂 烷化剂 是最有效，也是用得最广泛的化学诱变剂之一。依靠 NTG诱发的突变主要是 GC A
14、T转换，另外还有小范围切除、移码突变及 GC对的缺失 10。在自然条件下烷化剂容易分解，而在酸性(PH5 5)条件下会产生 HN02。虽然 HN02本身就是诱变剂，但在 NTG有活性时 (PH6-9)，它却无诱变效果。在碱性条件下， NTG会形成重氮甲烷 (CH2N2)，它是引起致死和突变的主要原因。它的效应很可能是 CH2N2对 DNA的烷化作用引起的 20。 2 2 2 2 亚硝基胍 亚硝基胍的作用方式主要是诱发 GC AT的转换，它能氧化脱 去 A、 G和 C的氨基，使 A HX(次黄嘌呤 )， C U(尿嘧啶 )， G X(黄嘌呤 )。由于所形成的新碱基改变了原来碱基的性质，再复制时就
15、会引起 A： T G： C的转换， G： C A： T的转换而造成突变。它除有较强的诱变作用外，还能诱发5 邻近位置基因的并发突变，而且特别容易诱发 DNA复制叉附近的基因突变，随着复制叉的移动，它的作用位置也随着移动 21。 2 2 2 3 碱基类化合物 碱基类似物分子结构类似天然碱基，可以掺人到 DNA分子中导致 DNA复制时产生错配， mRNA转录紊乱，功能蛋白重组，表型改变。该类物质毒性相对 较小，但负诱变率很高。往往不易得到好的突变体。主要有 5-氟尿嘧啶 (5-FU)、 5-溴尿嘧啶 (5-BU)、 6-氯嘌呤等。 2 2 2 4 无机化合物 诱变效果一般，危险性较小。常用的有氯化
16、锂，白色结晶，使用时配成 0.1 0.5的溶液，或者可以直接加到诱变固体。培养基中，作用时间为 30min-2h。 亚硝酸易分解，所以现配现用。常用亚硝酸钠和盐酸制取，将亚硝酸钠配成 0 01-0 1molFL的浓度，使用时加入等浓度等体积的盐酸即可。 2 2 2 5 其他 盐酸羟胺。一种还原剂，作用于 C上，使 D-C变为 A-T。也较常用，使用浓度为 0 1 0 5，作用时间 60min-2h。 此外，诱变时将两种或多种诱变因子复合使用，或者重复使用同一种诱变因子，效果更佳。顾正华等闲以谷氨酸棒杆菌 ATCC一 13761为出发菌株，经 DMS和 NTG多次诱变处理，获得一株 L-组氨酸产
17、生菌。 2 2 3 复合诱变 复合因子处理是指两种或两种以上的诱变因子诱发菌体突变。各种诱变因子的作用机制不一样，主要是 DNA分子上的不同基因位点对各种诱变剂吸收朗值有较大差异，即不同诱变剂对基因作用位点有一定的专一性，有的甚至具有特异性，因此多因子 复合处理，可以取长补短，动摇 DNA分子上多种基因的遗传稳定性，能导致较大的突变，得到更多的突变类型。 2 2 3 1 空间诱变 空间诱变育种，就是将航天高技术与传统的物理化学诱变及分子技术等相结合的综合的新的育种技术。经特殊的空间环境条件作用，引起生物体的染色体畸变，进而导致生物体遗传变异。空间环境的主要特征为微重力、空间辐射、超真空和超净环
18、境等 22。 在卫星近地面空间条件下，各种物体都处于微重力状态。当外界微重力信号被细胞膜表面受体分子识别后，可以通过调节真核细菌细胞质膜上 Ca2+传递转化系统，或者 经过磷酸肌醇信使系统把刺激信号传递给细胞内贮钙体，引起贮钙体内 Cd+的释放，使细胞质内 Ca2+浓度发生改变，从而影响与一些钙受体蛋白的结合，其中最重要的是 Ca2+ CaM(钙调节蛋白 )。 Ca2+、 Ca2+ CaM能调节细6 胞体内蛋白质的磷酸化和脱磷酸化作用。因此，它在细胞分裂期微管的组装与去组装、染色体移动、微丝的构建、光合系统的激活等方面起着重要作用，从而影响细胞分裂、细胞运动、细胞间信息传递、光合作用和生长发育
19、等生理生化过程。在微重力条件下，可见激素分布、细胞结构、 Ca2+、 Mg2+与细胞膜结合状态的明显 变化，并且出现细胞核畸变、分裂紊乱、浓缩染色体增加、核小体减少，说明微重力引起遗传物质的改变。有人认为，这些可能是地面微生物菌种繁殖时间延长的原因 23-26。 2 2 3 2 太空辐射 太空辐射的主要来源有三个方面 22：地球磁场捕获高能粒子产生的俘获带辐射、太阳外突发性事件产生的银河宇宙射线 (GCR)及太阳爆发产生的太阳粒子 (SPE)事件。俘获带主要由质子 (内区 )及电子 (外层带 )组成。 GCR中 98是质子及更重的离子，只有 2是电子和正电子；在重的部分中，质子占 87，氦离子
20、占 12，其他 重离子占 l。 GCR粒子的能量范围可以从 0 3 GeV u到 2 GeV u，其中一半剂量来自能量超过 850GeV u的离子。 SPE是由于太阳磁暴引起太阳爆发，而发射大量的带电粒子，如质子、氦核及更重的离子，这些粒子的能量范围约为 1015 MeV27-28。许多实验证明，空间诱变与地面辐射处理发生的变异情况有许多类似之处。辐射敏化剂预处理能增加生物损伤。有人提出重粒子作用模型：当单个重粒子穿过生物体时，会形成大量能量沉积，引起被打击机体的有效损伤。如果这种粒子停留在生物体内，则损伤更大。 DNA和生物膜是 核膜是射线作用的靶子。 DNA结构的损伤主要有单、双链断裂，碱
21、基和糖的损伤， DNA与 DNA、 DNA与蛋白质交联等；其中单、双链断裂较多见。富含胸腺嘧啶的区域最易受到破坏。常见的膜损伤有膜结构的改变、膜结合酶活性和膜受体功能降低， DNA膜复合体的解离，膜内外电解质平衡的破坏及能量供应的障碍等。 DNA断裂或其他损伤会引起细胞的一系列修复活动。若损伤未被修复或被错误修复，就会表现出遗传变29-30。 3 结束语 随着遗传学和分子生物学领域的飞速发展，许多新型复杂的技术被应用于菌种选育，如原生质体融合育种技术和 基因工程育种技术等，但是诱变育种技术仍是提供菌株生产能力的重要有效手段。它获得的正突变率相对较高，可以得到多种优良突变体和新的有益基因类型。另
22、一方面，诱变育种存在一定的盲目性和随机性，在实际应用中，研究者应根据出发菌株及实验室条件等具体情况来选择合适的诱变方法。本实验室将物理因子和化学因子结合起来对多种酵母菌株进行复合诱变，均得到了理想菌株。此外，我们正在尝试反复采用几种诱变因子进行多次诱变，以期得到更为理想的菌株。 7 参考文献 1 施巧琴 ,吴松刚 .工业微生物育种学 M.北京 :科学出版社 ,2003. 2 余风玉 .LA5菌株发酵生物学特性研究及抗生素高产诱变育种 D.华南热带农业大学 ,2005. 3 Madigan,M.T(美 )Martinko J.M(美 ),Parker,J(美 ).微生物生物学 M.北京 :科学出
23、版社 ,2001:390. 4 曹友声 ,刘仲敏现代工业微生物学 M.长沙 :湖南科学技术出版社 ,1998. 5 WANG Fu-zhuan,LIANG Qiu-xia,et a1.Applications of mutation and screening in microbiology breedingJ.Transaction of Luoyang Normal College,2002,(2):95-99. 6 冯清平 .微波对微生物诱变生物效应的研究 J.甘肃科学学报 ,1994,6(4):67-69. 7 李永泉 .微波诱变选育木聚糖酶高产菌 J.微波学报 ,2001,17(1)
24、:50-53. 8 胡卫红 .激光辐照微生物的研究概况 J.激光生物学报 ,1999,8(1):66-69. 9 WU De-chang, RadiologyM.Beijing:Military Medicine Press,2001(in Chinese). 10 陈义光 ,李铭刚 ,徐丽华 ,等 .新型物理诱变方法及其在微生物诱变育种中的应用进展 J.长江大学学报 ,2005,2(5):46-48. 11 梁慧星 ,离子注入技术在微生物诱变育种中的研究 J.安徽农业科学 ,2007,35(9):2564-2565. 12 汪伟明 ,微生物诱变育种技术 离子注入法 J.科技信息 ,2007,
25、20,(20). 13 宋道军 ,余汛 ,姚建铭 ,等 .低能离子束对微生物细胞的刻蚀与损伤 研究 J.生物化学与生物物理学报 ,1998,30(6): 570-574. 14 Shao Chunlin,Xu An,Yu Zengliang.Charge exchange effect of ionimplantation to biomoleculesJ. High Technology Letters,1997,20(2):70 73. 15 SONG Dao jtm,YAO Jian ming,SHAO Chun lin.A possible mechanism of dose rela
26、ted survival of microorganism implanted by N+ ionsJ.Higll Technology LenerS,1999,22(3):129-132. 16 卞坡 ,张艳锋 ,吴健等 .低能离子注入生物组织原初过程的模拟计算 J.郑州大学学报 ,2001,33(1):45-49. 17 施巧琴 ,吴松刚 .微生物育种学 (第二版 )M.北京 :科学出版社 ,2003:1-4,76-78. 18 Parekh S,Vinci V A,Strobel R J.Improvement of microbial strains and fermentation
27、processesJ. Apply Microbiol Biotechnol,2000,54:287-301. 19 陈宇 ,林梓鑫 ,张峰等 .离子注入微生物的生物效应研究 J.中国抗生素杂志 ,1998,23(6):415-419. 20 雷肇祖 ,钱志良 ,章健 .工业菌种选育述评 J.工业微生物 ,2004,34(1):39-51. 21 王付转 ,梁秋霞 ,李宗伟 ,等 .诱变和筛选方法在微生物育种中的应用 J.洛阳师范学院学报 ,2002 8 (2):95-99. 22 田兴山 ,张玲华 ,郭勇 ,等 .空间诱变在微生物菌种选育上的研究进展 J.生物技术通报 ,2005,(4):1
28、05-108. 23 蒋兴屯 .”8885”返地卫星搭载对水稻遗传性的影响 J.科学通报 1991,23:1820. 24 刘禄祥 .农作物空间技术育种研究现状与展望 A.中美农业科技与发展研讨会文集 C.北京 :中国农业出版社 ,1996:221. 25 More MJ.Singmal transduction and phosphatidy Linost01 turn over in plantsJ.Plant Physiology, 1989,76:118. 26 Adarnchuk NI.Ultratructural and functional changes ofphotosynt
29、hetic apparatus ofArabidopsis Thaliana(L)heynh induced by clinorotationJ.Adv Space Res,1998,21(819):1131. 27 温贤芳 ,刘 录祥 .我国农业空间诱变育种研究进展 J.高科技与产业化 ,2001,6:22. 28 杨垂绪 ,梅曼彤 .太空放射生物学 M.广州 :中山大学出版社 ,1995,7. 29 顾薇玲 ,彭惠林 ,杨蕴刘等 .微重力和宇宙射线对某些微生物的影响 J.植物生理学报 ,1989,15(4):397. 20 James WC,Thomas KG Simon PS.Cosmic rays at the energy frontierM.New Yor:Microsoft Corporation,2001,1993.
