1、力学刺激对植体-骨界面骨系细胞 mRNA 表达的影响Effects of the mRNA expression in implant-bone interface bone cells after mechanical stimulate摘要在建立力学刺激骨系细胞的动物实验模型的基础上，利用激光捕获显微分离技术（LCM）, 获取动物模型体内种植体骨界面区域的成骨细胞和破骨细胞,用基因芯片法检测不同力值的间断力学刺激作用下基因表达谱的时序变化。明确从骨形成到骨破坏这个质的变化过程中，基因表达的差异和相关的特异性基因，探讨成骨细胞和破骨细胞的耦联机制，从系统角度研究生理负荷促进骨形成和超负荷导致
2、骨破坏的基因调控机制的差异，尝试筛选出与骨形成和骨破坏相关基因，以为骨生物力学及骨组织工程学提供理论依据，并进一步完善负荷状态下骨组织与人工材料界面骨改建机制的理论，为临床诊断和防治提供理论先导。（一）立项依据与研究内容1、 项目的立项依据（附主要的参考文献目录） 。随着医学科学的发展，一些人工种植体或装置越来越多的被植入骨组织，用于治疗病变和修复缺损，如人工关节、牙种植体，以及骨内固定装置等。理想的人工种植体或装置应以与骨组织紧密结合(骨整合 Osseointegration)的形式行使其生理功能, 然而，仍有部分植入体不能达到或保持长期的骨整合，导致植入体松动、脱落和并发症的产生，除了植入
3、体材料本身的因素之外，负荷后骨组织的应力变化也是重要的影响因素之一，且已引起众多学者的关注。由于植入体与骨组织之间始终存在一个界面，负载后界面骨组织的应力应变与正常骨组织负载后的应力应变不同，这种力学环境的改变，可能会促进骨组织与人工材料的界面发生适应性改建，达到理想的骨整合；也可能会导致骨组织与人工材料的界面发生骨吸收。骨吸收会使种植体与骨组织分离，增加了植入物微粒、细菌及炎症介质等侵入的机会，引起炎症反应，加速骨吸收并造成植入体松动，进而影响种植体的生存率和生存时间。因此，了解力学刺激对骨组织与人工材料界面骨改建的影响，将有助于解释临床观察到的现象，有助于与骨生物力学相关的诸学科的发展，如
4、骨折固定、人工关节置换、牵张成骨、口腔种植修复、口腔正畸、骨质疏松症的防治及骨组织工程研究等等。机械刺激产生的耦合力传递到骨组织，使骨系细胞发生应力应变作用，这些变化通过多个信号转导通路的转导，导致骨系细胞产生多种生物学效应并完成骨的改建。成骨细胞(OB)和破骨细胞(OC)是骨改建的两大主要功能细胞，在应力、生长因子、激素等作用下两者之间相互作用，相互调控，使骨产生适应性地构建。其中由应力应变造成细胞的生物学反应和变化，引起了人们的关注1，多数学者认为 2：不同的力学刺激可以导致成骨细胞、破骨细胞活性和数量的变化，影响骨形成与骨吸收，而这显然是由于骨系细胞基因表达和基因调控发生变化的结果。目前
5、的研究证据表明：1、体外培养成骨细胞加载研究证明 3-5：成骨细胞未受力时, 早期即刻基因 c-fos、c-jun 在细胞静止期内不表达；受力学刺激后初期即明显增加，其表达一般与细胞的增殖分化同时出现，因而其转录翻译蛋白可能对其它晚应答的基因转录起调控作用。Ikegame 等 6发现：加载 6h 后，骨形成蛋白-4（BMP-4）基因表达增加，成骨特异性转录因子 cbfa1/Osf-2 也随着 BMP-4 基因表达开始表达。Pavlin 等 7发现：加载 24h 后，成骨细胞中骨钙蛋白水平轻度下降，但在加载 1-2d，其表达增长了 4.6 倍，到第 4d 则增长了 7 倍，达到其增长的最高峰；I
6、 型胶原基因的表达在加载后第 1d 不明显，但在第 2d 其表达增长了 3 倍，并在其后 6d 维持这一水平。Cillo 等 8则针对另外一些重要的基因表达进行了研究：实验中发现拉伸应力可以使 TGF- 和胰岛素样生长因子 -II 的 mRNA 表达增加，碱性成纤维细胞生长因子表达减少，且不同的力值和加载时间对这些基因的表达有不同的影响。显然成骨细胞受力后，基因的表达在一定的时间范围内存在明显的时序性变化。2、破骨细胞是骨吸收的主要功能细胞，传统认为破骨细胞是一个“惰性细胞” ，对力学刺激不敏感，主要是通过成骨细胞感受力学刺激以后，通过耦联机制影响破骨细胞的活性、增殖和迁移。但是最近的研究表明
7、 9：应力可直接导致体外培养的破骨细胞 mRNA 表达的增强，并伴随着骨吸收能力的增强。3、多数实验是建立在对 OB、OC 静态加载的基础上，但动态载荷对骨改建的影响远大于静态载荷，已得到很多学者证实，即间歇性的周期性力学刺激对细胞的增殖分化功能和基因表达的作用明显大于持续性静态负荷的作用 10-11。但其原因和机理尚不清楚。4、对力学信号转导的研究表明 12-14：骨系细胞表面的离子通道在细胞膜受到力学作用数秒或数分钟后即可引起 G 蛋白活化、第二信使释放、蛋白质磷酸化、生长因子的分泌、细胞骨架的变化、细胞和细胞外基质粘附的重建，最终导致基因表达的变化。基因表达的变化可能反过来影响信号的转导
8、 13。成骨细胞在某些力学刺激因素作用下表达一些因子，从而将骨吸收信号传递给破骨细胞的前体细胞，使之分化发育并活化，行使骨吸收功能。骨保护素（OPG）和骨保护素配体（OPGL）的发现证实了这一假说，并提供了分子基础 13-14。有研究表明 14-15：作为细胞表面重要受体的整合素，通过识别某些胞外基质蛋白，介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质的粘附反应并接受、转导级联信号，并有可能是力学信号传递的通道。从以上研究中可以看出：（1）力学刺激导致 OB、OC 基因改变的过程涉及众多基因的变化，但针对个别基因的研究显得较为凌乱，基因之间的相互影响也不清楚，不能精确地阐明各基因在这一过程中的作用。 （2）
9、多条信号转导通路之间存在着密切的耦联关系，不同的力学信号可能通过这些内在相连的信号通路，以不同的方式影响骨系细胞的反应。这些不同信号通道是如何介导力学刺激，而导致 OB、OC 基因表达的时空变化？是否存在某些尚不为人所知的信号转导分子？信号通路之间又是如何耦联的？这方面的认识尚不明确，只能从基因表达的变化来找寻方向。 （3）由于各学者多采用体外实验，实验条件不尽相同，导致实验结果的可比性较差，有关体内实验的报道，特别是力学刺激对人工种植体- 骨界面骨系细胞基因表达影响的报道也极为罕见。因此，有必要同期从体内外观察 OB、OC 受力后整个基因表达的时序变化，探讨各相关基因在骨形成和骨吸收过程中的
10、确切作用，并探讨其临床应用前景和意义。Vaes16等人曾尝试应用基因芯片的方法，找寻骨形成蛋白-2 诱导成骨细胞分化过程中的标记基因，为探寻力学信号对骨系细胞基因表达的影响提供了一个好的思路。基因芯片技术是一项新兴的能检测全范围 mRNA 表达水平变化的技术，具有高通量、并行化的特点，可为研究基因调控网络及其机理，揭示不同层次多基因相互作用的生理、病理现象提供有效手段 17,18。然而，骨组织是不同细胞群体相互作用的三维空间结构，通过磨碎活组织所提取的DNA、RNA 不能代表特定生理或病理过程中单一同类细胞的信息。激光捕获显微切割技术 19（Laser Capture Microdissect
11、ion ， LCM）则是解决细胞异质性问题的革命性技术，是在显微镜下从组织切片中分离、纯化单一类型细胞群或单个细胞的技术。从 LCM 捕获的同质细胞中提取 mRNA 可构建 cDNA 文库，进行cDNA 微列阵分析 20。因此，我们相信 LCM 技术与基因芯片的有效结合，将能够清晣地勾画出力学刺激后人工种植体-骨界面 OB、OC 在生理、病理过程中的基因表达的改变。综上所述，骨作为一个自适应的生物系统是通过多层面、多因素的网络调控来完成应力作用下的骨改建，显然以往只针对其中某一层面、若干因素的单一视角的研究，难以系统透彻地阐述应力作用下骨形成和骨吸收的基因调控机制。因此有必要从整个基因组的水平
12、探讨应力作用下骨系细胞上千个基因的动态表达，既要从分子水平来研究其机理，也要从系统层面动态研究骨系细胞基因的时序变化，把分析和综合统一起来，同时也可以对目前众多单基因水平的研究进行分析、评价和比较，从而明确不同力学刺激导致骨形成和骨吸收的基因调控的异同，试图发现新的重要的调控基因，筛选出能特异性表明骨形成和骨吸收的“标记”基因，不仅为骨生物力学及骨组织工程学提供理论依据，而且对负荷状态下骨组织与人工材料界面骨改建机制的认识、临床诊断和防治等也有重要的意义。参考文献：1、Lee TC, Staines A, Taylor D. Bone adaptation to load: microdama
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25、和骨破坏之间的关系，确定本实验中拟采用的“生理”负荷和“超”负荷的标准力值。第二部分：体外培养 OB 和 OC，采用基因芯片法检测不同力值的间断力学刺激下 OB 和 OC 基因表达谱的时序变化。第三部分: 利用激光捕获显微分离技术, 采集动物模型体内种植体骨界面区域的 OB 和 OC,再用基因芯片法检测“生理”负荷和“超”负荷下各类细胞基因表达谱的时序变化。第四部分：采用 RT-PCR 方法，对骨形成和骨破坏过程中 OB、OC 基因表达变化差异最大的几个基因进行检测和验证。第五部分：统计学分析比较体内外 OB、OC 基因表达的时序变化和差异，分析从骨形成到骨破坏过程中整个基因组表达的差异及其作
26、用机制。研究目标：本研究拟通过体内外实验，探讨从骨形成到骨破坏这个质的变化过程中骨系细胞基因表达的差异，从整体角度分析“生理”负荷促进骨形成和“超”负荷导致骨破坏的基因调控机制，明确相关的特异性基因表达，探讨 OB 和 OC在力学刺激下的耦联机制，探索未知的相关调控基因或信号转导相关基因，从而为与骨生物力学相关的临床学科提供分子水平的理论基础以及临床应用的指导。拟解决的关键问题1） 、建立动物模型，确定本实验中拟采用的“生理”负荷和“超”负荷的标准力值。2） 、通过体内体外 OB 和 OC，在间断力学刺激下不同时间点取样的基因表达谱的比较，研究骨系细胞基因表达的时序变化。3） 、通过体内体外
27、OB 和 OC 基因表达谱差异的对比分析，探讨 OB 和 OC 的耦联机制。4） 、通过探索骨形成和骨破坏过程中 OB 和 OC 特异性基因表达的种类和丰度，尝试找寻相应的“标记”基因。5） 、通过基因表达谱的比较，结合基因数据库的数据，结合重要调控基因的发现，从整体角度分析负荷状态下骨组织与人工材料界面骨改建的机制，为进一步研究提供新的线索和思路。3、拟采取的研究方案及可行性分析。研究方案一） 、实验动物模型的建立及间断力学刺激对骨系细胞影响的观察1） 、选 6 月龄 SD 大鼠 60 只，雌雄各半，分别单侧股骨植入纯钛种植体（2.0，L 8）骨外暴露 4mm，以备加力用，2-3 月后，X
28、光验证骨整合者备用。2） 、随机分为 5 组，Zwick1454 自动材料万能试验机分别以0N，5N，10N，20N，40N 力值、2HZ 的频率给种植体轴向加载，每天 3 次，每次 1 小时，连续 3 周。如种植体明显松动，停止加载，取材检测。3） 、3 周后取材， 通过骨形态学计量方法分别检测各种植体周围骨质的骨小梁表面成骨细胞数、骨小梁表面破骨细胞数、有成骨细胞被覆的类骨质表面占骨小梁总表面的百分比、骨小梁吸收表面占骨小梁总表面的百分比等相关指标检测。4） 、各指标经统计学分析，确定临界负荷及本课题将采用的“生理”负荷和“超”负荷的标准力值。二） 、体外培养的成骨细胞、破骨细胞在间断力学
29、刺激下基因表达谱的基因芯片检测1） 、体外培养成骨细胞和破骨细胞，观察不同负荷下的生物学性状。 （已积累经验）2） 、将前期实验测出的标准“生理”负荷和“超”负荷换算成大气压，通过气压加压装置间断加力于体外培养的成骨细胞和破骨细胞，其力学参数参考前期实验。3） 、将“生理”负荷和“超”负荷作用于成骨细胞，以 1h ,24h ，48 h，4d 为取样点，未加力为对照，抽提 mRNA 后，逆转录标记 cDNA ，应用基因芯片技术检测成骨细胞基因表达谱的时序变化。(取样时间点系根据前期实验总结、临床经验、及参考相关文献提出)4） 、将“生理”负荷和“超”负荷作用于破骨细胞，以 1h ,24h ，48
30、 h，4d 为取样点，未加力为对照，抽提 mRNA 后，逆转录标记 cDNA ，应用基因芯片技术检测成骨细胞基因表达谱的时序变化。三） 、体内骨组织不同负荷和时间下成骨细胞和破骨细胞基因表达谱基因芯片检测1） 、90 只 SD 大鼠动物模型，随机分为三组，每组各 30 只。2） 、I 组：按“生理”负荷力值加载，随机选 5 只大鼠，分成 6 小组，分别在1h 加载后，以及 24h, 48 h，4d 加载（每天 3 次，每次 1 小时）后取下大鼠股骨，分别分离种植体和骨组织，取与种植体交界处骨组织，采用激光捕获显微分离技术分别分离出成骨细胞和破骨细胞，将每小组 5 个样品的成骨细胞（或破骨细胞）
31、等量混合，抽提 mRNA，逆转录标记 cDNA, 基因芯片检测成骨细胞和破骨细胞的基因表达谱（基因芯片为大鼠 Oligo 基因芯片，6000 个 cDNA的微阵列，由北京博奥生物芯片有限公司协助制备） 。3） 、II 组：按 “超”负荷力值加载后，随机选 5 只大鼠，分成 6 小组，分别在1h 加载后，以及 24h，48h,6d 加载（每天 3 次，每次 1 小时）后取下大鼠股骨，其余方法同 I 组。4） 、III 组：无负荷加栽组，与上两组同期取种植体周围骨组织，抽提成骨细胞和破骨细胞 mRNA，逆转录标记 cDNA, 基因芯片检测成骨细胞和破骨细胞基因表达谱。四） 、采用 RT-PCR 检
32、测不同负荷下表达差异明显的基因拟对在骨形成和骨吸收中基因表达差异（上调或下调）超过 5 倍的基因，应用RT-PCR 法进行基因表达水平的半定量测定，并结合基因数据库分析此生理过程中涉及功能性基因的种类和变化的幅度，以期阐明“标记”基因。1） 、样品在做基因芯片检测之前，提取部分细胞，标记，液氮冻存备用。2） 、据基因芯片检测的结果，对 I、II 组基因表达差异最大的数个基因通过逆转录-聚合酶链反应（ RT-PCR）法，抽提细胞的总 RNA，逆转录，再通过随机引物法对此类基因进行基因表达水平的半定量分析。结合基因数据库，分析这些基因的主要功能及作用。五） 、统计学分析处理统计学分析各项实验结果，
33、明确间断压力下的骨形成和骨破坏过程中，成骨细胞和破骨细胞特异性基因的表达和时序变化，通过体内外实验的对比，探讨成骨细胞和破骨细胞在间断力学刺激下的耦联机制。生理负荷 超负荷基因芯片 基因芯片 体外培养的成骨细胞(OB)和破骨细胞(OC)体外培养的成骨(OB)细胞和破骨细胞(OC)体外 OB、OC 基因表达谱的时序变化体外 OB、OC 基因表达谱的时序变化1、 RT-PCR 法检测 OB、OC 表达差异最大的几个基因；2、 结合基因数据库，明确“标记”基因及功能。骨界面 OB、OC 基因表达谱的时序变化骨界面 OB、OC 基因表达谱的时序变化研究骨形成到骨吸收质的变化过程中，OB、OC 基因调控机理。
