1、 1 毕业论文 文献综述 生物工程 滩涂湿地 N 元素转化细菌的分布及研究现状 摘要： 湿地是地球上具有多种独特功能的生态系统， 而 N 元素的循环又与 之 息息相关。本文综述了 N 元素 转化 细菌的生物学性状、研究方法、生态分布等方面的内容，并 就 研究方向提出了几点建议。 关键词： N 元素转化细菌； N 素循环；研究方法；湿地；分布 ； 自然界中， 氮循环主要环节 有 ：生物体内有机氮的合成、氨化作用、硝化作用、反硝化作用和固氮作用 1-2。氮进入生态系统 后 ，经生物、工业和大气等固氮过程被固定为氨或氨盐，氨或氨盐经硝化作用转化成硝酸盐或亚硝酸盐， 然后被植物吸收利用，并转化为氨基酸
2、、蛋白质。于是氮素进入生态系统的生产者有机体，进一步为动物取食，转变为含氮的动物蛋白质 （称为 生物体内有机氮的合成 ） 。动植物排泄物或残体等含氮的有机物经微生物分解为二氧化碳、水和氨气后 返回环境 （称为 氨化作用 ） ，在有氧条件下，土壤中的氨或铵盐 会 在硝化细菌的作用下最终氧化 形 成硝酸盐 （称为 硝化作用 ），而 氨化作用和硝化作用 所 产生的无机氮，都 可 被植物再次利用， 同时， 在氧不足条件下，土壤中的硝酸盐 可 被反硝化细菌等多种微生物还原成亚硝酸盐，进一步还原成分子态氮，分子态氮返回到大气中 （称为 反 硝化作用 ） 。 这两个过程都使氮素重新 进入新循环。 可见 氮循
3、环 中， 硝化和反硝化作用 是至关重要的， 硝化和反硝化作用 绝大部分是通过 硝化细菌和反硝化细菌 完成的： 硝化细菌把氨氮转化为 NO2-，再进一步转化为 NO3-。而反硝化细菌则是把 NO3-或 NO2-还原成 NO2-或 N23。 因此 我们的研究重点和关注点 是其中起主要作用的 硝化细菌和反硝化细菌 。 1 N 元素转化细菌的 种类及分布 1.1 硝化细菌 硝化细菌分类：硝化细菌属于自养性细菌，包括两种完全不同的代谢群：亚硝酸菌属 （ nitrosomonas） 及硝酸菌属 （ nitrobacter） ，它们包括形态互异的 杆菌 、 球菌 和 螺旋菌 。亚硝酸菌包括亚硝化单胞菌属、亚
4、硝化球菌2 属、亚硝化螺菌属和亚硝化叶菌 属中的细菌。硝酸菌包括 硝化杆菌 属、硝化球菌属和硝化囊菌属中的细菌。 两类菌均为专性好气菌，在氧化过程中均以氧作为最终电子受体。大多数为专性化能 自养型 ，不能在有机 培养基 上生长，例如亚硝化单胞菌（ Nitrosomonas）、亚硝化螺菌（ Ni-trosospira）、亚硝化球菌（ Nitrosococcus）、亚硝化叶菌 （ Ni-trosolobus）、硝化刺菌（ Nitrospina）、硝化球菌（ Nitrococcus）等。只有少数为兼性自养型，也能在某些有机培养基上生长，例如维氏硝化杆菌（ Nitrobacterwinogradsky
5、i） 的一些品系。从形态上看，也有多样，如球形、杆状、螺旋形等，但均为无芽孢的 革兰氏阴性菌 ；有些有 鞭毛 能运动，如亚硝化叶菌，借周身鞭毛运动；有些无鞭毛不能运动，如硝化刺菌。一般分布于土壤、淡水、海水中，有些菌仅发现于海水中，例如硝化球菌、硝化刺菌 4,5,6。 1.2 反硝化细菌 反硝化细菌的种类很多，大约有 50 多个属， 130 多个种。已经报道的包括无 色杆菌属（ Achromobacter），芽孢杆菌属（ Bacillus），短杆菌属（ Brevibacterium），肠杆菌属（ Enterbacter），乳杆菌属（ Lactobacillus），微球菌属（ Micrococc
6、us），假单胞菌属（ Pseudomonas），螺菌属（ Spirillum）等 5。 反硝化细菌分布 非常 广，在土壤、污水、部分肥料中都大量存在。 在 水体与泥土中，尤其是在沉积物中反硝化菌将氮素转化为气态产物释放到大气中，该作用可以控制富营养化程度 6。主要应用于工业废水或污染河流、池塘的处理， 降低水中的有害含氮物质，改善水质。也是水质、土地或作物洁净度的辅助考察指标 7。 2 N 元素转化细菌分布研究方法 N 元素转化细菌是一类在自然界氮循环中起关键作用微生物菌群。目前我国氮污染问题日趋严重 。 许多应用领域都迫切需要进行氮污染的治理。故此，我们需要对 N 元素转化细菌的检测方法和分
7、布应用进一步的进行研究。 检测 N 元素 转化细菌 丰度及菌属的方法有很多，如 MPN 法，与 PCR 相关的方法，分子生物学方法，核酸杂交检测法，免疫检测技术，变性梯度凝胶电泳（ DGGE） 等。 3 2.1 MPN 计数法 8-10 MPN 法又称 稀释频度法， Griess 试剂用于检测 NO2-； MPN 二苯胺法用于检测 NO3-。 优缺点： MPN-Griess 计数法操作简单、方便，工作量小，可进行大批量样品的检测，对仪器设备要求低，检测灵敏度最高；但需时间长，培养基不适合所有 N 元素转化细菌，分散工作也难以做好，导致检测结果可能偏低，并且无法进行特定种属的硝化细菌的计数检测
8、4。 2.2 荧光原位杂交 （ FISH） 11 荧光原位杂交 （ FISH） 属于分子生物学中的核酸杂交技术，可快速检测硝化细菌的数量和分布情况。 FISH 技术是利用硝化细菌特异性的探针， 在原位检测水环境或生物膜上的硝化细菌时，不仅能对它们定性地检测，而且还能定量地反映出环境中硝化细菌的分布和丰度，为研究硝化系统中硝化细菌类群的空间和数量分布提供了有效的检测手段。 优缺点： FISH 将单种细菌从复杂菌群中检测出来，并加以定量，时间短，最快只需几小时，能鉴定到科、属、种；但所需设备昂贵，检测用具成本高，对实验人员有较高专业要求，探针到达目标位置的机率及样品自发荧光等多 种 问题目前也有待
9、解决，这些也都限制 FISH 技术的推广使用 4。 2.3 偶氮盐（ INT）还原计数检测法 偶氮盐 （ INT） 还原计数 检测法对活性污泥 中 的硝化细菌进行检测，所得的结果与传统的 MPN-Griess 法检测值有着很好的相关性。 优缺点：操作简单，对仪器设备要求低，时间短，仅需 2 天；但方法的可靠性需要进一步的验证，无法进行特定种属的硝化细菌的计数检测 4。 2.4 PCR12-13 聚合酶链反应（ PCR）是一种在体外快速扩增微量靶 DNA，结合最大可能数法，对硝化细菌进行快速定量的方法。 优缺点：检测所需时间短；对不可培养的硝化细菌也可进行检测；可进行不同类群的硝化细菌的检测计数
10、；但无法区别死活菌；操作较复杂，需进行 DNA抽提 等； DNA 抽提效率有待提高，检测灵敏度较其他方法差：需要昂贵的专业仪器 （ PCR 仪，凝胶成像系统等 ） 4。 4 2.5 免疫检测技术 14 免疫检测技术是基于细菌的血清学，利用细菌细胞表面聚合物具有较强免疫原性，产生抗体，结合酶、荧光染料等物质标记的抗体建立起来的一类微生物检测技术。 优缺点：该技术是检测微生物的有力工具，既能定性分析也能定量检测；但可能出现由于抗体与其它微生物交叉反应或与微小颗粒非特异结合而导致的假阳性，以及胞外聚合体的存在使抗体难以和目标微生物结合产生的假阴性，免疫技术的应用也因硝化细菌的 血清学多样性而受到限制
11、。 2.6 变性梯度凝胶电泳 （ DGGE） 15 变性梯度凝胶电泳 （ DGGE） 主要是基于突变型和野生型核酸序列的不同而导致其变性浓度的差异 ， 利用变性梯度胶进行分离。 优缺点：检测片段精准度高，加样量小 ， 重复性好 ， 操作简便 ， 快速；但一般不能确定突变位置 ， 最终还得依赖于 DNA 测序。 Voytek MA等应用特异引物的 PCR扩增方法 并用 特异性探针杂交 表明 ，北极采来的菌为亚硝化细菌， 说明了该亚纲 硝 化细菌的广泛分布 ； Hiorns等采用特异性引物的 PCR 扩增的方法，表明亚硝化螺菌属的特异性及其在环 境中的广泛存在 ； McCaig 等应用多种方法，包
12、括 MPN、 PCR、 DGGE 和序列分析，研究了污染海洋渔场沉积物中氨氧化细菌的群落结构，表明氨含量和污染程度越高其氨氧化细菌含量也越高， DGGE 和 16SrDNA 分析表明主要是亚硝化单胞菌（ Nitrosomonas）类群的增加 ； Hastings 等应用 MPN、PCR、核酸探针杂交等分子生物学技术对富营养化的淡水湖的氨氧化作用进行了季节变化的研究，表明夏天具有较强的硝化作用，水中的氨氧化细菌随 季 节 有较 大 的变 化 ，主 要是 一 些耐 氨 浓度 较 高的 亚 硝化 螺 菌（ Nitrosospira）增加了，而底泥的氨氧化细菌随季节的变化不大 ； Bartsoch等发
13、展了多种单克隆抗体，他们可以分别对应硝化菌的不同属，因此可以对分离菌株的快速鉴定，也可以用于环境样品中这些属的硝化细菌的快速检测 ； 利用不同的寡核苷酸探针通过 FISH 技术研究的结果也可说明在所有的水处理污泥和生物膜样品中都存在大量的硝化螺菌（ Nitrospira），而硝化杆菌（ Nitrobacter）只在 SBR 的生物膜中找到 16。 5 3 N 元素转化细菌的分布研究 从认识 到 湿地 的 重要性开始，人们就对湿地 的 研究投入到了 大量的热情。 不管是动物、植物 还是 微生物等，只要是构成其湿地生态系统的生物多样性，都会去积极 地 研究与总结规律， 并且 试图寻找出改善地球环境
14、最积极有效 的 方法。以N 元素转化细菌为例，反硝化细菌多为厌氧异养型，而硝化细菌基本为好氧化能自养型，所以，在滩涂湿地中，反硝化细菌更多的存在于湿地的淤泥及底层中，而硝化细菌则更广泛的分布于水体中。 早在 20 世纪 60 年代， Menzel 等人 17就曾对百慕大马尾藻海域氮循环的年变化进行过初步研究。近几十年来，随着生态与环境问题日益突出，人们对氮循环在物质循环、生态平衡、环境污染、新生产力估算等方面的重要作用 愈加重视，并开展了广泛的研究。国内研究者也相继在近海各类海域进行了相关研究 18。 3.1 硝化细菌的分布研究 硝化细菌是历史上最早发现的表现为化能无机自养型的微生物，Wino
15、gradsky通过实验证明了这种细菌能以 CO2为唯一碳源而产生有机物质及细胞。从此，关于硝化细菌的研究便不断地发展起来 4。 亚硝化细菌、硝化细菌的生长都非常缓慢，使得分离纯化困难，从而影响了对这类微生物研究的深入，而这类微生物的生态作用 又是不容忽视的 。 随着 分子生物学技术的发展、进步以及在生态学研究领域的应用， 人们渐渐 避开 了 传统的 不完善的 培养技术 ，这为 直接对样品进行检测和研究开辟了崭新的途径。 关于湿地生态系统中硝化细菌的研究也有很多。分布 范玉贞（ 2010）对河北衡水湖湿地的植物根际微生物进行了分布及数量研究，并测得亚硝化细菌丰度为1.84104cells/g，硝
16、化细菌丰度为 1.62104cells/g19；丁浩（ 2007）等也对梦清园芦苇湿地芦苇根际微生物进行了研究，并测得亚硝化细菌丰度为 1.71105cells/g，硝化细菌 4.3104cells/g20；白洁（ 2008）等研究了黄河三角洲滨海湿地不同环境因素如温 度、湿度、 pH 等对亚硝化细菌分布情况的影响，并测得其丰度为8.14102cells/g21；郭如美（ 2006）等对泗洪县潜流式人工湿地微生物群落及脱氮效果进行了研究，并测得亚硝化细菌丰度为 2.18105cells/g22，薛超波 （ 2004）测得杭州湾南岸湿地亚硝化细菌丰度为 9.00105cells/g21。 6 以
17、黄河三角洲为例，通过对黄河三角洲湿地硝化细菌生态特征及硝化作用研究发现不同生态环境中硝化细菌数量分布差别较大，植物区硝化细菌数比非植物区和低潮滩大， 对于 其分布与沉积物有机质用实验室模 拟方法研究了湿地沉积物的硝化作用及影响因素，土壤硝化强度随着生态环境的不同而改变， pH 对硝化强度的影响最为明显，在偏碱性的环境中硝化强度较强，较低的 pH 严重抑制硝化作用；温度变化对硝化强度的影响不如 pH 影响明显，硝化作用最适宜的温度是 28 左右，低温限制 了 硝化作用的进行； 在 低盐度条件下，含盐量的变化对土壤的硝化强度影响不 是很 明显， 而在 高盐度条件下，硝化作用 则 明显受到 了 抑制
18、 21。 3.2 反硝化细菌的分布 研究 19 世纪，人们为了解释施肥土壤中氮的损失，开始了对反硝化的研究。 1856年， Reiset 发现正在 腐烂的动物和植物会不间断的向空气中释放氮气。 1876 年，Meusel deng 等研究发现土壤或水中硝酸盐的分解是由于细菌的作用引起的。1882 年， Gayon 等引入了反硝化这一术语来描述细菌在缺氧时将 N03-还原为 N2的现象。 1886 年， Gayon 等获得了两株反硝化细菌的纯培养物，标志着现代反硝化研究的开始 28。 20 世纪 80 年代， Robertson 等人报道了好氧反硝化细菌和好氧反硝化酶系的存在 23。 目前，越来
19、越多的研究证明细菌好氧反硝化的存在。如产碱菌属（ Alcaligenes）、副球菌属（ Paracoccus）和假单胞菌属（ Pseudomonas）都存在好氧反硝化现象。 2004 年，张光亚等人发现红球菌属（ Rhodococcus）也存在好氧反硝化现象 24。某些反硝化菌也同时具有硝化作用，如 Anshuman A 等从污水处理厂活性污泥中分离得到 8 株 Diaphorobacte 属的菌株均具有同时硝化反硝化作用 25。 通过对各湿地反硝化细菌丰度的研究，不仅能很清楚的认识到各湿地目前的环境状况，还能从中分析出 N 素转化细菌的分布规律，为治理湿地环境打下了坚实的理论基础。范玉贞（
20、2010） 26就曾对河北衡 水湖湿地中的微生物分布进行过研究，并测得反硝化细菌丰度为 1.22104cells/g；丁浩（ 2007）等 19也对梦清园芦苇湿地的反硝化细菌 1.41104cells/g；郭如美（ 2006）等 20泗洪县潜流式人工湿地反硝化细菌 1.81105cells/g。从侧面反应了各湿地的污染情况，王美珍（ 2005） 22对杭州湾南岸湿地养殖场周边生态系统及生物多样性进行了研究，7 反硝化丰度为 1.38105cells/g，薛超波 27则更进一步的对其微生物分布进行研究，并对养殖场现状进行了问题分析。 4 展 望 目前，对于 N 元素转化细菌的研究越来越多，研究方
21、法也层出不穷，但却仍然缺乏一种既价格便宜又能深度检测的方法。为了更深度的了解环境状况，寻求一种更好的研究方法将是一个重要的课题。 随着我们对 N 元素转化细菌的越加了解，必然的，我们对其的利用也将更上一个台阶。而如何去综合考虑其性质配合地理环境与季节、水流等环境因素相结合的办法，以求达到最佳的治理目的，也将是一个长久的话题。 8 参考文献 1 Arrigo k.Marinemicro organisms and global nutrient cyclesJ.Nature,2005,437(7057): 349-355. 2 arrison JA.The Nitrogen Cycle Of M
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