1、1辽宁省科技攻关层次计划（JH2）项目“虾夷扇贝大规模死亡致病病原分离鉴定及 褐色沉积病形成机制研究”可行性研究报告一、 项目提出的目的及意义；(1) 病害是虾夷扇贝大规模死亡的主要直接原因我国从上世纪 80 年代初从日本引进虾夷扇贝，经过近 20 年科学研究和生产实践，在苗种繁育、筏式养殖、底播养殖和扇贝采捕技术等方面取得了关键性的突破，在我国黄海北部形成规模化和产业化养殖，我省长 海县海域迅速发展成为我国虾夷扇贝增养殖最主要海区。然而 2007 年至今，该海区筏养二龄虾夷扇贝已经连续十年发生大规模死亡，每年造成约 2 亿人民币的经济损失，严重影响人民群众收入和社会经济发展。针对扇贝死亡，许
2、多学者从海区环境、养殖密度、遗传育种等角度做出分析，但缺乏持续深入的研究。申请人所在项目组 2008 年至今持续对长海县筏养虾夷扇贝大规模死亡开展相关研究，从流行病学、病原学、免疫学、遗传育种和养殖密度等多个角度展开分析，经过多年流行病学调查和相关实验，我们发现筏养虾夷扇贝大规模死亡具有周期性，有典型发病症状，感染区域广，相关实验表明、水温、养殖密度等影响因子与虾夷扇贝大规模死亡密切相关，但病害是虾夷扇贝大规模死亡的主要直接原因(文章待发)。 2(2) 导致筏养虾夷扇贝大规模死亡的致病病原没有探明长海县筏养二龄虾夷扇贝大规模死亡已经持续 9 年，导致二龄虾夷扇贝筏式养殖产业的规模急剧萎缩，养殖
3、企业和个体户纷纷转型养殖当年苗种和一龄扇贝。这种养殖模式和二龄虾夷扇贝养殖相比利润低，且导致种 贝规模和质量严重下降，进一步影响育苗，最终可能导致整个产业的下滑。因此，探明二龄虾夷扇贝大规模死亡的原因并解决问题对于产业可持续发展具有重要意义，而分离鉴定致病病原探明原因解决问题的科学基础和重要环节。许多学者对此进行过一定研究，国家海洋环境监测中心在虾夷扇贝闭壳肌组织内发现交替假单胞菌属(Pseudoalteromonas sp)并认为其是导致虾 夷扇贝出现脓胞的主要致病病原；申请人所在项目组在虾夷扇贝闭壳肌脓胞中同样分离出一株具有致病性的细菌，经鉴定为查氏弧菌(Vibrio chagasii)(
4、1);也有学者从闭壳肌脓胞中分离出灿烂弧菌(Vibrio splendidus)(2),并认为有一定的致病性。这些研究均从扇贝闭壳肌脓胞中分离出病原菌，但结论有很大差异，并且存在一定争议。闭壳肌脓胞是单一病原感染还是多种病原共同感染？闭壳肌出现脓胞是否是导致虾夷扇贝大规模死亡的唯一原因？这些问题也都没有得到有效解决，因此导致筏养虾夷扇贝大规模死亡的致病病原需要全面深入的进行系统研究，具有重要科学意义，对于产业现状也有重要意义。参考文献(1) 滕炜鸣, 李文姬, 张明,等. 虾夷扇贝脓胞病病原的分离、鉴定与致病性 J. 水产学报, 2012, 36(6):937-943.3(2) Rui Liu
5、, Limei Qiu, Zuoan Yu, et al. Identification and characterisation of pathogenic Vibrio splendidus from Yseeo scallop(Patinopecten yessoensis) cultrued in a low temperature environmentJ. Journal of Invertebrate Pathology, 2013, 114:144-150(3) 虾 夷扇 贝闭壳肌出现脓胞可能不是大规模死亡的唯一症状连续多年流行病学调查发现，闭壳肌出现脓胞是筏养二龄虾夷扇贝大规
6、模死亡的典型发病症状，得到学者一致认可。然而申请人通过海区调查和室内模拟实验表明，外套膜颜色发黄和贝壳内侧出现褐色沉积可能也是虾夷扇贝大规模死亡的典型症状。贝壳内侧出现褐色沉积有学者认为可能是扇贝互相碰撞导致外套膜受损，在恢复过程中分泌的物质。因此多年来对此症状一直没有进行研究。2016 年海区调查和室内模拟实验过程中，申请人发现实验中所有死亡扇贝内壳均有褐色沉积，存活下来但状态不好的扇贝在贝壳内侧也存在褐色沉积；而根据海区调查结果，外套膜发黄的扇贝在海区死亡率很高。因此，外套膜发黄且贝壳内侧有褐色沉积很可能不是由于机械损伤导致，而是由于病原感染产生的典型症状，和虾夷扇贝大规模死亡相关性很大，
7、有必要对其产生原因及可能致病病原进行相关研究，国内外对此也很少有相关研究。二、 与项目相关的国内外发展概况及市场需求分析；海洋贝类病害研究最早见于 1919 年，Danglade 在牡蛎体内发现一种寄生性蠕虫 (3)。20 世纪 40 年代，墨西哥湾养殖区的牡蛎大规模死亡，其后蔓延到整个东部沿海地区，通过对牡蛎进行病理学分析，研究者认为引起牡蛎大规模死亡的原因是一种派金虫( perkinsus marnius)的海洋4鞭孢簇虫，促使美国、法国等相继开展了广泛的海洋贝类病害学研究 (4)。1987 年法国首次报道了蛤弧菌(Vibrio tapetis),它引起养殖的菲律宾蛤仔(Ruditapes
8、 philippinarum)亲贝发生大规模死亡。值得注意的是该病主要特征就是外套膜和贝壳边缘之间沉积几层褐色的环状物 (5)。这和虾夷扇贝大规模死亡的症状有些相似。1991 年，在北美地区养殖的太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)夏季发生大规模死亡，主要症状是外套膜有病灶性棕色病变区域或部分组织有绿黄色结节，这和虾夷扇贝外套膜的褐色沉积也比较类似，而粗形诺卡氏菌(Nocardia crassostreae)经鉴定是其致病菌。 (6)项目组在虾夷扇贝闭壳肌 脓胞中分离出的致病病原查氏弧菌，首次发现是在希腊养殖的轮虫体内，它和灿烂弧菌在分类地位上非常相近 (7)。我国贝类病害研究相对
9、较晚，但近年来，随着我国海洋贝类养殖规模的迅速发展，养殖贝类大规模死亡问题日益严重 (8)。20 世纪 90 年代，栉孔扇贝(chlamys farreri)暴发过大规模死亡，宋微波 (9)、王崇明 (10)等认为一种球形病毒粒子为导致栉孔扇贝大规模死亡的直接原因；海湾扇贝(Argopecten irradians)、贻贝( Mytilus galloprovin-cialis)和杂色鲍(H.diversicolor)等都曾暴发过大规模病害，弧菌、球形病毒等是其感染病原 (11)。进入 21 世纪，河北秦皇岛海域暴发 大规模褐潮，导致海湾扇贝稚贝滞长，甚至发生死亡。南方的鲍也因为高密度养殖发生
10、大规模病害。我省虾 夷扇贝自 2007 年以来也发生了大规模死亡现象，多年来申请人所在团队一直对此进行长期研究，并取得一定进展，我们在虾夷扇5贝脓胞中首次分离出可能的致病菌查氏弧菌，同时在体内发现了病毒粒子并进行了病原学相关研究和流行病学调查 (12);分析了水温、饥饿和病害对虾夷扇贝大规模死亡的影响 (13);探讨了长海县海水环境和养殖模式与虾夷扇贝大规模死亡的关系，调查虾夷扇贝浮筏养殖海区中浮游病毒丰度 (14)，对浮筏养殖海区表层沉积物和 虾夷扇贝大规模死亡的关系进行了初步分析 (15)，通过不同养殖密度组 的设置初步证明养殖密度和扇贝大规模死亡的相关性 (16)。在现有工作基 础上，
11、对虾夷扇贝大规模死亡致病病原进行分离鉴定并建立快速检测技术，是后续科研工作的基础，也是对我省筏养虾夷扇贝产业一个科学交待。参考文献(3) Danglade, E. The flatworm as an enemy of Florida oystersJ, Govt. print, 1919.(4) Crage, A, Powell, E, Fay ,R, et al. Distribution of Perkinsus marinus in Gulf Coast oyster populations. Estuaries and CoastsJ, 1989,12(2):82-91(5) Pai
12、llard, C, Maes, P, Oubella,R.Brown ring disease in clamsJ. Annual Review of Fish Disease, 1994,4:219-240(6) Friedman, C, Beaman,B, Chun, J, et al. Nocardia Crassostreae sp nov., the causal agent of nocardiosis in Pacific oystersJ. International of Journal of Systematic Bacteriology. 1998, 48:237-246
13、(7) F.L. Thompson, C.C. Thompson, Y. Li, et al. Vibrio kanaloae sp. nov., Vibrio pomeroyi sp. nov. and vrbrio chagasii sp. nov. , from sea water and marine animalsJ, International journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2003.53:753-759(8) 吴信忠, 潘金培, 江静波. 热带海洋珍珠贝类立克次体(RLO)并研究 V11 大珠母贝育苗期幼
14、虫群体 RLO 病流行病学研究J. 海洋学报, 2003, 25(2):93-98(9) 宋微波 ,王崇明,王秀华,等. 栉孔扇贝大规模死亡的病原研究新进展J. 海洋学,2001,25(12):23-26.(10) 王崇明,王秀华,艾海新,等. 栉孔扇贝大规模死亡致病病原的研究 J.水产学报,2004,28(5):547-553.(11) 张国范 , 李霞. 我国养殖贝类大规模死亡的原因分析及防治对策J. 中国水产, 1999, 9:34-39(12) 于佐安, 李文姬, 张明,等. 虾夷扇贝大规模死亡的流行病学研究及可能致病因子的探讨 J.中国海洋大学学报, 2013, 43(6):052-
15、057.(13) 于佐安, 李大成, 王笑月 , 等. 水温、饥饿和病害对长海县筏养虾夷扇贝大规模死亡影响的初步研究(文章待发)6(14) 于佐安, 李文姬, 张明,等.大连市长海县虾夷扇贝养殖海区浮游病毒丰度的研究 J .水产学报, 2011, 35(6)：911-917(15) 于佐安, 王笑月, 李大成 , 等. 长海县筏养区表层沉积物与虾夷扇贝大规模死亡相关性分析J. 河北渔业, 2016, 12:17-23(16) 于佐安, 谭克非 , 张明, 等. 筏式虾夷扇贝养成期不同密度生长与经济效益分析J. 水产学报, 2016, 40(10):1624-1633三、 主要攻关内容及技术路线
16、（技术可行性分析）；(一) 主要攻关内容1 虾夷扇贝脓胞病病原分离鉴定在扇贝大规模死亡高峰期，从虾夷扇贝闭壳肌脓胞中分离可疑致病病原，进 行回归感染，确定具有致病性的病原，通过细菌常规鉴定和16srRNA 基因序列测定及系统发育学分析，鉴定其分类地位。根据柯氏法则，结 合流行病学调查结果，确定导致虾夷扇贝闭壳肌出现脓胞的致病病原。2 虾夷扇贝“褐色沉积 病” 病症形成机制研究根据虾夷扇贝外套膜边缘发黄，贝壳内侧有褐色沉积这一症状，暂将该症状命名为“褐色沉 积病” 。分析褐色沉 积物的结构和物质组成；揭示病变外套膜组织病理学、细胞病理学变化和褐色沉积之间的联系；确定病症产生原因是物理损伤还是致病
17、病原。对导致虾夷扇贝“褐色沉积病” 的致病病原 进行鉴 定。探讨虾夷扇贝脓胞病、虾夷扇贝“褐色沉积病”和虾夷扇贝大规模死亡之间的关系。3 致病病原全基因组测序及快速检测技术的建立进行全基因组测序，对序列进行比对分析，找到保守特异的区域，设计特异性引物，建立 PCR 检测技术。7(二) 技 术可行性分析1、虾夷扇贝脓胞病病原分离鉴定(1)样品收集在发病高峰期 6 月份-7 月份，采集虾夷扇贝样 品，低温运回实验室，解剖观 察闭壳肌有无脓胞，收集脓胞及闭壳肌边缘组织接种于培养基上。(2)培养基 选择面对未知病原，培养基应同时选择几种通用培养基和选择性培养基。本研究中选择海洋盐琼脂培养基(MSA-B
18、)、海洋琼脂 2216 培养基(MA2216)、TCBS 霍乱弧菌培养基(TCBS)和胰蛋白 胨大豆琼脂培养基(TSA)。(3)接种培养将带有病原的组织接种于四种培养基后，统计菌落形态和数量，根据细菌分离中“ 优势理 论” ，将四种培养基中均表 现为优势生长的细菌或某个培养基中表现为优势生长的细菌鉴定为可疑致病病原。将可疑致病病原菌菌落挑取在新培养基上进行纯培养。(4)回归 感染在适宜水温条件下，选择健康有活力的虾夷扇贝，将一种或几种可疑致病菌扩大培养进行浸浴感染实验，根据“ 科赫法则” 确定可疑病原菌是否为致病病原。(5)细菌 鉴定8对致病病原菌的细菌形态特征、培养特征和生理生化特性等进行研
19、究。同时 通过 16srDNA 测序进行分子鉴定。2、虾夷扇贝“ 褐色沉积病”发生机制研究(1) 样 品采集和 处理发病高峰期 5 月-8 月期间，采集虾夷扇贝样 品低温运回实验室。取发黄外套膜组织和健康外套膜组织用组织固定液、电镜固定液分别固定，从贝 壳内侧收集褐色沉积物质。同时取发黄外套膜组织接种培养基上。(2)组织 切片和超薄 电镜切片观察通过健康外套膜组织和发黄外套膜组织切片观察确定外套膜边缘发黄的原因。通过超薄电镜切片观察外套膜病灶处是否存在病毒粒子或细菌及其他微生物。(3)褐色沉 积 物质结构分析利用扫描电子显微镜、傅里叶红外光谱分析以及 X 射线衍射分析等方法对褐色沉积物质的微结
20、构进行分析，通过和贝壳结构对比，结合组织切片和超薄电镜切片观察结果，分析褐色沉积物质和外套膜之间的关联。(4)外套膜受损模拟实验取外套膜正常、健康有活力的虾夷扇贝，利用贝壳、镊子或剪刀等工具使外套膜组织部分受损，在适当水温条件下进行模拟养殖实验，判断外套膜受损是否是外套膜发黄和贝壳内侧产生褐色沉积的主要原因。9(5)病原分离鉴定若证明外套膜受损并不是“褐色沉积病” 主要原因， 则采取第一部分实验方案分离鉴定虾夷扇贝“褐色沉积病 ”致病病原。(6)回归 感染 实验将虾夷扇贝脓胞病致病病原和虾夷扇贝“褐色沉积病” 致病病原共同感染健康虾夷扇贝，观察发病症状，统计死亡率。结合各自病症病原回归感染实验
21、结果，依据“ 科赫法则”判断虾夷扇贝大规模死亡的致病病原，分析脓胞病和“ 褐色沉积病”与大规模死亡之间的关系。3 致病病原全基因组测序及快速检测技术的建立(1) 全基因组测序提取致病病原总 DNA,构建 16sRNA 文库，进行全基因组测序，并进行数据拼接。(2) 特异性引物设计对全基因组进行数据拼接后，分析序列找到保守区，通过 NCBI 进行 BLAST 比对， 设计 特异性引物。(3)检测 技术 的建立通过对 PCR 模板浓度、反应条件和特异性等反应条件的摸索，建立 PCR 快速 检测技术 。或者进一步优化建立荧光实时定量 PCR 检测技术。4 技术路线图10流行病学研究 病原学研究 室内模拟实验病害是导致虾夷扇贝大规模死亡的主要直接原因，且主要致病病原很可能是细菌主要症状主要症状虾夷扇贝闭壳肌脓胞病 虾夷扇贝“褐色沉积”病发生机制研究样品采集和组织固定组织切片超薄电镜观察褐色沉积物质结构分析外套膜受损模拟实验虾夷扇贝“褐色沉积”病是病原导致虾夷扇贝“褐色沉积”病是外套膜受损导致致病病原分离鉴定 快速检测技术建立样品采集培养基选择及接种培养回归感染细菌鉴定 全基因组测序序列分析及比对设计特异性引物反应条件优化致病病原研究致病病原研究
