1、舒胸片血清药物化学的初步研究雷志丹 黄莺 雷志钧 夏新华 （ 湖南中医药大学药学院，湖南长沙，410208）摘 要:【目的】对舒胸片进行血清药物化学研究。【方法】采用血清药物化学的研究方法，采用 SD 大鼠灌胃给药，分别于给药一定时间后取血，测定复方提取液及其各单味药提取液血样的 HPLC 色谱图，并进行测定的方法学考察与血清指纹图谱的分析。【结果】舒胸片血清 HPLC 指纹图中可检出 15 个成分，其中血清本身具的成分 4 个，其余 11 个可能来自复方的原成分及其代谢产物。舒胸片中已知的 6 种主要成分（川芎嗪、羟基红花黄花素 A、阿魏酸、三七皂苷 R1、人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Rb1
2、）均可从血清中检出，表明为入血成分（或血中移行成分），舒胸片中已知的 6 种主要成分（川芎嗪、羟基红花黄花素 A、阿魏酸、三七皂苷 R1、人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Rb1）包含在其中，表明均为入血成分（或血中移行成分）。在血清 HPLC 指纹图谱与复方 HPLC 指纹图谱的基础上，建立了舒胸片的表观血清指纹图谱。【结论】所建立的舒胸片提取液 HPLC 指纹图谱测定方法操作简便，重复性好，同时所建立的指纹图谱可反映舒胸片药材中多成分的信息，故本研究为有效地控舒胸片的内在质量提供了较为可靠的方法，并为该制剂的深入研究奠定了良好的基础。关键词：舒胸片 血清药物化学 指纹图谱 HPLC Prelim
3、inary Study on Serum Pharmacochemistry of Shuxiong TabletsLEI zhi-dan ， Huang-yin ，LEI zhi-jun ，XIA Xin-hua Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Hunan ,Changsha, 410208Abstract:Aim：Perorm serum pharmacochemistry study on extract in Shuxiong Tablets. Methods：HPLC research on the serum fin
4、gerprints chromatograms of Shuxiong tablet extract 基金项目：湖南省教育厅重点课题（编号：07A049） ，湖南省科技厅科学研究项目（编号：2008sk3068）作者简介:雷志丹（1972-），女，湖南安乡人，在读博士生，主要从事中药新制剂工艺与质量标准的研究。通讯作者：夏新华， Tel：0731-88458305 ，E-mail:。based on blood serum chemical pharmacy: after SD rats are administrated by gavages, samples are taken respe
5、ctively after certain periods and measures are made on serum chromatograms of both mixed extracts and each single extract, then analysis is made. including 16 components can be detected in the fingerprint serum, including 5 of the serum itself, and the other 11 may come from the original compound an
6、d their metabolites. Conclusion：the 6 major components of Shuxiong tablet (ligustazine、hydroxysafflor yellow A、ferulic acid、notoginsenoside R1、ginsenoside Rg1、ginsenoside Rb1) which are in the blood or transitional elements in the blood. The serum chromatograms of Shuxiong tablet are established on
7、the basis of serum HPLC fingerprint chromatograms and compound HPLC fingerprint chromatograms. Results：HPLC research on fingerprint chromatograms is simple and reproducible, and the fingerprint chromatograms can reflect multi-ingredients in the Shuxiong tablet, therefore, this study provides a relia
8、ble method for the effective quality control of Shuxiong tablet, and prepares for in-depth study on the tablet. Key words： Shuxiong Tablets；serum pharmacochemistry, fingerprint，HPLC从内服药而言，不论中药复方多大、成分多少，只有进入血液的成分（即血中移行成分）才有可能成为有效成分。因此，通过分析口服给药后血清中成分，确定中药及复方的体内直接作用物质，将成为快速、准确确定中药药效物质基础的有效途径。中药血清药物化学正是
9、基于以上论述而建立并发展的。王喜军 13 等于1997年正式提出了“中药血清药物化学的概念及理论” ，血清药物化学主要是研究血清中的化学物质，观测血清中外源性活性物质及其作用和代谢规律。舒胸片系中国药典2005版一部收载的复方中药制剂 4，由三七、川芎、红花三味中药制备而成，各药味主要有效成分明确，并含有皂苷类、黄酮类、生物碱、有机酸等多种不同结构类型的有效成分。本实验建立了一种简单、可靠的HPLC方法，对舒胸片提取液的血清药物化学进行动态跟踪分析，同时这种方法用于建立舒胸片提取液指纹图谱以及给大鼠灌胃一定剂量的舒胸片提取液后所获得的血清药物化学动态指纹图谱。通过对舒胸片提取液的指纹图谱与血清
10、药物化学动态图谱中峰的相关性研究，阐明其血中移行成分、代谢产物以及方剂的配伍意义，从而有的放矢地改善其生产工艺，达到提高临床疗效的目的，初步揭示出舒胸片提取液在大鼠体内的主要药效物质基础。1 仪器与试药：1.1 仪器与设备： Agilent 1200 高效液相色谱仪， SK3300H 超声仪（北京医用设备厂） ，RE-52A 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂） ，80-1 型离心沉淀机（江苏金坛市中大仪器厂） 。1.2 药品与试剂 乙腈为色谱纯(Tedi company，批号：811903)，水为超纯水，磷酸（分析纯，湖南师大化学试剂厂） ，阿魏酸对照品(批号：110733-200611)，羟基
11、红花黄花素 A 对照品(批号：110615-200516)，人参皂苷 Rg1对照品(批号：110703-200322)，人参皂苷 Rb1对照品(批号：110704-200318)，三七皂苷 R1对照品(批号：110745-200415)，对照品均购自中国药品生物制品检定所，供含量测定用。三七，川芎，红花均由湖南九芝堂药业有限公司提供。1.3 实验动物 SD 大鼠，雌雄各半，体重 200220g，由湖南中医药大学动物中心提供。动物合格证号为：SCXK(湘 2009-0004)2.实验方法与结果2.1 提取液的制备2.1.1 舒胸片混合提取液的制备:三七用 70%乙醇回流提取二次，加醇量分别为 8
12、 倍、6 倍，提取时间分别为 2 小时、1.5 小时，收集醇提液，浓缩至每 1ml 含 0.5g 生药；川芎加 10 倍量 95%乙醇煎煮2 小时，滤过，滤液另存，药渣与红花加 10 倍量水煎煮二次，每次1 小时，合并三次煎液，滤过，滤液静置 24 小时，取上清液滤过，滤液浓缩至每 1ml 含 0.5g 生药，与上述三七浓缩液合并。取混合液1ml 加色谱甲醇稀释至 10ml，过 0.45m 滤膜，即得给药样品供试液。2.1.2 舒胸片各单味药提取液的制备：取三七、川芎、红花适量，按2.1.1项下方法制成各单味药提取液。取各单味药提取液1ml加色谱甲醇稀释至10ml，过0.45m滤膜，即得各单味
13、药样品供试液。2.1.3灌胃液的制备：川芎、三七浓缩液置于76干燥箱干燥24h，得浸膏，取各浸膏的一半分别溶于100ml水中得川芎、三七的单味药灌胃液，红花浓缩至200ml，取100ml得红花单味药灌胃液，川芎三七浸膏一半加入100ml红花水提液中溶解，得舒胸片混合灌胃液。2.2 血清样品的制备2.2.1 给药方案：以舒胸片临床剂量折算成动物的等效剂量，2ml次，一天一次连续灌胃给药（舒胸片混合提取液及各单味药提取液）12天，并设空白对照组（灌胃给予蒸馏水） 。2.1.2 空白血清及含药血清样品的制备 5-8：各组分别于末次给药后 0.5h、1h，从大鼠眼眶取血，静置 24h 待血凝结后，离心
14、20min(3000rmin-1)，取上清液，即得。2.3 血清指纹图谱的测定2.3.1 供试品的制备 9-11：取上述各种血清样品，加入色谱甲醇，超声20min，沉淀除去蛋白，离心后取上清液，过0.45m微孔滤膜，供HPLC分析。 2.3.2 参照物的制备：分别取盐酸川芎嗪、阿魏酸、羟基红花黄色素A、人参皂苷Rg l、人参皂苷Rb 1与三七皂苷R 1对照品适量，用甲醇溶解分别制成适当浓度的溶液（或混合溶液） 。2.3.3 色谱条件：KromasilC l8柱(2004.6mm，5m)；以0.05磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长：203nm；柱温：3
15、0；流速：1mLmin -1；进样量为10L，分析时间为70min。表 1 梯度洗脱程序时间（min） 流动相 A（%） 流动相 B（%）08 95 5845 95 62 5 384570 62 60 38 402.3.4 供试品的测定：按上述色谱条件，取供试品溶液与参照物溶液适量，分别注入液相色谱仪，记录色谱图（见图114） 。min0 10 20 30 40 50 60mAU -10102030 VWD1 A, 丹=360 nm, T (E:丹丹丹丹DEF_LC 201-2-18 -04-8032-10.D) 2.43859 2.6980 4. 8.37 17.96 23.17460 36
16、.824 41.96 45.2163 7.048 9.523 59.613 .4图1 空白血样HPLC色谱图min0 10 20 30 40 50 60mAU -101203405607 VWD1 A, 丹=360 nm, T (E:丹丹丹丹DEF_LC 201-2-18 -04-8031-201.D) 2.4860931 4.5 8.54 12.06 18.349 2.819 30.68 35.07 36.8 41.86 45.9 61.52图2 空白血样+对照品HPLC色谱图min0 10 20 30 40 50 60mAU -101203405607 VWD1 A, 丹=360 nm,
17、T (E:丹丹丹丹DEF_LC 12-7 18-59-2804-01.D) 2.439576 .8 4.957 8.514 12.34 18.374 2.74 26.35 30.76 35.02 6. 41.82065 4.8537 49.528 56.409 59.783 61.0 6.017图3 30min取血复方提取液血样HPLC色谱图min0 10 20 30 40 50 60mAU -2024068012014 VWD1 A, 丹=360 nm, T (E:丹丹丹丹DEF_LC 201-2-19 5-40-301-01.D) 1.28076935 . .4 7.65 1.435 18
18、.047 2.685 26.1 30.61 35.260948 3.12806 4.5 .87502 46.97580 48.93 48.760 5.736 .4 58.316 58.64 0.1 67.85图4 1h取血复方提取液血样HPLC色谱图min0 10 20 30 40 50 60mAU -1-505105205 VWD1 A, 丹=360 nm, T (E:丹丹丹丹DEF_LC 201-2-19 5-40-30-301.D) 1.9024356 2.6537 5.01 7.6 8.5 1.06 2.7 18.36 30.796 32.01 36.840 37.92 .29 46.
19、39 46.7931 7.1 49.7 59.42 61.3 63.19图5 30min取血的川芎血样HPLC色谱图min0 10 20 30 40 50 60mAU -2-15-0-50510520 VWD1 A, 丹=360 nm, T (E:丹丹丹丹DEF_LC 201-2-19 5-40-304-01.D) 2.43856 2.7180 5.03 8.604 18.52 30.82 43.751 4.9 56.870 59.348 61.2图6 1h取血的川芎血样HPLC色谱图min0 10 20 30 40 50 60mAU -505101520 VWD1 A, 丹=360 nm,
20、T (E:丹丹丹丹DEF_LC 12-7 18-59-2801-01.D) 2.43581 2.6930 4.7 8.301 17.9 35.102 36.41 41.8925076 3. 4.980532 .59 59.63图7 30min取血的三七血样HPLC色谱图min0 10 20 30 40 50 60mAU -10-505101520 VWD1 A, 丹=360 nm, T (E:丹丹丹丹DEF_LC 201-2-19 5-40-305-01.D) 2.435 .6 2.659 5.04 8.607 18.560 19.02386 34.967 .24 . 45.36810 7.
21、49.63 61.7图8 1h取血的三七血样HPLC色谱图min0 10 20 30 40 50 60mAU -1-505101520 VWD1 A, 丹=360 nm, T (E:丹丹丹丹DEF_LC 12-7 18-59-2803-01.D) 1.942038 .5 2.686 4.937 7.509 8.47 18.34 2.758 27.5 41.76285 4.9图9 30min取血的红花血样HPLC色谱图min0 10 20 30 40 50 60mAU -10-505101520 VWD1 A, 丹=360 nm, T (E:丹丹丹丹DEF_LC 201-2-19 5-40-30
22、7-01.D) 1.07689524 .3 . 2.60 4.953 8.614 18.73 21.479 2.8 3. 25.690 7.38204516 9. 37.940 41.82 .75 46.571 49.153 49.856 61.308 2.95 6.04图10 1h取血的红花血样色谱图min0 10 20 30 40 50 60mAU 020406080 VWD1 A, 丹=360 nm, T (E:丹丹丹丹DEF_LC 12-7 18-59-2801-701.D) 1.28579603 .4 .54 .2 .83 5.4906 8.56 12.39406 .58 1.234
23、6.9 17.508 18.427 9.26075 .43 .9 21.50967 21.9642.8593.4021 .569 .280 7.2356 8.14 .2943 0.30.8932.18 .53 3.0 .0 4.5 35.148 35.42 3.826 7.0 38.910 39.7014 .821963 4.70 .4936 5.2 .0 46.78 47.6 .93815 .047 .62 5.73 61.5463.72967.94图11 复方混合提取液HPLC色谱图min0 10 20 30 40 50 60mAU 020406080 VWD1 A, 丹=360 nm,
24、T (E:丹丹丹丹DEF_LC 12-7 18-59-28013-901.D)0.473 2.16 .5897 3.4 .8052 8.612 13.0 15.69 7.18209 18.59 .5746209 21.49 .5369826 24.08 4.05 2.69 .75 28.34091 .76230.9731.5986 .397 4.1 5.2683 .7 .90 40.26 1.85427 .18 46.23 46.973 48.795 52.9463.92768.05图12 川芎提取液HPLC色谱图min0 10 20 30 40 50 60mAU -1010203040506
25、070 VWD1 A, 丹=360 nm, T (E:丹丹丹丹DEF_LC 12-7 18-59-28012-801.D) 1.902365 .4 2.70 .7 4.91 13.76405 14.8 .602 .93 16.347 .982 1.4 27.59 29.40 . 34.92 36.28 38.962 41.85 43.8926 5.18 .4 7.92 4.0965 .31 59.46图13 三七提取液HPLC色谱图min0 10 20 30 40 50 60mAU 010203040506070 VWD1 A, 丹=360 nm, T (E:丹丹丹丹DEF_LC 12-7 1
26、8-59-28014-01.D)1.42790 .3 .678425 .61 . .82 8.56 14.28365 .012843 7.965 .1196 20.84 20.6 .15377 2.2.9162.4 4.1965 2.0821 7.96 .4788 .30 2.95 .173068 . 2.5 3.9 3.67048 5.2 35.91 6.07 3.487 38.745 41.807 45.32946.278 49.28 60.39图14 红花提取液HPLC色谱图2.4 测定的方法学考察2.4.1 精密度实验 取同一批次混合血样，连续进样 6 次，记录色谱图，结果各共有特征色
27、谱峰相对保留时间的 RSD 均1% ，相对峰面积的 RSD 均3% ，表明供试品进样精密度良好。2.4.2 稳定性实验 取同一批次混合血样，分别于0、2、4、8、12、24 h 进样，记录色谱图，结果各共有特征色谱峰相对保留时间的 RSD1% ，相对峰面积的 RSD3% ，表明供试品在测定的 24h 内稳定性良好。2.4.3 重复性实验 取同一批混合血样，按上述方法制备 6 份供试液，进样，记录色谱图，结果各共有峰相对保留时间的 RSD1% ，相对峰面积的 RSD3%，表明本测定方法重复性良好。2.5 血清指纹图谱的建立根据10批样品在多个测试条件下获得的测试结果，确定共有指纹峰（相对保留时间
28、、峰面积比值） ，选取特征指纹峰群，建立舒胸片的血清指纹图谱，如图15所示。2.5.1 共有指纹峰的标定：舒胸片 HPLC 血清指纹图谱中，共有指纹峰 15 个。以保留时间约为(59.3170028)min (12 号峰)为参照峰（S 峰） ，将各色谱峰保留时间与同一图谱中 S 峰的保留时间比较，其比值为各色谱峰的相对保留时间。2.5.2 共有指纹峰面积比：以参照物峰（S峰）面积为1，计算各共有指纹峰面积与S峰面积的比值。11图15 舒胸片HPLC血清指纹图谱3.川芎嗪 5. 羟基红花黄花素A 7.阿魏酸 8.三七皂苷R 1 9.人参皂苷Rg 1 11.人参皂苷Rb 12.6 血清指纹图谱的信息分析 从混合血样与空白血样、空白+对照品血样对比可见，混合血样中共分离有16个色谱峰，3、5、7、8、9、11号共有指纹峰所对应的成分依次为舒胸片中六种主要成分川芎嗪，羟基红花黄花素A、阿魏酸、三七皂苷R 1、人参皂苷Rg 1、人参皂苷Rb 1；与空白+对照品血样min0 10 20 30 40 50 60mAU -10010203040506070VWD1 A, ?=360 nm, TT (E:?DEF_LC 12-17 18-59-28004-0401.D)1412131111 2 34 5 67 8 9 1015
