1、电子显微镜技术方 周 溪 潘亮亮 胡万里透射电子显微镜 扫描电子显微镜电子显微镜室温州医学院生物学实验教学中心前 言自从光学显微镜出现以后，人类打开了微观世界的大门，看到了很多用肉眼所看不到的微小物体，例如细胞、细菌等，使人眼睛的分辨力由 0.2mm 提高到0.2m。但是，光学显微镜由于光线波长的限制，它的分辨极限是 0.2m，有效放大倍数最高不超过 2000 倍，如果想要看到更小的物体，它就无能为力了。从 20 世纪 30 年代开始，人们利用工业技术的发展，成功地研制了电子显微镜，它的出现，使人们能在超微结构或原子的尺度上观察研究物体的结构，人们的观察从宏观世界进入了超微结构或原子级的微观世
2、界。与许多伟大的发明一样，电子显微镜的发明，也经历了那个时代艰苦的历程。在光学显微镜发明长达 300 年的时间里，由于光波波长的限制，直接限制了光学显微镜的分辨能力，始终难以突破 1000 倍的放大倍数。寻找更短波长的光源成为了科学家们呕心沥血的漫长征程。1924 年，法国物理学家 Broglie 提出了“电子与光一样，具有波动性“的假说，他证明了任何一种粒子在快速运动时，必定都伴有电磁辐射，辐射的电磁波长与粒子的运动速度成反比，并计算出电磁波长为 0.005nm。1926 年，德国科学家 Busch 发现了带电粒子在电场或磁场中偏转聚焦的现象，类似于光线通过透镜可被聚焦一样。由此奠定了电子显
3、微镜的理论基础。19281931 年间，德国年轻的大学生 Ruska 测量了磁透镜的聚焦特性，并开展了电子放大成像的研究，终于在 1938 年成功研制了世界上第一台真正的电子显微镜，放大倍数为 1200 倍，被誉为电子显微镜之父,并在 1986 年获得诺贝尔奖。电子显微镜的发明被誉为 20 世纪最重要的发明之一。1939 年，德国 Siemens 公司生产了第一台作为商品用的透射电镜，分辨率为10nm 左右。但其体积庞大，无法进一步推广。20 世纪 50 年代初到 60 年代末期，电镜发展很快，从性能到构造都得到很大的改进，特别是分辨本领得到大幅度提高，达到 1nm 左右，到 80 年代的分辨
4、率已接近 0.1nm，最新研制的超高压透射电镜的分辨率可达 0.005nm。自从 1938 年第一台电镜在德国问世以来，在短短的几十年时间里，电镜技术取得了飞跃的发展，在医学、生物学、材料学、地质学、考古学、天文学等许多领域中得到了广泛的应用。在现代医学、细胞超微结构、分子生物学、基因组学等学科的迅速发展，出现了更适合生物医学研究的新型电镜。在生命科学方面，电镜的应用为阐明组织细胞的结构和功能起了巨大的作用，已成为医学科学研究和临床疾病诊断的重要工具。随着科学技术的不断发展，电镜样品制备技术也得到飞速发展。在透射电镜超薄切片基础上，又相继出现负染色技术、电镜放射自显影技术、免疫和细胞化学技术、
5、电镜核酸原位杂交技术等；在扫描电镜常规技术基础上，也出现了冷冻割断技术、蚀刻复型技术、管道铸型技术、电子探针技术等。在透射电镜原有的基础上安装各种测试仪器如能谱仪（EDX） 、波谱仪（WDX）等，出现了各种分析型透射电镜；还有加速电压在 200kV 以上的高压电子显微镜以及加速电压在 500Kv 以上的超高压电子显微镜；由于压电传感器的发明，使得机械探针的定位性增强，出现了扫描探针显微镜系列（包括扫描隧道显微镜、原子力显微镜、激光扫描共聚焦显微镜、扫描光子显微镜、扫描热显微镜、静电力显微镜等十几种类型） ，其中在生命科学中应用较多的是扫描隧道显微镜、原子力显微镜和激光扫描共聚焦显微镜。第一章
6、透射电子显微镜一、与透射电镜有关的几个基本概念1、光的衍射现象： 由于光具有波动性，当光线通过小孔或小孔光源经光学系统成象会产生衍射。其图案是:中央部分一个亮斑，在其周围有明暗交替的园环，即埃里（Airy）圆盘,其中心亮斑的能量大约占入射光源能量的 84%（如图所示） 。2、瑞利准则光线通过二个比较靠近的小孔时，这二个小孔的衍射图会重叠在一起。当一个衍射图的中央亮斑正好落在另一个衍射图的第一暗环中心时，这二个点刚可以分辩。这就是显微镜分辩本领的瑞利准则。3、分辨率、分辨率分辨率又称分辨本领，它表示仪器的分辨能力足以分辨率又称分辨本领，它表示仪器的分辨能力足以清楚分开的两点或两个质点圆心间最小距
7、离的本领。它清楚分开的两点或两个质点圆心间最小距离的本领。它与光的性质，即衍射、干涉及透镜像差有关。与光的性质，即衍射、干涉及透镜像差有关。可以这么说，显微镜分辩本领是由其产生的衍射图可以这么说，显微镜分辩本领是由其产生的衍射图中央亮斑半径中央亮斑半径 D（分辨能力）的大小而定：（分辨能力）的大小而定：光学显微镜的分辨力可以根据阿贝公式来计算，即光学显微镜的分辨力可以根据阿贝公式来计算，即D = 瑞利准则图示瑞利准则图示 这里以油镜为例推算其分辨本领：这里以油镜为例推算其分辨本领：光的平均波长为光的平均波长为 = 500nm = 0.5m油的介质折射率或系数油的介质折射率或系数 N = 1.5
8、物体与物镜所形成夹角的半数物体与物镜所形成夹角的半数 90 则中央亮斑的半径则中央亮斑的半径 D200nm = 0.2m一般人眼在明视距离 250mm 处能分辨 0.2mm 的两点，油镜最小能分辨 0.2m的两点，则油镜理论最大放大能力为：0.2mm/0.2m = 10 34、电磁波长真空中相对集中并高速运动着的电子流称为电子束。电子束具有粒子性和波动性，它能产生一定波长的电磁波，其所产生电磁波长由下列公式表示，即：= n m其中 为电磁波长，V 为加速电压。由此可见，电子束的波长完全取决于加速电压，加速电压越高，则得到的电子波长越短，得到的分辨本领也就越高。假如一台电镜的 V = 50kV
9、时，则 0.005nm= 0.000005m 是光的=500nm的 10 万分之一，大大减少了衍射光斑 D 的值。又假如一台电镜的点分辨率为0.1nm,那么其理论放大倍数为 0.2mm/0.1nm = 2x106 ，而实际有效放大倍数为1.6x106。我室的 H-7500 型透射电镜的点分辨率为 0.24nm，则其理论放大倍数为0.2mm/0.24nm = 0.83x106 ，而实际有效放大倍数只有 0.6x106。电镜的分辨率除了受电子束加速电压高低的影响外，还受很多方面的影响，如电镜本身部件的加工精度（各种透镜尤其是物镜的质量精度） 、电镜的工作状态（如加速电压、真空度、电镜的运行模式等）
10、 、电镜室内及周边情况（如湿度、温度、电镜台的抗震动能力、电磁干扰等）以及样品制作的质量问题（如标本的固定情况、切片厚度、染色反差情况）等。也就是说，一台分辨力为 0.1nm 的电镜并不能就看清楚 0.1nm 大小的结构，可能只看清楚 0.2nm 大小的结构。由此可见，电镜的理论放大倍数与实际有效放大倍数还是有一定的差距的。5、电镜的像差和畸变电镜和光镜一样，由于光源或透镜的缺陷，可以发生各种像差或畸变。球差：电子束光源通过透镜受到偏转，通过样品，从物平面向下发射，形成物点孔径角。从物点发出的射线，到达下一级透镜又被聚集。如果透镜有缺陷或孔径角太大，则靠近光轴的射线和远离光轴的射线，受到电磁场
11、的作用就会不同，这些射线在光轴上会聚的位置不同，结果远离光轴的射线就会在像面上形成一个最小模糊圈。此时可有图象中央凸起感。这是目前影响电镜分辨率的一个主要因素。像散：由于透镜的磁场强度在纵向或横向上不同，以致纵向与横向上的射线。聚焦于光轴的位置也有上有下，两者共同形成一个最小模糊像。色差：由于电磁波长随加速电压而变化，当加速电压不稳定时，电子束波长就可变异，因而发生类似的像差。畸变：由于离轴较远处的径向磁场的作用力强，使放大倍数随物点离轴的距离而变化，进而使图象发生改变而产生的。畸变常见的有枕形畸变、桶形畸变和 S形畸变等，如下图所示：6、反差人的眼睛在区分物体时，主要根据物体不同部位或物体之
12、间的光强度与波长的差别，这些差别构成了物体的反衬度，又称为“反差” 。电镜与光镜一样也存在反差现象。由于电镜标本上的不同部位的物质结构不同，疏密度不同，它们散射电子的能力也各不相同，结果使透过样品的电子束发生疏密差别。散射电子能力强的地方，透过电子数目少，因而，荧光屏上所激发的荧光就弱，显现为暗像；相反，散射能力弱的地方，透过电子的数目多，在荧光屏上激发的光就强，显现为亮像。因此，在荧光屏上所看到的是由暗像与亮像组成的具有一定反差的荧光图像。7、电磁透镜由于轴对称弯曲磁场对电子束有聚焦作用，因而可以得到电子光学像。我们称这种具有轴对称弯曲磁场装置构成的电子透镜为电磁透镜（electron ma
13、gnetic lenses） 。由于电磁透镜磁场非均匀分布，物、像点在磁场之外，电子在磁场中既受到轴向分量的作用，又受到径向分量的作用，使平行于轴进入磁场的电子束可获得聚焦（如图所示） 。二、电镜与光镜的成像原理透射电镜是发展最早、应用最广、分辨本领最高的电镜，用于病理诊断主要也是这种电镜。电子显微镜和光学显微镜的基本原理是相同的，不同的是光镜的照明源是可见光，而电镜是用电子束照明。光镜的透镜用玻璃制成，电镜的透镜是轴对称的电场或磁场。光学显微镜是利用玻璃制作的透镜对光进行折射，将一物点发出不同角度的光线最终会聚成一个像点。电子显微镜是以电子束作为光源，利用电磁透镜产生的电场或磁场折射电子束，
14、并通过电子束轰击荧光屏激发荧光而达到成像目的（如图所示） 。光 源聚 光 镜样 品物 镜投 影 镜最 终 象电子显微镜成像示意图 光学显微镜成像示意图三、透射式电子显微镜基本结构透射式电子显微镜（简称透射电镜）由四部分组成，即电子光学系统（即镜筒）、真空排气系统、电源系统和水冷系统。（一）、电子光学系统（如图所示）：是电镜的主体，主要作用是成像和放大。它包括照明系统、样品室、成像系统和观察记录系统等四部分。1、照明系统照明系统相当于光镜的光源和反光镜，其作用是产生对样品照明的电子束，主要组成如下：（1）电子枪 是电子发射源，由阴极、控制极和阳极组成。其中阴极是用直径0.1mm0.15mm 粗的
15、钨丝制成，呈 V 字形，也称灯丝。当通电达一定温度时，即产生热电子发射，形成强的照明电子束。控制极即韦氏极（Wehnelt）又称栅极，位于阴极和阳极之间，它的电位也比阴极低，起着控制电子束发射及改变电子枪 镜筒结构示意图 中电场分布的作用，使阳极发出的电子束聚拢成束而不发散。阳极是一个中间带孔的金属圆帽，位于阴极的对面，它形成强大的正电场，与阴极之间有 40 千伏120千伏的电位差，这一负高压用以加速由阴极发射的电子束穿过其中心小孔，继续飞向后续光路中的聚光镜，使电子束更加密集，从而产生更强的照明效果。 （2）聚光镜 是将来自电子枪的电子束会聚在样品上，对样品进行照明。高分辨率的电镜有两个聚光
16、镜，在第二聚光镜中装有活动光阑(用白金片做成),上面有34 个光阑孔，不同型号的电镜，其光阑孔也有不同，一般有直径为100m、200m 、300m 和 400m 的圆孔，利用光阑孔的大小，可以控制聚光镜的孔径角，即控制照明束的强弱，调节照明亮度，使样品不致发生过热现象，从而取得比较理想的图象清晰度。聚光镜的中心位置还有一个极靴（Pole piece），其作用是籍以增强磁场强度，使电子束进一步聚拢。而磁场强度则又决定于所加电流的大小，故可通过改变电流大小来调节磁场强度，以达到根据需要调节放大倍率和对所形成图象进行调焦的目的。2、样品室样品室是放置样品用的，通过特殊的机械装置更换样品。另外，通过连
17、动装置，在真空外可以操纵样品台在 X、Y 轴方向上移动，可分马达驱动和手工驱动两种，从而为寻找目标图象提供方便。3、成像系统（1）物镜 是电镜中第一个成像的透镜，要求有极高的加工精度及稳定性，以保证成像质量。物镜同样装有精密度极高的极靴以及要求极高的消像散器，以尽量消除像散(astigmatism)，以保证成像的清晰度。物镜同样装有活动光阑，可提高反差。光阑孔的大小与物镜成像的孔径角和成像的反差强弱有关。所选的光阑孔径越小，其成像的反差就越强，但由于此时通过的电子束也就越小，故其照明度也越低。因此，要想得到良好的图象效果，必须选择合适的光阑孔径。（2）中间镜 是一个可改变放大倍数的弱透镜，主要
18、用于控制总放大倍数。如果一个中间镜不能满足要求时，还可用两个甚至三个中间镜来控制放大倍数。（3）投影镜 是将中间镜所成的像进一步放大并投影到荧光屏上，以供观察。和物镜及中间镜比较，投影镜的电流一般是不变的，即其放大倍数是固定的。一般性能较好的电镜往往装有两个以上投影镜。4、观察及记录系统包括观察室和底片室。观察室内有荧光屏，在电子束的照射下，样品的电子显微像即在荧光屏上显示。底片室位于荧光屏的下面，需要照相时，可将荧光屏移开，使电子束直接作用于底片，图象即记录在感光底片上。（二）真空排气系统 真空系统由机械泵、油扩散泵、真空管道、阀门及检测系统组成。其作用是排除镜筒中的空气，使镜筒达到高真空状
19、态。否则，电子枪发射的高速电子会与气体分子发生碰撞，产生电子散射，影响像的质量和反差；此外，在电子枪中会产生高压放电，气体会腐蚀灯丝，影响灯丝寿命，还会污染样品。（三）电源系统 电镜所用的电源比较复杂，同时对电源的稳定性要求很高。在总的电源的供给上要求用专用线，对电源要先进行交流稳压，然后再进行整流、直流稳压，这部分工作一般在电源箱内完成，最后供给各部分使用。主要的电源供给包括高压电源、电子枪灯丝电源、控制极电源、透镜电源、真空系统电源等部分。（四）水冷系统由于电镜工作时会产生热量，尤其是电子枪和电磁透镜部分产生的热量最多，如果不及时散发或冷却下去，会造成电镜工作不良，甚至影响电镜寿命。水冷系
20、统主要靠冷却水循环装置来完成或者直接用自来水降温，不过用自来水往往降温不稳定。第二章 超薄切片技术由于普通电镜产生的电子束穿透能力很弱，只有在高真空条件下才能达到一定的自由行程，所以电子显微镜所观察的样品必须很薄，一般的加速电压在 100kV 左右的透射电镜其标本厚度不要超过100nm,超高压电镜的标本切片厚度可以达到 1m。因此，大家习惯把切片厚度在 1m 以下的薄片称为超薄切片。常用的超薄切片厚度是 50-90nm。在透射电镜的样品制备方法中，超薄切片技术是最基本、最常用的制备技术。超薄切片的制作过程基本上和石蜡切片过程相似，需要经过取材、固定、脱水、浸透、包埋、聚合、切片及染色等步骤。但
21、是，由于电镜的高分辨本领以及电子束的照射很易使样品发热变形，因此对超薄切片技术提出了更高的要求。为了获得理想的超薄切片，除了拥有高性能的超薄切片机以及操作者娴熟的切片技术外，每个操作者必须十分认真地对待样品制作的每一个步骤，任何环节的疏忽都有可能使制片失败。一、透射电镜样品制作流程： 取材漂洗（生理盐水）前固定（2.5%戊二醛，4C 冰箱 2 小时以上）漂洗（0.1M 磷酸缓冲液，3 次，45 分钟） 后固定(1%锇酸 1 小时左右)漂洗（0.1M 磷酸缓冲液， 3 次，45 分钟） 块染（1%醋酸铀 2 小时）梯度脱水（50%、70% 、80% 、90% 丙酮各 15 分钟， 100%丙酮
22、2 次，各 10 分钟）浸透（丙酮：包埋液=1 ：1，37 C 烘箱 2 小时；丙酮：包埋液=1 ：4， 37C烘箱过夜；纯包埋液 45C 烘箱 2 小时）包埋聚合（45C 烘箱 3 小时，65C 烘箱 48 小时） 。附录：超微病理标本微波快速制备流程：取材（按常规要求方法）3%戊二醛固定后经微波高火照射 20 秒,室温继续固定 20 分钟1%磷酸缓冲液漂洗 4 次，每次 5 分钟，微波中火照射 20 秒1%锇酸微波中火照射 10 秒，室温继续固定 20 分钟丙酮 50%、70%、80%、90%脱水，微波中火照射 20 秒，室温继续脱水 2 分钟。100%丙酮脱水 3 次，每次微波中火照射
23、20 秒，室温 3 分钟丙酮：包埋剂=1：1 浸透，微波中火照射 20 秒，室温继续浸透 5 分钟丙酮：包埋剂=1：3 浸透，微波中火照射 20 秒，室温继续浸透 5 分钟，2 次纯包埋剂微波中火照射 20 秒，室温 10 分钟常规包埋聚合：70 20 分钟，95 30 分钟，110 60 分钟半薄切片光镜定位超薄切片醋酸铀微波中火照射染色 30 秒，双蒸馏水漂洗枸橼酸铅微波中火照射染色 20 秒，双蒸馏水漂洗45烘箱干燥电镜观察。注意：高火：600800W ；中火：约 400W。二、取材(一) 取材的基本要求组织从生物活体取下以后，如果不立即进行适当处理，就有可能出现缺血缺氧改变，或细胞出现
24、变性坏死现象，从而出现了人为假象，影响观察结果，甚至导致无法观察。此外，还可能由于污染，微生物在组织内繁殖使细胞的微细结构遭受破坏。因此，为了使细胞结构尽可能保持生前状态，希望取材操作者应注意“快、小、冷、准”四个取材要点：(1)快：就是取材动作要迅速，组织从活体取下后应在最短时间 (争取在 12 分钟之内)投入前固定液。对于实验动物，最好在断血流、断气之前就进行取材，以免缺血缺氧后使细胞代谢发生改变而破坏细胞的超微结构。当然，最好是采用灌注固定法。(2)小：由于常用的固定剂渗透能力较弱，组织块如果太大，块的内部将不能得到良好的固定。因此所取组织的体积要小，一般不超过 1mm3。为便于定向包埋
25、，可将组织修成大小约 1mm1mm2mm 长条形。(3)冷：为了防止酶对自身细胞的酶解作用，取材操作最好在低温(04)下进行，这样可以降低酶的活性，防止细胞自溶。但也有人认为，如果环境温度在15以下，可以在室温下进行取材，效果也不错。(4)准：就是取材部位要准确，这就要求取材者对所取的组织解剖部位要熟悉，尽量取到与实验要求相关的部位，不同实验组别间要取相同部位，同时作好定向取材。详见不同组织器官的取材方法一章。此外，还要求操作动作轻柔，熟练，尽量避免牵拉、挫伤与挤压对组织造成的人为损伤。(二) 取材方法首先，实验者要预先准备好平皿、碎冰或冰袋、蜡板、固定液、锋利的刀片、干净的小玻璃瓶若干个等取
26、材物品。取材之前先在蜡板（用切片石蜡置培养皿中溶解后再冷却即可）上滴 12 滴预先在 4冰箱内冷却的固定液（一般为 2.5%或 3%磷酸缓冲液缓冲的戊二醛），将取出的组织放在固定液当中，用新的、锋利的刀片采用双刀拉锯法，将组织块尽量修小，一般不超过 1mm3，或者可将组织修成大小约 1mm1mm2mm 长条形，然后用牙签或镊子将组织块移至盛有冷的固定液的小瓶中（组织块体积与固定液体积之比大约为 1：40），然后在瓶子上做好标签或标记，避免组织混淆不清。如果组织带有较多的血液或其它组织液，应先用生理盐水或直接用固定液漂洗几遍，然后再照以上方法切成小块进行固定。以下为双刀拉锯法取材示意图：二固定固
27、定的目的是尽可能使细胞中的各种细胞器以及大分子结构保持生活状态，并且牢固地固定在它们原来所在的位置上。固定的方法有物理的和化学的两大类。物理的方法系采用冰冻、干燥等手段来保持细胞结构；化学的方法是用一定的化学试剂来固定细胞结构。下面主要介绍固定液特性以及使用化学方法对组织或细胞进行固定的方法。(一) 常用固定剂的性质1四氧化锇 (osmium tetroxide，OsO4)四氧化锇又名锇酸，是一种淡黄色、具有强烈刺激味的晶体。它是强氧化剂，与氮原子有较强的亲和力，因而对于细胞结构中的蛋白质成分有良好的固定作用。它还能与不饱和脂肪酸反应使脂肪得以固定。此外，四氧化锇还能固定脂蛋白，使生物膜结构的
28、主要成分磷脂蛋白稳定。它还能与变性 DNA 以及核蛋白反应，但不能固定天然 DNA、RNA 及糖原。四氧化锇固定剂有强烈的电子染色作用，用它固定的样品图象反差较好。四氧化锇的缺点是渗透能力较弱，每小时仅渗透 0.1mm0.3mm。用四氧化锇固定的时间一般为 2 小时左右，长时间停留在四氧化锇溶液中会引起一些脂蛋白复合体的溶解，而使组织变脆，造成切片困难。四氧化锇容易蒸发，其蒸气对皮肤、呼吸道粘膜及眼睛角膜有伤害作用。因此，使用时要注意通风，操作宜在通风橱中进行。因受热或可见光会促使四氧化锇氧化，故应保存于避光和阴凉处。2戊二醛 (glutaraldehyde C5H8O2)戊二醛于 1963
29、年开始采用，是当前广泛使用的固定剂。戊二醛的优点是对糖原、糖蛋白、微管、内质网和细胞基质等有较好的固定作用，对组织和细胞的穿透力比四氧化锇强，还能保存某些酶的活力，长时间的固定(几周甚至 12 个月)不会使组织变脆。缺点是不能保存脂肪，没有电子染色作用，对细胞膜的显示较差。商品戊二醛通常为 25%的水溶液。大多数市售戊二醛水溶液含有杂质，主要是戊二酸、丙烯酸等，它们可以影响固定质量，尤其对酶的保存。因此要获得好的固定，可对市售戊二醛用活性碳或用蒸馏方法进行提纯。一般戊二醛的 pH 为4.05.0，贮存时间过长时，溶液颜色变黄，酸度增加，当 pH 降至 3.5 以下就不能使用。戊二醛原液应在冰箱
30、保存。3甲醛甲醛分子量较小，在组织中渗透快，固定迅速，对细胞精细结构的保存虽不如戊二醛，但在酶活性的保存上却优于戊二醛，故多用于细胞化学或快速固定。一般市售的甲醛溶液中含有抗聚合的甲醇，影响固定效果，因此，固定电镜样品所用的甲醛应在临用前用多聚甲醛粉末制备。配制 10%多聚甲醛溶液方法如下：10 克多聚甲醛粉末加入 100 毫升双蒸水，加热至 6070，边搅拌边加入几滴1N NaOH ，至溶液透明，冷却后备用。（二）常用固定方法1浸泡固定（也称组织块固定）：就是将组织块直接浸泡入固定液当中进行固定，常规采用戊二醛锇酸双重固定法。1.1.预固定(或前固定)用 2%4%戊二醛固定液，或者 2%多聚甲醛2.5%戊二醛混合固定液固定 24小时，pH 值为 7.37.4，温度为 4。固定液的用量为标本的 40 倍左右。1.2 缓冲液漂洗
