1、第六节 植物遗传转化体系,一、植物遗传转化载体系统二、植物遗传转化方法及原理三、转化子的鉴定与遗传分析,一、植物转化载体系统,质粒载体系统病毒载体系统无筛选标记载体系统,植物转基因载体-启动子,诱导型启动子,地塞米松诱导的GR系统、雌二醇诱导的ER系统、杀虫剂诱导的EcR系统乙醇诱导系统等,克隆表达载体,无选择标记转化系统,重组：Cre/Lop、R/RS系统借助于转座子：Ac/Ds共转化选择标记基因的组织特异性表达,用两个独立的质粒,其中一个含有选择标记基因,另一个含有目的基因,同时转化目的细胞,两个质粒可同时整合进植物细胞内。但两个基因多整合在不同位点,经转化植株后代的遗传重组,目的基因便可
2、与选择标记基因分开,得到无选择标记基因的转化植株,返回,二、植物遗传转化的方法,植物遗传转化技术可分为两大类：生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。直接基因转移技术 包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等，其中基因枪转化法是代表。,几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部常常会形成根瘤，这是由于植物根部被一种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌（A. tumefaciens）感染所致，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质粒 Ti（Tumor-induci
3、ng）介导的。,1、农杆菌介导的植物遗传转化体系 Agrobacterium Mediated Transformation,农杆菌致病冠瘿瘤,农杆菌生物学特性,农杆菌介导的转化是目前唯一被人类所认识的生物界之间自发交换遗传物质的天然转化体系。农杆菌将其Ti质粒上的TDNA和一些毒性蛋白（Vir proteins）转入寄主植物细胞，在Vir蛋白和寄主植物蛋白辅助下，TDNA整合在寄主植物染色体上，并最终在寄主植物中表达TDNA上的基因。,Ti 质粒特性,Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的双链环状DNA分子，含200800Kb，具有五个主要功能区域：. T-DNA：（transferred DNA）
4、 LB与RB间T-DNA序列整合到植物基因组；. 质粒转移区(PT)；. 冠瘿碱(opine)代谢区；. 复制原点（original replication region，Ori） ；. 毒性区（virulence region，Vir）其中Vir区和T-DNA区与冠瘿瘤的生成有关，结合转移区是细菌吸收和利用冠瘿碱的区域。,Ti 质粒的图谱,tms 的编码产物负责：合成吲哚乙酸,tmr 的编码产物负责：合成植物分裂素,tmt 的编码产物负责：合成氨基酸衍生物冠瘿碱,大小： 160 - 240 kb 其中 T-DNA 12 - 24 kb,T-DNA,T-DNA可以将其间携带的基因整合到植物基因
5、组中，但这些基因本身与T-DNA的转移和整合无关，仅仅T-DNA左右两端边界各有一个25bp的正反重复序列是其加工所必须的。左右两边界之间对序列可以被其它序列替换，如目的基因。,Vir 区,Vir区大小：约30kb大小；Vir区：包括AJ等10个操纵子（operator），由24个基因起共调控（co-regulation）作用，Vir蛋白对作用： Vir区基因需要在植物细胞释放的信号因子激活下才能表达，其编码蛋白决定了T-DNA的加工和转移。,部分Vir蛋白在农杆菌中和在植物中的功能,Ti 质粒致瘤的分子机制,损伤的植物根部会分泌出乙酰丁香酸和羟基乙酰丁香酸，它们能诱导Ti质粒上的vir基因以
6、及根瘤菌染色体上的一个操纵子表达。vir基因产物将Ti质粒上的T-DNA单链切下，而根瘤菌染色体上的操纵子表达产物则与单链T-DNA结合形成复合物，后者转化植物根部细胞。,农杆菌介导的植物转化机理,农杆菌与植物互作的过程,(1)农杆菌识别并附着在植物细胞上，这一过程主要由农杆菌染色体基因编码蛋白和寄主受体蛋白介导的；(2) 农杆菌VirAVirG双组分信号传导系统感知植物的特殊信号，如乙酰丁香酮等酚类物质及多糖类化合物；(3) VirG介导的信号传导和其它Vir基因的活化；(4) T-DNA加工，产生可转移的TDNA链，即T链；(5) VirBVirD4转运复合体形成，T链和一些Vir蛋白被运
7、送到植物细胞；（图）(6) 形成成熟的T复合体；（图）(7) 寄主植物蛋白（如AtKAP、VIP1 和Ran等）协助将T复合体运送至植物细胞核； （图）(8) T复合体在核内转运至寄主染色体组，在农杆菌VirD2 和/或 VirE2蛋白，以及植物某些因子协助下，T-DNA整合进入植物基因组。,下一页,农杆菌与植物互作分子基础,返回,农杆菌对植物吸附,农杆菌要实现对植物的转化，首先要附着在植物细胞表面，其过程是：单个细菌以极性方式，在细胞表面乙酰化酸性荚膜多糖介导下附着在植物细胞表面；在植物创伤细胞分泌物诱导下，细菌产生大量的纤维素和一些糖类化合物，将细胞包囊起来，最后在植物细胞表面形成一个囊状
8、结构。细菌基因起主要作用，其中至少有5个染色体基因产物参与此过程，它们是：attR、chvA、chvB、psvA(exoC)和cel。ChvA和ChvB基因编码蛋白与环-1, 2-D-葡聚糖合成有关，控制多糖的合成；ce l基因与纤维素合成有关，编码产物为-脂键多糖，形成纤维细丝，参与附着过程中细菌表面的成囊过程；Att基因编码产物是细胞膜外蛋白和外周蛋白，参与了细菌的附着；psvA(exoC)同chvA和chvB相似，与合成环-1，2-D-葡聚糖有关，且还能影响琥珀酸聚糖的形成；ChvD编码一种细菌ATP结合蛋白，在低pH值和磷酸饥饿的情况下可诱导VirG蛋白保持一定的表达水平。以上基因除a
9、ttR基因参与接触外，其余基因编码蛋白及其参与合成的产物都可能参与了成囊过程。宿主植物细胞的受体对农杆菌吸附具有一定影响作用，但目前对此了解甚少，Vitronectin被认为可能是一种细胞壁受体蛋白，Rhicadhesin可能是一种结合蛋白。,返回,TDNA剪切与加工,VirAVirG构成农杆菌双组分信号传导系统，VirA是结合在膜上的受体蛋白，接受植物损伤细胞分泌物的诱导后，自身磷酸化，进而激活VirG蛋白，产生DNA结合活化蛋白，活化的VirG蛋白能与Vir启动子的特定区域结合，启动其它Vir基因的转录。VirD基因编码的两个产物VirDl和VirD2，都参与TDNA加工过程。VirDl蛋
10、白是一种拓扑异构酶，可将超螺旋型DNA转变成松弛型DNA；VirD2蛋白具有特异剪切单链DNA的内切酶活性，它可识别TDNA底链边界重复序列的持定位点切割T-DNA，从而释放出一条单链DNA分子(T链)。VirCl基因产物能特异地结合在底链上，以促进T链的形成。VirH基因产物则与寄主范围有关。,返回,（图）,TDNA包装,将单链TDNA运至植物细胞，至少需要VirD2和VirE2及VirE3等 3个农杆菌毒性蛋白。一条TDNA单链5端以共价形式结合一个VirD2蛋白分子，在T链上结合许多(大约600个)virE2分子。结合在单链DNA上VirE2蛋白覆盖了T链上的负电荷，形成了一个可以通过核
11、孔的结构，这有助于T复合体向核内运输。VirEl是一种特异的分子伴侣，辅助virE2以合适的形态运输到植物细胞。VirE3具有与植物VIP1蛋白类似的功能，可做为VirE2 和 karyopherin之间转接器分子。同时VirE3可包装VirE2，以促进其进入寄主细胞核内。,返回,（图）,农杆菌的TDNA输出通道,农杆菌T复合体和Vir蛋白是通过型泌出系统（T4SS），穿过双重膜被送入寄主细胞。细菌的T4SS是分别由11个VirB基因和VirD4基因编码产物组成的多亚基复合体，构成细菌与寄主植物细胞之间物质转移的通道。T4SS包括两个主要结构部分：T菌毛和一个与膜结合复合体。,返回,（图）,T
12、复合体在植物细胞中运输,在植物细胞内，VirD2蛋白C端的NLS被植物NLS importin 识别并与其结合，随后通过importin 蛋白停靠在核孔复合体上，5端进入核孔通道，在VirE2的协助下，TDNA复合体完整地进入核孔。VirE2蛋白还可与核孔内的转运媒体上，使其易于转运。植物蛋白参与了T复合体在核内运输过程。定位在植物细胞质膜上输入蛋白是一类识别NLS序列的报告蛋白，可特异性地与VirD2双组分NLS区结合，因此可辅助VirD2核定位。VirE2特异地与另外的两个植物蛋白，VIP1和VIP2互作。VIP2帮助VirE2核输入及其在核内的转运。Ran和细胞骨架蛋白也很可能参与到了T
13、-链复合体向细胞核的转运过程。,返回,（图）,T-DNA的染色体整合机制,Ti 质粒的改造,除去T-DNA上的tms和tmr生物合成基因，因为大量的生长素和分裂素会抑止细胞再生长为整株植物；,除去T-DNA上的有机碱生物合成基因（tmt）；因为有机碱的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，影响植物的生长；,安装E.coli复制子，使其能在大肠杆菌中复制;,安装植物细胞的筛选标记，如 neor 基因，使用植物基因的启动子和polyA化信号序列；,安装多聚人工接头以利于外源基因的克隆。,除去 Ti 质粒上的非必需序列，最大限度缩短载体长度；,农杆菌转化载体系统,1 愈伤诱导,2 预培养,3 选择培养,农杆菌
14、介导法水稻遗传转化过程,4 植株再生,农杆菌转化的优点,农杆菌Ti质粒转化系统与其他基因转化体系相比，具有许多突出的优点： 该转化体系是模仿或称之为利用天然的转化载体系统，成功率高，效果好； 农杆菌Ti质粒转化系统的机理研究得最清楚，方法最成熟，应用也最广泛； 农杆菌Ti质粒转化系统转化的外源基因以单拷贝为多数，遗传稳定性好，并且多数符合孟德尔遗传规律，因此转基因植株能较好地为育种提供了中间选育材料； 农杆菌Ti质粒转化系统操作比较容易，需要的仪器设备简单，易于推广。,2、植物病毒介导的转染程序,病毒侵染细胞后把其DNA 导入寄主细胞，并且这些病毒DNA 能在寄主细胞中进行复制和表达。病毒本身
15、就是一种潜在的基因转化系统，可以作为植物转基因的一种载体。,病毒作为载体可能性,病毒载体的优势,病毒载体能将外源基因导入植物的所有组织和细胞中，而且不受单子叶或双子叶的限制。病毒种类繁多，在大约300种特征清楚的植物病毒中，单链RNA病毒约占91%，双链RNA病毒、双链DNA病毒、单链DNA病毒各占3%。RNA不太适合于作为克隆载体，因为RNA的操作非常困难。目前较为成熟的植物病毒载体是花椰菜花斑病毒( CaMV)和番茄金花叶病毒(TGMV)。,利用病毒载体转化植物细胞的策略,转染植物细胞原生质体 转染植物组织,以双链DNA病毒花椰菜花斑病毒（CaMV）基因组作为载体，去除有关的致病性基因，换
16、上外源基因，体外包装成有感染力的病毒颗粒，转染植物细胞原生质体，并由此再生成整株植物。,转染植物细胞原生质体,植物双生病毒（Geminiviruses）为一单链DNA病毒，成熟的双生病毒呈双颗粒状，每一个颗粒中含有一条不同的DNA单链。其中A链能单独在植物细胞中复制，并含有一部分病毒包衣蛋白基因；B链编码另一部分包衣蛋白基因及感染性基因。A、B两条链必须同处于一个植物细胞中，方能形成有感染力的病毒。双生病毒具有广泛的宿主细胞范围，因此是一种很有潜力的植物病毒载体。,转染植物组织,转染植物组织,双生病毒家族成员蕃茄金花叶病毒（TGMV）克隆表达载体的构建程序,1984 年科学家发现，超螺旋结构的
17、细菌质粒，虽然不能在植物细胞中复制，但可以重组整合到植物染色体内。重组机制并不清楚。细菌质粒与植物DNA之间没有同源性。整合是随机的发生在植物染色体的任何位点。受这一现象的启发产生了基因直接转化技术。,植物细胞的直接转化程序,3. 基因枪法,原理：基因枪(particle gun)介导转化法又称微弹轰击法，是指利用火药爆炸、高压气体和高压放电作为驱动力，将载有目的基因的金属颗粒加速，高速射入植物组织和细胞中，然后通过细胞和组织培养技术，再生出新的植株。这一加速设备称为基因枪。受体细胞通常是胚胎细胞、玉米籽、叶子等，但进去的DNA片段整合效率极低。,基因枪,基因枪工作原理,基因枪法优点：,无宿主
18、限制，无论是单子叶植物和双子叶植物都可可控度高，操作简便迅速，商品化的基因枪可根据实验需要调控微弹的速度和射入浓度，命中特定层次的细胞；受体类型广泛，所有具有分生潜力的组织或细胞：原生质体、叶圆片、悬浮培养细胞、茎、根、以及种子的胚、分生组织、愈伤组织、花粉细胞、子房等可将外源基因导入植物细胞的细胞器，并可得到稳定表达。基因枪成功的应用于植物基因转化，特别是单子叶植物的转化；外源基因导入植物细胞器等。,4 电击法,电击法(eletroporation)也称电穿孔法，其原理是利用高压电脉冲作用在原生质体上“电激穿孔”，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源目的基因的摄入。方法：将高浓度的质粒DNA加入
19、到植物细胞的原生质体悬浮液中，混合物在200600V/cm的电场中处理若干秒钟，然后将原生质体在组织培养基中生长1-2 周，再生出整株植物。转化效率：该法的转化率可高达1.2%。,电击法的主要原理是将原生质体在溶液中与DNA混合,然后利用高压电脉冲作用,使原生质体膜的某些部位被击穿而产生可回复的小孔,外源DNA可通过小孔进入原生质体内,而且不影响经电击处理的原生质体再生植物的能力.,返 回,电击法优缺点：,优点：是操作简便，特别适合于瞬间表达研究。缺点：是必须经过原生质体培养，加上电穿孔易造成原生质体损伤，使其再生率降低。将电击法与PEG 转化法、脂质体法和激光微束法等技术结合使用及不断改进技
20、术，都可有效提高转化率。,5 聚乙二醇法,聚乙二醇(PEG)是一种水溶性的化学渗透剂，其转化原理是它可使细胞膜之间或使DNA与膜形成分子桥，促使相互间的接触和粘连，并可通过改变细胞膜表面的电荷，引起细胞膜透性的改变，从而诱导原生质体摄取外源基因DNA。 PEG 转化的基本步骤包括：外源目的基因的制备；原生质体制备；目的基因和原生质体的转化培养；转化体的鉴定及再生植物培养。,6 其他直接转化的方法,脂质体法 (liposome fusion) 超声波法 (ultrasonic transformation) 激光微束法(laser microbeam) 显微注射法(microinjection)
21、 碳化硅纤维介导转化(silicon carbide fiber mediated transformation)法,7、植物原生质体的再生程序,原生质体的再生效率在植物转基因技术中至关重要。,高等植物原生质体制备和再生程序：,将植物嫩叶、幼芽或愈伤组织切成碎片，浸入含有纤维素酶的缓冲液中保温；悬浮物离心除细胞碎片；将原生体悬浮液滴在无菌滤纸片上，并置于含有普通植物细胞（即所谓的滋养细胞）的固体再生培养基的表面，使原生质体与滋养细胞不直接接触，但可吸收由滋养细胞分泌扩散出来的植物生长因子及其它化合物；培养2-3周后，将滤纸上的植物细胞蔟转移至含有高浓度分裂素和低浓度生长素的固体培养基上继续培育
22、2-4周，滤纸片上便长出嫩芽；将嫩芽置入含有低浓度生长素而无分裂素的固体培养基上，使其根部发育；大约3周后再将之移植在土壤中，长成整株植物。,Subcellular localization of MIP2,35S:GFP,35S:MIP2-GFP,35S:GFP-MOC1,GFP,Bright,Chloroplast,Merged,植物原生质体的 再生程序,种质系统法,以植物自身的种质细胞为媒介，特别是植物的生殖系统的细胞(花粉、卵细胞、子房和幼胚等)以及细胞的结构，将外源DNA导入完整植物细胞，实现遗传转化的技术称为种质转化系统(germ line transformation)。该技术也
23、称为生物媒体转化系统或整株活体转化(in planta transformation)。,种质系统法的特点：,目的DNA广泛，可以是裸露的DNA，也可以是总DNA或重组质粒DNA，还可以是某些DNA 片断；转化过程依靠植物自身的种质系统或细胞结构来实现，不需要细胞分离、组织培养和再生植株等复杂技术；方法简便易行，并与常规育种紧密结合。它已发展成一种颇具潜力的转化体系。,8. 花粉管导入法,花粉管通道法(pollen-tube pathway)是由中国科学院周光宇等(1983)建立。主要原理：在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA经过珠
24、心进入尚未形成正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞中，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。,花粉落到柱头上以后，在柱头上黏液的刺激下开始萌发，长出花粉管。花粉管穿过花柱，进入子房，一直到达胚珠。花粉管中的精子随着花粉管的伸长而向下移动，最终进入胚珠内部。胚珠里面有卵细胞，它跟来自花粉管的精子结合，形成受精卵。,受精的过程,优点：,1 直接、简便 受体材料为植株整体，省略了细胞组织培养的诱导和传代过程，排除了植株再生的障碍，适合于难以建立有效再生系统的植物。2 DNA分子整合效率较高 由于转化的是完整植株的卵细胞、受精卵或早期胚胎细胞。,影响转化的主要因素
25、：,在时间上受到开花季节的限制。关键因素 精确掌握受体植物的受精过程及时间规律，恰当地应用花粉管途径，达到外源DNA导入的目的；DNA导入液的浓度、PH 值影响转化率；DNA的分子结构及其片段大小影响 环状分子难以转化片段太小或太大转化率低,应用：,目前已应用于水稻、小麦、棉花、大豆、花生、蔬菜等作物的转基因研究。利用这一技术我国已选育出棉花、水稻、小麦等新品种，如棉花3118、湘棉12 号、水稻GER-1 等。我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。,9、 浸泡转化法,浸泡转化(imbibition transformation)法： 指将种子、胚、胚珠、子房、幼穗甚
26、至幼苗等直接浸泡在外源DNA溶液中，利用渗透作用可将外源基因导入受体细胞并得到整合与表达的一种转化方法。 浸泡转化法的原理： 利用植物细胞自身的物质运转系统将外源DNA 直接导入受体细胞。,外源DNA 进入细胞内可能的途径：, 通过细胞间隙与胞间连丝组成的网络化运输系统而被运输到每个细胞； 通过内吞作用将外源DNA摄入细胞内；植物组织中传递细胞的膜透性改变也为大分子物质透过细胞膜提供了机会。生殖细胞、胚胎细胞及分生细胞中，外源DNA进入细胞的机会更大。,10、 胚囊、子房注射法,胚囊、子房注射法是指使用显微注射仪将外源DNA溶液注入到子房或胚囊中，由于子房或胚囊中产生高的压力及卵细胞的吸收使外
27、源DNA进入受精的卵细胞中，从而获得转基因植株。该法是一种简单可行的转化途径，特别对那些子房大、多胚珠的植物更加适合。,主要原理依据：,胚囊是一个拥有较大空隙的空腔，能够注入一定的外源DNA 溶液；卵细胞有一侧没有细胞壁，只有一层质膜，能够吸入外源DNA；正常的花粉管进入胚囊后也是在胚囊中破裂，释放出的雄配子DNA也在胚囊中；外源DNA溶液注入胚囊后对卵细胞造成一个较大的渗透压，迫使外源DNA进入卵细胞；如外源DNA注入到子房中，通过花粉管进入胚珠 通道，能够使外源DNA 从子房进入胚囊；注入的外源DNA 可以是已重组构建的带目的基因及启动子的DNA，因此，导入卵细胞后可以整合到核基因组中并得
28、到表达。,11、 整株感染法（in planta）,用根癌农杆菌直接感染植物而进行遗传转化的一种简单易行的方法。方法：人为地在植株上造成创伤，然后把含有重组质粒的根癌农杆菌接种在创伤面上，或把含有重组质粒的根癌农杆菌注射到植物体内。使根癌农杆菌在植物体内进行浸染实现转化。为了获得较高的转化频率，一般多采用无菌种子的实生苗或试管苗。,拟南芥(Arabidopsis thaliana) 整体转化,将根癌农杆菌涂于植株腋芽处或顶牙，可长出转化的新枝条，新的转化枝条开花结实后，也可以获得转基因种子；或者通过真空渗透或农杆菌浸泡拟南芥开花植株，等结实之后，利用筛选萌芽种子的方法，也可以得到转基因植株及种
29、子。,Time of inoculation relative to flower development is crucial.,Procedure and Tips,Add 50-150 ml silwet L-77 per liter transformation buffer .,The sucrose concentration is 5.,Do the second transformation after 7-10days should accelerate the efficiency.,Using the plates with 50mg/ml kanamycin and 25 mg/ml hygromycin for selection.,
