谷氨酰转肽酶细胞合成L-谷氨酰正丙胺.DOC

1、1 谷氨酰转肽酶细胞合成 L-谷氨酰正丙胺 徐礼生 *1,2， 王梦婷 1， 高贵珍 1，赵亮 1， 曹稳根 1， 焦庆才 2 （ 1.宿州学院 生物与食品工程学院，安徽 宿州 234000;2.南京大学 医药生物技术国家重点实验室，江苏 南京 210093 ） 摘要 ： 以 L-谷氨酰肼 和 正丙胺为 底物， 利用 谷氨酰转肽酶 细胞合 成 L-谷氨酰正丙胺，考察底物浓度、温度、 pH、 催化剂用量 对合成 L-谷氨酰正丙胺 的影响 。 结果表明， 谷氨酰转肽酶 细胞能有效合 成 L-谷氨酰正丙胺，在 温度 37 、 pH=10.0、 L-谷氨酰肼 浓度为 0.4 mol/L，正丙胺 浓度

2、为 3 mol/L 的条件下， 谷氨酰转肽酶 细胞 催化剂添加量为 0.2 g， 300 mL 反应体系 L-谷氨酰正丙胺 的 收率 为 97.9%，经高效液相色谱法测定， L-谷氨酰正丙 胺纯度为 99.8 %。 关键词 ： 谷氨酰 转肽酶 ； L-谷氨酰正丙胺 ； L-谷氨酰肼 ；生物工程 Synthesis of Propyl-L-Glutamine by Glutamyltranspeptidase Cell XU Li-sheng1， 2, WANG Meng-ting1, GAO Gui-zhen1, ZHAO Liang1, Cao Wen-gen, JIAO Qing-cai2

3、 (1. Department of Life and Food Science, Suzhou University, Suzhou 234000, Anhui, China; 2. State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, Nanjing University, Nanjing 210093, Jiangsu, China) Abstract: Synthesis of propyl-L-glutamine by glutamyltranspeptidase cells was investigated. With L-gl

4、utamlhydrine and propylamine as substrate, the factors such as substrate concentration, pH and temperature were investigated. Synthesis of propyl-L-glutamine by glutamyltranspeptidase cells was effective. The results indicated that when the concentration of L-glutamlhydrine was 0.4 mol/L, the concen

5、tration of propylamine was 3 mol/L, glutamyltranspeptidase cells catalyst dosage was 0.2 g, reaction temperature was 37 C , and pH was 10.0.The yield of propyl-L-glutamine was 97.9% in 300 ml reaction volume. The purity of propyl-L-glutamine was 99.8 % by high performance liquid chromatography. Key

6、words: glutamyltranspeptidase; propyl-L-glutamine; L-glutamlhydrine Foundation items: The Key Project of Natural Science Research in Universities in Anhui Province(KJ2017A440);Anhui Quality Engineer Program(2015zjjh034,2015ckjh108,2016jyxm1038) 谷氨酰转肽酶作为一种重要的 酶 参与 谷氨酰 循环反应 ，它 能 特异性地催化谷氨酰 基团 的迁 移 过程，从

7、而获得 含有谷氨酰 基团 化合物 1,2。 谷氨酰转肽酶来源广泛，稳定 特 性较好 3。收稿日期： 基金项目： 安徽省高校自然科学研究重点项目（ KJ2017A440）； 安徽省质量工程项目（ 2015zjjh034、2015ckjh108、 2016jyxm1038） 作者简介： 徐礼生 (1980-)， 男 ， 安徽 安庆 人 ，理学博士，副教授， E-mail:。 2 动物脏 器和 变形杆菌 可纯化得到 -谷氨酰转肽酶， 它 对谷胱甘肽 有 转肽 以及 水解作用 4-5。 -谷氨酰转肽酶 在 临床 检 查 中 可 作为生物标 识 物 6。 L-谷氨酰 基 类 化合物具有 重要生物 活性

8、，医学上该类物质 应用广泛，利 用谷氨酰转肽酶 可制备 L-谷氨酰 基 类 化合物，如谷胱甘肽、茶氨酸、谷氨酰甲胺 等谷氨酰 基类物质 7。 Chen Y Y 等人 利用 Bacillus licheniformis 中 -谷氨酰转肽酶催化合成 -L-谷酰基 -S-丙烯基 -L-半胱氨酸，并且对来源于 Bacillus licheniformis中 -谷氨酰转肽酶结构、功能和稳定性进行了研究 8-9。 Frederik W 等人 通过来源于谷氨酸棒杆菌 -谷氨酰转肽酶催化合成谷酰基二肽类物质 10。采用定点突变对来源于 Bacillus licheniformis 中 -谷氨酰转肽酶进行改造，

9、定点突变的位点主要包括 His401、 Thr415、 Thr417、Glu419 和 Arg571，其中， Thr415 和 Thr417 在催化过程中具有重要作用 11。 L-谷氨酰 基 类化合物具有重要的 生理活性，如 茶氨酸 对单胺类新陈 代谢 具有 作用 ，在 茶氨酸作用下 脑中 枢多巴胺 释放 显著加快 ，提高脑内多巴胺生理活性 12。 研究 证实 茶氨酸对降 低 血压 和 抗癌 等均 有 疗效 13-14。 含有 氢 硫基的 谷胱甘肽， 参与 人 体 多种 生化反应 ， 在 医学领域用于 辅助 性 治疗肝 胆 病 、 重金属 和 有机物 解毒以及 细胞膜 保护 等 15。 通过邻

10、苯二甲酸酐保护谷氨酸 位氨基并进行分子内羧基的环酐化反应制备 L-谷氨酰 异丙胺 16。 本文 利用谷氨酰转肽酶 将谷氨酰基转接 到正丙胺 上合成了 L-谷氨酰 正丙胺，合成路线如下所示。 并考察底物浓度、温度、 pH、 催化剂用量和 底物物质的量比 对 L-谷氨酰正丙胺合成的影响， 提高 谷氨酰转肽酶 酶活力，以期达到有效提高 L-谷氨酰 正丙胺收率 的目的。 1 实验部分 1.1 试剂和仪器 L-谷氨酰肼、 正丙胺 、 盐酸、氯化钠 、氨苄 、吐温 -80、甲醇、巯基乙醇、硼酸、乙酸钠、 乙腈 均 购自 国药 集团 上海化学试剂公司 ，以上试剂均为分析纯； 酵母浸粉、鱼粉蛋白胨 和 乳糖

11、均为 市售 生化试剂 。 WT-ZNO 型洁净工作台 ，郑州中旺实验室设备有限公司； ZWY-240 恒温培养振荡 箱，上海智城分析仪器制造有限公司； GI100T 立式自动压力蒸汽灭菌 锅，上海博迅实业有限公司； LC-20AT 型高效液相色谱仪，日本 Shimadzu 公司。 1.2 L-谷氨酰 正丙胺的制备 该 菌种为重组 谷氨酰转肽酶 基因工程菌。将 此菌种按照 3.3%的量 （种子液 体积 /总体积 ，种子液体积 为 100 L） 接 入含有 酵母浸粉 原料的培养基 中 ，用 微量进样器加入 7 L 氨苄，3 接种 完成后 于 37 、 170 r/min 的 恒温摇床 中培养 10

12、 h。将活化 一代 后的上述 菌液 2 mL 加入 100 mL 含有 乳糖 的 培养基 中，然后 在 37 、 170 r/min 的 恒温摇床中发酵 4 h，再将其温度调节至 30 后 继续发酵 8 h。以上 发酵菌液 在 4 、 8000 r/min 离心机中离心 10 min， 得到 湿菌体 细胞， 保存 于 -20 的 冰箱中备用。 反应 最优条件为： 底 物 L-谷氨酰肼 浓度 为 0.4 mol/L， 正丙胺 浓度 为 3 mol/L， pH 为 10.0，谷氨酰转肽酶 细胞 催化剂用量为 0.2 g， L-谷氨酰肼 和 正丙胺 物质的量比为 1:7.5，反应总体积为 300 m

13、L， 温度 37 时进行 反应 ，离心去除菌体细胞，活性 炭 脱色，将脱色液通过 732型阳离子交换树脂柱 (原料为 强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂 )吸附，用 质量分数为 3%氨水洗脱，收集洗脱液，调至 pH 3 4，静置析出沉淀，真空抽滤，烘干得粗品，粗品 经 质量 分数 为 95%的乙醇洗涤，真空抽滤，烘干得 22.20 g L-谷氨酰正丙胺 白色晶体。 1.3 分析测定 高效液相色谱法测定 L-谷 氨酰正丙胺 含量，采用 Agilent C18 柱 ( 250 mm 4. 6 mm， 5 m) ，以 0. 1 mol /L 醋酸钠 ( pH = 4. 0 0. 05) -甲醇 ( 体积比

14、为 90 10) 为流动相，流速为 1. 0 mL /min，紫外检测器的检测波长为 280 nm，柱温 30 ，进样量 20 L 进行检测。 L-谷氨酰正丙胺 收率 =（ L-谷氨酰正丙胺实际生成量 /L-谷氨酰正丙胺理论生成量 ） 100% 1.4 数据 处理 采用 SPSS11.5 软件 对所得到的数据进行统计学分析，用平均数 标准差 来表示。每组实验重复三次。 2 结果与 讨论 2.1 底物浓度对 L-谷氨酰 正丙胺收率的影响 配制浓度为 0.1 0.8 mol/L的 L-谷氨酰 肼 溶液 ，以及相 对应 浓度 0.75 6 mol/L的 正丙胺溶液为底物，其中 L-谷氨酰肼 和 正丙

15、胺 物质的量比固定为 1:7.5， 谷氨酰转肽酶 细胞 催化剂用量为 0.2 g， 在 pH=10.0、 37 、 170 r/min的恒温 振荡培养箱中反应 6 h， 结果如图 1所示。 由图 1可知 ，随 着底物浓度 升高， L-谷氨酰正丙胺 收率 先 升 后 降 ，当 底物浓度 为 0.4 mol/L时 ，L-谷氨酰正丙 胺 收率 最高 可达 82%。 -谷氨酰转肽酶蛋白质含有两个亚基，小亚基 N-末端苏氨酸残基侧链上的活性氧原子攻击 -谷氨酰类物质羰基上的碳原子，形成 -谷氨酰 -酶中间复合物， L-谷氨酰 肼浓度过高对 -谷氨酰转肽酶有抑制作用。 4 0 .0 0 .1 0 .2 0

16、 .3 0 .4 0 .5 0 .6 0 .7 0 .8 0 .930405060708090收率 (%)底 物浓 度 ( m o l/ L )图 1 底物浓度 对产物 收率的影响 Fig.1 Effects of substrate consentration on the yield of product 2.2 pH 对 L-谷氨酰 正丙胺收率的影响 在 谷氨酰转肽酶 细胞 催化剂用量为 0.2 g， 正丙胺 3 mol/L、 L-谷氨酰 肼 0.4 mol/L、37 、 170 r/min 下于 恒温 振荡培养箱中反应 6 h， 考察 pH 对 L-谷氨酰正丙胺 收率的影响，结果 见

17、图 2。 由图 2 可知 ， L-谷氨酰正丙胺 收率 随 着 底物混合液 pH 的升高先升后降 ，当pH=10.0 时 ， L-谷氨酰正丙胺 收率 最 高，可达 89%。 继续升高 pH， L-谷氨酰正丙胺 收率 明显下降。 pH 可改变 谷氨酰转肽酶活性部位上有关基团的解离状态，从而影响谷氨酰转肽酶与底物的结合，谷氨酰转肽酶酶促反应需要在适宜的 pH 中进行，当反应体系 pH=10.0 时，底物 L-谷氨酰肼与 谷氨酰转肽酶结合位点比较合适。 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13405060708090收率(%)pH图 2 pH对产物 收率 的 影响 Fig. 2 Effects

18、of pH on the yield of product 2.3 温度对 L-谷氨酰 正丙胺收率的影响 5 在 L-谷氨酰 肼 底物浓度 为 0.4 mol/L， 正丙胺 3 mol/L， 谷氨酰转肽酶 细胞 催化剂用量为0.2 g， 最适 pH=10.0， 反应温度 为 15 50 ，以及 转速为 170 r/min 的 条件下于 恒温 振荡 培养反应 6 h,结果见图 3。 由图 3 可知 ， L-谷氨酰正丙胺 收率 随 温度 升高先升后降 ， 当温度为37 ， L-谷氨酰正丙胺 收率 最 高为 88%。 继续升高温度收率 明显 下 降。 该酶 在 温度 较低时酶 活 力 较 小 ，在温

19、度过高时 又会渐渐地 失去 酶 活 ， 而使产物 收率 降低。 10 15 20 25 30 35 40 45 50 5530405060708090?(%)温度 (oC )图 3 温度 对产物 收率 的 影响 Fig.3 Effects of temperature on the yield of product 2.4 催化剂用量对 L-谷氨酰 正丙胺收率的影响 催化剂为 谷氨酰转肽酶 细胞， 在 L-谷氨酰 肼 底物浓度 为 0.4 mol/L， 正丙胺 3 mol/L， 最适 pH=10.0，温度为 37 ， 50 mL 反应体系中 添加 0.05 0.5 g 催化剂， 转速为 170

20、 r/min 的条 件下于 恒温 振荡 培养反应 6 h,结果见图 4。 由图 4 可知 ， L-谷氨酰正丙胺 收率 随催化剂添加量上升不断增大 ， 当催化剂添加量为 0.2 g 时， L-谷氨酰正丙胺 收率 最 高为 84%。 添加过多催化剂可能使酶之间有抑制作用的影响，酶活力稍有下降，收率略降。 0 .0 0 .1 0 .2 0 .3 0 .4 0 .52030405060708090收率(%)催化剂用量 ( g)6 图 4 催化剂用量 对产物 收率 的 影响 Fig.4 Effects of catalyst dosage on the yield of product 2.5 底物物质

21、的量比 对 L-谷氨酰 正丙胺收率的影响 在反应 pH=10.0 时，温度为 37 ，催化剂添加量 为 0.2 g，底物 L-谷氨酰肼 和 正丙胺 物质的量比为 1:（ 510） ， 转速为 170 r/min 的条 件下于 恒温 振荡 培养反应 6 h,结果见图 5。由图 5 可知 ， L-谷氨酰正丙胺 收率 随 底物物质的量比 升高也不断增大 ， 当 L-谷氨酰肼 和 正丙胺 物质的量比为 1:7.5 时， L-谷氨酰正丙胺 收率 最 高为 86%。 5:1 5.5:1 6:1 6.5:1 7:1 7.5:1 8:1 8.5:1 9:1 9.5:1 10:1 -20304050607080

22、90产率（%）正丙 胺 与L-谷氨 酰肼物质量比图 5 底物物质的量比 对产物 收率 的 影响 Fig. 5 Effects of the molar ratio of substrates on the yield of product 2.6 产物的表征 在 pH=10.0、 底物 L-谷氨酰肼 浓度 为 0.4 mol/L、 正丙胺 浓度 为 3 mol/L、 温度 为 37 ，反应总体积为 300 mL 的最优条件下， 恒温 振荡 培养 6 h 制备 L-谷氨酰正丙胺 ， 收率 达到97.9%，产物 纯度为 99.8%， 熔点 222 225 （分解温度）。 1HNMR (500MHz

23、, D2O),:4.05(t,J= 6.1 Hz, 1H), 3.14(t,J= 6.9 Hz, 2H), 2.502.45 (m, 2H), 2.23 2.18(m, 2H), 1.53 1.48 (m, 2H), 0.88(t, J = 7.3 Hz, 3H)；13CNMR(500 MHz, D2O ),:174.81（ C1） , 172.73 (C5), 53.33 (C2), 42.12 (C6), 32.14 (C4), 26.72 (C3), 22.49 (C7), 11.38 (C8)。 L-谷氨酰正丙胺 的红外光谱如图 6 所示 ， -氨基的特征吸收峰在 2972.5 cm-

24、1， -羧基上端羟基和羰基的特征吸收峰在 3289.6 和 1580.9 cm-1 处。 L-谷氨酰正丙胺高效液相色谱图如图 7 所示 ， L-谷氨酰正丙 胺纯度为 99.8%， L-谷氨酰正丙胺质谱图如图 8 所示，结果表明产物的分子离子峰在 m/z=189.0(M+H+)处。 7 图 6 L-谷氨酰正丙胺 的红外光谱图 Fig. 6 FT-IR spectrum of propyl-L-glutamine 图 7 L-谷氨酰正丙胺 的液相色谱图 Fig. 7 HPLC of propyl-L-glutamine 图 8 L-谷氨酰正丙胺 的质谱图 Fig. 8 MS of propyl-L

25、-glutamine 8 3 结论 以 L-谷氨酰肼 和 正丙胺为 底物，利用 谷氨酰胺转肽酶细胞 合成 L-谷氨酰正丙胺 ，考察各因素对 产物收率 的影响， 得到 最 优实验条件为： pH=10.0、 底物 L-谷氨酰肼 浓度 为 0.4 mol/L、 正丙胺 浓度 为 3 mol/L、 温度 为 37 ，谷氨酰胺转肽酶细胞 催化剂添加量为 0.2 g，在此条件下 L-谷氨酰正丙胺 收率 达到 97.9%，为 谷氨酰转肽酶酶法 合成 L-谷氨酰正丙胺 工业化生产提供依据 。 参考文献： 1 Peng Qing (彭清 ), Yao Zhong (姚忠 ), Zhou Zhi (周治 ), e

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