1、 I分类号： 单位代码： 密 级： 学 号： 学位论文多肽佐剂对禽流感灭活疫苗的免疫增强作用Immunologic enhancement of polypeptide adjuvant for inactivated avian influenza vaccine inactivated研 究 生： 指 导 教 师 ： 合 作 指 导 教 师： 申 请 学 位 门 类 级 别： 农学硕士 专 业 名 称 ： 预防兽医 研 究 方 向 ： 所 在 学 院 ： 动物医学院 年 月II摘要本研究将 T 细胞多肽添加到禽流感灭活疫苗中以增强其免疫原性，提高禽流感灭活疫苗的免疫保护作用。为了验证 T
2、细胞表位多肽对于禽流感疫苗的这种免疫增强作用，进行了四次动物实验。采用禽流感灭活疫苗和 T 细胞表位多肽一同免疫 SPF 鸡，分别在免疫后第 21 天，28 天，35 天和 42 天采血，测量其抗体效价。实验发现，T 细胞表位多肽可以在禽流感灭活疫苗免疫后 21-28 天内显著提高抗体效价，但在免疫后第 42 天，这种增强作用便观察不到了。实验还测量了被免疫 SPF 鸡单位体重的脾脏和法氏囊的重量，实验组与对照组之间存在显著性差异（p0.05） 。此外，为了探究 T 细胞表位多肽对于禽流感灭活疫苗免疫增强作用的机制，通过定量 PCR 的方法，分析了 T 细胞表位多肽对于细胞因子 IFN- 和
3、IL-4 分泌水平的影响，发现 T 细胞表位多肽在免疫后 21 天可以提高 IFN- 和 IL-4 的分泌水平，其差异可达到显著水平（p0.01） ，同样的，在免疫后第 42 天，IFN- 和 IL-4 的分泌水平恢复至与对照组相同的水平。综上所述，T 细胞表位多肽对于禽流感灭活疫苗具有免疫增强作用。关键词：多肽 佐剂 禽流感 疫苗IIIAbstractIn this study, the T cell peptide was added to the avian influenza inactivated vaccine as adjuvant in order to enhance its
4、 immunogenicity, and enhance the immune protection effect of the avian influenza inactivated vaccine. In order to verify the enhancement of T cell epitope peptide for the avian flu vaccine, four animal experiments were carried out. SPF chickens were immured with inactivated avian influenza vaccine a
5、nd T cell epitope peptide. Blood was drawn at 21days, 28days, 31days and 42days after the immunization respectively to measure the antibody titer. Results show that, 21-28 days after immunization T cell epitope peptide in the avian influenza inactivated vaccine immunity significantly improve antibod
6、y titer, but at 42 days after immunization, this enhancement was not observed. The experiment also measures spleen and bursa of SPF chickens immunized per body weight, there was a significant difference between the experimental group and the control group (p0.05). In addition, in order to study on t
7、he mechanism of this immune enhancement, real-time PCR was performed to study on the influence of T cell epitope peptide on the cytokines IFN- and IL-4 secretion. Results show that the 21 day after immunization can increase the secretion of IFN- and IL-4, the difference is significant (p0.01), and o
8、n the forty-second day after immunization, the secretion level of IFN- and IL-4 recovered to the same level with the control group.In summary, T cell epitope peptide could enhance the immunological function of the avian influenza inactivated vaccine.Key words: peptide adjuvant avian influenza vaccin
9、eIV目录摘要 .IAbstract .II目录 .III缩略词表 .IV第一章 引言 .11.1 禽流感 .11.2 常见的佐剂类型及特点 .11.3 流感病毒的抗原表位研究进展 .51.4 多肽合成方法 .71.5 研究目的与意义 .9第二章 T 细胞表位多肽的合成 .102.1 引言 .102.2 材料 .102.3 方法 .112.4 结果 .13第三章 T 细胞表位多肽对禽流感灭活疫苗的免疫增强作用 .143.1 引言 .143.2 材料 .143.3 方法 .153.4 结果 .193.5 讨论 .30第四章 T 细胞表位多肽对鸡血液中细胞因子分泌情况的影响 .314.1 引言 .
10、314.2 材料 .314.3 方法 .324.4 结果 .344.5 讨论 .36第五章 结论 .37参考文献 .38致谢 .42作者简介 .43V缩略词表缩略词 英文全称 中文全称AIV avian influenza virus 禽流感DNA deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核苷酸cDNA complementary DNA 互补脱氧核糖核酸g gram 克h hour 小时HA hemagglutinin 血凝素HPAI Highly pathogenic avian influenza 高致病性禽流感HPLC High Performance Liquid Chr
11、omatography 高效液相色谱法IFN Interferon 干扰素IL-4 Interleukin 4 白细胞介素 4kg kilogram 千克mg milligram 毫克min minute 分钟ml millilter 毫升NA neuraminidase 神经氨酸酶NS non-structural protein 非结构蛋白PA acidic polymerase protein 聚合酶蛋白 APB1 basic polymerase protein 1 聚合酶蛋白 B1PB2 basic polymerase protein 2 聚合酶蛋白 B2中国农业大学硕士论文 第二
12、章 T 细胞表位多肽的合成1第一章 引言1.1 禽流感目前对禽流感的预防和控制，各个国家采取了不同的措施，多数国家政府禁止或不提倡使用禽流感疫苗。近年来随着分子生物学和免疫学等学科的飞速发展，各种新型疫苗的相继问世，人们不断寻求一种安全高效的新型禽流感疫苗。在我国，目前仍以疫苗免疫作为防控禽流感的主要措施。禽流感疫苗的种类很多，有全病毒灭活疫苗，亚单位疫苗，重组活载体疫苗以及 DNA 疫苗等，其中应用最为广泛的是禽流感全病毒灭活疫苗。灭活苗具有制备工艺简单，免疫效果确实，免疫持续期长等特点，已经被很多国家作为商品化的禽流感疫苗在家禽中使用。 然而，虽然全病毒灭活苗能诱导机体产生有效的免疫应答反
13、应，能够有效控制禽流感的大流行，但灭活苗需要的抗原剂量较大，使用中需要添加佐剂提高抗原的免疫原性和刺激机体的先天免疫系统。通常认为在采用疫苗免疫后，抗体效价达到 6 以上能够对易感动物产生有效保护，因而如提高疫苗的免疫原性，使免疫后抗体效价迅速达到 6 以上，以及如何长时间维持抗体效价的水平在 6 以上，是禽流感疫苗研究的重点。佐剂是指某些抗原有关的物质，单独或同时与抗原使用时能增强机体的免疫应答，并能通过非特异性途径改变或增强机体对抗原物质产生特异性免疫应答的物质。人们通过通过添加佐剂的方法提高禽流感疫苗的免疫原性，并长时间维持一定的抗体水平。此外，目前使用的禽流感灭活疫苗很难激活先天免疫系
14、统和高水平的细胞免疫，添加佐剂也可以刺激机体产生一定的的细胞免疫应答。研究表明，佐剂的使用可以增加抗原的免疫原性，并对有关的流感病毒产生交叉性的保护。 目前，商业化禽流感灭活苗中应用的佐剂主要为矿物油佐剂。国内外文献中提到的流感灭活苗的佐剂主要有铝佐剂，矿物油佐剂，多糖类，皂苷类，细胞因子类（IL-2，IFN- 等） ，CPG 基序，polyI:C，胞壁酰二肽类，咪喹莫特类等。1.2 常见的佐剂类型及特点1.2.1 铝佐剂铝佐剂是目前应用最为广泛的佐剂，其安全性和高效性得到人们的公认，是目前 FDA 最早批准的可以用于人用疫苗的佐剂。1926 年，Glenny 首次提出，他用明矾沉淀白喉类毒素
15、作为抗原免疫豚鼠，取得了较强的免疫效果 1, 2。铝佐剂包括氢氧化铝佐剂和磷酸铝佐剂两种，其中氢氧化铝的使用更为广泛。氢氧化铝佐剂是一种纤维状粒子，大小约 4.5nm2.2nm10nm，等电点为 11.4，这些粒子松散地聚集在一起，以约 110um 大小的形式存在。强氧化铝佐剂的铝羟基可以提供或接受质子，因而具有两性化合物的特性，在不同的 PH 条件下可以很好的吸附抗原。关于铝佐剂的作用机理，目前主流的理论是氢氧化铝吸附抗原制备的疫苗在注射部位具有缓慢释放的功能，因而对抗原的吸附力大小是衡量佐剂效果的一项重要指标。此外，Rimaniol 提出氢氧化铝佐剂能够刺激巨噬细胞分化成一种特殊的抗原呈递
16、细胞，有别于树突状细胞 3。Li 等研究发现，铝可以激活与细胞内源性免疫应答相关的 Nalp3 炎性复合体，促进巨噬细胞分泌促炎因子 IL-1 和 IL-184。Eisenbarth 等则通过进一步的研究发现，氢氧化铝佐剂还可以激活 Th2 细胞分泌 IL-4，诱导 MHC-类分子和 CD83,CD86 等的表达，诱导 Th2 型体液免疫应答 5。中国农业大学硕士论文 第二章 T 细胞表位多肽的合成2然而铝佐剂不适用于核酸疫苗等新型疫苗，无法冻干，不利于贮存和运输，质量不稳定，难以控制，且无法对其效果作出准确的评价。此外，由于铝佐剂诱导产生 Th2 型体液免疫应答，促进抗体的分泌，无法诱导产生
17、有效的细胞免疫应答。而诱导产生的高水平 IgE，又增加了发生型超敏反应的危险。Frey 等将 Al2O3 制备成吸附能力更强的纳米颗粒，再将 HIV-lgp120 的 C4 区首尾连接成多肽共聚物作为抗原，共价偶联于纳米 Al2O3 上以提高其免疫原性，结果发现可以诱导产生更高的抗体滴度 6。此类将铝佐剂制备成纳米颗粒的研究很多，大都证明采用纳米铝佐剂，可以减少佐剂用量，减轻不良反应，提高免疫效果。Kreuter 等通过研究发现，将蛋白抗原与纳米粒子偶联后，纳米粒子能使蛋白抗原的表面充分暴露，同时可以稳定抗原结构，促进淋巴结对抗原的摄取，在兔体内引起强烈的特异性免疫应答。除铝佐剂外，常见的矿物
18、质佐剂还有磷酸钙佐剂、硒佐剂和氢氧化铁凝胶佐剂等 7。1.2.2 油乳佐剂油乳佐剂来源广泛，成本适中，也是目前使用较为广泛的佐剂之一。早期的油佐剂，粘稠且稳定性差，毒副作用严重，一般只用于实验研究，难以用于制备疫苗 8。后来人们发现可以通过乳化，降低油乳佐剂中油的成分，现在油乳佐剂中油的含量已经只有 5%左右。此外人们还发现，使用一些可以代谢的油类，如花生油、角鲨烯等，来取代矿物油，可以制备更加安全、稳定、有效的油乳佐剂 9, 10。最常见的油乳佐剂是弗氏佐剂，分为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂。弗氏不完全佐剂是由引力和粘度较低的矿物油（白油）及乳化剂混合制成的贮藏性佐剂。弗氏完全佐剂则是在弗氏
19、不完全佐剂的基础上添加分枝杆菌。由于分枝杆菌来源有限，且存在较强的副作用，所以工业化的疫苗生产中一般较少使用。目前我国弗氏不完全佐剂主要是使用矿物油（白油）和乳化剂配制而成。白油，别名液体石蜡，是将石油原油经过特殊的深度精制以后的矿物油。通常我们按照白油在 40的运动粘度来划分白油的牌号，表一为常见的白油型号。表 1-1 常见白油型号项目 5# 7# 10# 15#运动粘度（40）m 2/s 46 6.17.5 911 13.516.5闪点（开口） ，不低于 130 135 140 160倾点，不高于 -5 -5 -5 -10颜色，不低于赛氏号 +30 +30 +30 +30腐蚀试验（级）10
20、0 3h 1 1 1 1外观 水白色 水白色 水白色 水白色油乳佐剂可以提高免疫后抗体的滴度并且延长其保护期。J. Aucouturier 对其作用机制进行了相关的研究，并提出以下几种解释：第一，油乳佐剂可以将特异性抗原包裹起来，避免其被体液中的各种酶分解，降低抗原分解的速度同时延缓抗原释放，刺激机体产生连续的特异性免疫应答。第二，油乳佐剂本身可以刺激局部产生炎症反应，刺激炎性细胞增殖，从而增强机体的体液免疫和细胞免疫应答。第三，油乳佐剂可以将注射部位的特异性抗原经淋巴系统转运至全身的淋巴结和脾脏，从而增加机体的免疫应答 11。油乳佐剂的活性受其黏度、乳状液类型、乳化剂稳定性等的影响。油乳佐剂
21、的黏度太大会影响乳滴的表面活性剂的结构，造成佐剂活性降低。水包油（O/W）型乳状液安全性较高，但扩散快，使得佐剂活性较低；油包水（W/O）型乳状液能在注射部位贮存时间较长，能给抗原提供短期及长期的免疫增强作用，中国农业大学硕士论文 第二章 T 细胞表位多肽的合成3佐剂活性很高；双相型（W/O/W）乳状液的作用时间和活性都介于两者之间，但稳定性较差，容易转化为W/O 型。油乳佐剂最大的缺陷就是副反应严重，皮下注射极易导致肌肉肿胀，影响动物的的采食饮水，黏度较大的油乳佐剂还会导致局部组织坏死，瘤样增生，关节炎等不良反应。这些不良反应都会导致被免疫动物应激，免疫力降低，影响免疫效果。由于矿物油在体内
22、不能被代谢，在机体内可能诱发自身免疫，容易引起自身组织损伤或内脏病变等病症 12, 13。鉴于矿物油的毒副作用较大，人们尝试用一些非矿物油，如花生油、角鲨烷、角鲨烯等可代谢物质来代替矿物油。目前，常见的矿物油佐剂除弗氏佐剂外还有摆有白油司本佐剂，ISA206 等。非矿物油佐剂有 MF-59，SAF 系列等。1.2.3 细胞因子类佐剂细胞因子类佐剂是一种尚处于实验研究阶段的佐剂，免疫系统受到抗原刺激以后，会分泌一类具有免疫调节作用的小分子蛋白质，称为细胞因子，这类小分子蛋白质已经被证实具有良好的免疫佐剂性能。相较于其他免疫佐剂，细胞因子类的免疫佐剂的优势是安全性高，用量低，能确实有效地增强机体的
23、特异性免疫应答。Starach 和 wood 发现，用牛血清蛋白免疫小鼠后追加 IL-1，在第二次免疫时抗体水平可提高五十多倍14。此后，关于细胞因子类佐剂的研究越来越多 15-17。细胞因子类佐剂主要有白细胞介素，干扰素，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF） 。其中，白细胞介素类细胞因子作为免疫佐剂能增强 Th1 型细胞免疫应答，IL-4 和 IL-10 能增强 Th2 型细胞免疫应答。IL-2 可以同时增强机体的细胞免疫应答和体液免疫应答，应用较为广泛 18；干扰素在兽医临床上应用也较为广泛，IFN- 能促进抗原提呈细胞表面 MHC 类分子的表达，诱导 T 细胞分化为 Th1 细胞
24、，增加 CTL 免疫应答反应，提高 IgG 抗体水平；集落刺激因子类佐剂可以促进抗原递呈细胞的分化和成熟，促进膜表面MHC类分子和 B7 共刺激因子的表达，促进抗原递呈，从而加强免疫应答 19, 20。细胞因子类佐剂在使用时可以使用其蛋白直接注射，也可以用人工构建的表达该细胞因子的重组质粒进行免疫。目前，将细胞因子类佐剂配合核酸疫苗进行免疫的研究较多，很多研究显示细胞因子类佐剂可以有效地解决核酸疫苗免疫原性差的问题。1.2.4. 天然来源佐剂天然来源佐剂主要是多糖和皂苷，即利用一些从植物中药或真菌中提取的具有生物活性的多糖和皂苷佐剂制备的佐剂。多糖作为佐剂的特点是天然、低毒、可代谢，安全性高。
25、常见的植物多糖佐剂有黄氏多糖，当归多糖、板蓝根多糖、茯苓多糖、枸杞多糖、板蓝根多糖、香菇多糖和淫羊藿多糖等。此外还有一些从细菌真菌中提取的多糖，如细菌脂多糖，酵母多糖，马尾藻多糖等 21。同时，有一些研究尝试对多糖进行硫酸化修饰以提高其活性，如硫酸化黄氏多糖，硫酸化香菇多糖等 22。多糖类佐剂具体的作用机制尚未明确，可以肯定得是多糖可以对机体的免疫系统发挥多种调节作用，激活巨噬细胞、自然杀伤细胞，促进 T 细胞和 B 细胞的分化，活化补体，促进 IL-2、IL-6 等细胞因子的生成 23, 24。也有研究表明，多糖佐剂的免疫增强作用与机体的神经内分泌系统有关 25。淫羊藿多糖可以促进老年大鼠下
26、丘脑和皮质 -内啡肽的分泌，并显著提高 NK 细胞活性 26。中国农业大学硕士论文 第二章 T 细胞表位多肽的合成4革兰氏阴性菌的细胞壁内含有的脂多糖，同样具有免疫调节作用，可以促进 IL-1 等细胞因子的分泌，增强吞噬细胞的抗原递呈能力，对于细胞免疫应答和体液免疫应答均有增强作用。皂苷是一类由 30 个碳原子组成的三萜化合物，可以游离存在或者与糖结合成苷。三萜类化合物具有广泛的生物学活性，抗炎，抗菌，抗病毒。植物中药中含有的皂苷普遍具有免疫调节与促进作用，可以制备成佐剂使用。Quil-A 是从南美皂树树皮中提取的天然植物皂苷，可以引起强烈的免疫应答，被当做铝佐剂的替代物，但其毒副作用较强，可
27、引起肉芽肿，溶血等不良反应。QS-21 是从 Quil-A 中提取的复合糖脂，毒性相对较低，能诱导由 CD4+Th1 细胞和细 CD8+胞毒性 T 细胞介导的细胞免疫应答 27。其他植物中药皂苷，如人参皂苷 Rh2，可以促进白蛋白、 球蛋白的合成，抑制肿瘤细胞增殖，增强T 淋巴细胞和巨噬细胞活性 28。此外，天然来源佐剂还有 -半乳糖神经酰胺，蜂胶等。-半乳糖神经酰胺提取自海洋海绵体，可以稳定 NK 细胞，进而促进各种细胞因子的分泌 29。蜂胶可以激活红细胞膜上的 Cab 受体，增强红细胞的免疫功能，激活与保护中枢免疫器官，刺激多种细胞因子的分泌 30。以蜂胶作为的佐剂的禽霍乱疫苗已经在国内开
28、始广泛推广。1.2.5 其他类型佐剂除上述几类佐剂以外，目前国内外文献中提到的佐剂种类还有很多，这些佐剂通过促进细胞因子的分泌，或者增加抗原递呈过程，激活淋巴细胞等方式增强机体的特异性免疫应答，这里重点介绍以下几种佐剂。脂质体佐剂，由脂质双分子层组成的，内部为水相的闭合囊泡颗粒，可分为单层脂质体，多层脂质体和多囊脂脂质体。1974 年，Allison 发现在用白喉类毒素进行免疫时，将脂质体作为佐剂可以显著增强免疫应答，首次证明了脂质体具有免疫佐剂效应 31。脂质体可以将抗原包裹起来，引导抗原进入细胞内，沉积于肝、脾、淋巴结等处。从而延长了抗原在体内的停留时间。目前，用作疫苗佐剂的脂质体主要由磷
29、脂，胆固醇和类脂 A 组成。Mann 等发现，颗粒直径较大的脂质体颗粒容易被树突状细胞摄取，可刺激机体产生高水平的 IFN- 和 IgG，增强由 Th1 细胞介导的细胞免疫应答。而直径较小的脂质体颗粒则向淋巴转运，诱导产生较强的 CD8+T 细胞免疫应答和 Th2 细胞免疫应答，增强体液免疫应答，产生高水平的抗体 32。此外，阳离子脂质体本身具有佐剂效应，可以促进树突状细胞等抗原递呈细胞的成熟，增强其抗原递呈能力，诱导一些炎性因子的释放，从而增强细胞免疫应答。惰性纳米球，即直径为小于 1um 的惰性固体纳米球，可以吸附抗原，增强抗原递呈细胞递呈抗原的能力，诱导产生 CD8+T 细胞免疫应答。纳
30、米球颗粒还可以提高 IFN- 的分泌水平，从而增强体液免疫应答的细胞免疫应答 33。核酸佐剂，最为典型的是 CpG 佐剂和 PolyI:C 佐剂，CpG 佐剂是含有未甲基化的 CpG 基序的寡聚核苷酸，经内吞作用进入细胞后与 TLR9 相互作用，激活多种免疫细胞，诱导产生多种细胞因子和强烈的Th1 型免疫应答，增强 CD8+T 细胞免疫应答 34。Poly:C 是人工合成的双股 RNA 类似物，通过模拟病毒感染诱导机体产生免疫应答。Poly:C 是 TLR 的配体，特异性结合后可激活黏膜免疫反应，诱导机体产生细胞免疫应答 35。多肽佐剂，常见得有胞壁酰二肽、三肽囊素、胸腺肽等。胞壁酰二肽类佐剂
31、是指胞壁酰二肽（MDP）及其衍生物 36。胞壁酰二肽是分枝杆菌细胞壁的组成成分。作为佐剂，胞壁酰二肽可以增强机体的特异性免疫应答反应，还能增强健康的或者免疫缺陷的动物对于肺炎杆菌，大肠杆菌等多种病原的非特异性免疫中国农业大学硕士论文 第二章 T 细胞表位多肽的合成5反应。三肽囊素是从鸡法氏囊中分离出的一种三肽，其氨基酸序列为 Lys-His-Gly，是目前从法氏囊中分离出的唯一具有生物活性的分子 37，对禽类具有免疫调节作用，可以促进免疫器官的发育和 B 淋巴细胞的分化 38。此外，还有一些人工合成的小分子药物，如咪喹莫特类药物，也具有免疫调节作用。咪喹莫特及其类似物可以提高 IL-6，IFN
32、-， TNF- 等细胞因子的分泌水平，增加 B 淋巴细胞的抗原特异性反应 39。1.3 流感病毒的抗原表位研究进展1.3.1 流感病毒的结构A 型流感病毒属于正黏病毒科，正黏病毒属，单股 RNA 病毒。病毒粒子一般为球形，表面有血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）两种纤突，HA 和 NA 是禽流感病毒表面的主要糖蛋白，在病毒感染过程中起着重要作用，具有亚型的特异性和多变性。流感病毒极易发生突变，其中编码 HA 和 NA 的基因突变率最高，而且不同的 HA 和 NA 之间可发生组合，构成各种亚型。根据 HA 和 NA 抗原结构的差异，目前已经确定了 16 个 HA 亚型和 9 个 NA 亚型。流感
33、病毒的 RNA 共编码十种蛋白，除了位于病毒粒子表面的 HA 蛋白和 NA 蛋白以外，还有三个聚合酶蛋白，PA 、PB1 和 PB2；两个非结构蛋白，NS1 和 NS；两个基质蛋白，M1 和 M2；一个核蛋白，NP40。相对于位于病毒粒子表面的 HA 蛋白和 NA 蛋白，这八种蛋白比较保守。免疫表位数据库中记录的各类宿主的流感病毒抗原表位共 3807 个，其中 HA 蛋白上有 1525 个，NA 蛋白上有 309 个，位于 NP 蛋白上的有 501 个，位于 M1 蛋白上的有 275 个，位于 M2 蛋白上的 97 个，位于 NS1 蛋白上的有 109 个，其他的则位于与病毒 RNA 复制相关
34、的各类聚合酶复合体上。1.3.2 抗原表位的筛选方法抗原表位，又称抗原决定簇，决定了病原的特异性。病毒等病原进入机体后，经过抗原递呈细胞递呈处理以后，抗原表位会被递呈到细胞表面，并与 MHC 分子结合，结合后的抗原表位可以被机体的 T 细胞识别，诱导产生 T 细胞免疫应答。B 细胞对抗原的识别不收 MHC 分子的限制，可以直接识别经过免疫细胞处理的抗原表位，激发体液免疫应答。对于流感病毒入侵机体后引起的免疫反应，除了可以一直流感病毒侵入细胞的中和抗体以外，越来越多的研究发先，CD4+T 细胞免疫应答对于机体感染流感病毒后的恢复尤为重要。CD4+T 细胞除了能辅助体液免疫应答以外，也能促进 CD
35、8+T 细胞介导的细胞杀伤作用。因此，关于 CD4+T 细胞表位的研究越来越多。此外，有研究发现有些 CD8+T 细胞表位同样可以引起机体产生CD4+T 细胞免疫反应，即 CD4+T 细胞抗原表位和 CD8+T 细胞存在的同源性 41。目前，对于 B 细胞表位的筛选主要是利用包含病毒蛋白全序列的多肽库免疫动物，制备单克隆抗体后，采用 ELISA 等方法，判断得到的单克隆抗体是否能和全病毒抗原反应，或是进行动物保护试验判断利用多肽进行免疫产生的抗体在攻毒后能否给与被免疫动物有效的保护。对于 T 细胞表位的筛选，则主要是通过免疫接种或细胞培养的方式获得特异性的 T 淋巴细胞系，之后用多肽库刺激 T 淋巴细胞，采用 Elipot 或是细胞内因子染色等方法，通过 IFN- 的细胞因子的水平来判断该肽段是否存在 T 细胞抗原表位。此外，对于初步确定的抗原表位，进行免疫信息学的
